保健食品功能检验与评价方法（2023年版）有助于改善缺铁性贫血.docx

保健食品功能检验与评价方法（2023年版）改善缺铁性贫血I .1试验项目II .1动物实验1.1.1.1 体重1.1.1.2 血红蛋白1.1.13 红细胞压积/红细胞内游离原吓咻1.1.14 体试食试验1.1.14.1 血红蛋白1.1.14.2 清铁蛋白1.1.14.3 细胞内游离原吓咻/血清运铁蛋白饱和度1.2 试验原则1.2.1 2.1动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。1.2.2 针对儿童的人体试食试验，只测血红蛋白和红细胞内游离原吓咻。1.2.3 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。1.3 结果判定1.3.1 动物实验：血红蛋白指标阳性，红细胞内游离原叶咻/红细胞压积二项指标一项指标阳性，可判定该受试样品改善缺铁性贫血动物实验结果为阳性。1.3.2 人体试食试验.1针对改善儿童缺铁性贫血功能的，血红蛋白和红细胞内游离原吓咻二项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血作用。1.3.2.2针对改善成人缺铁性贫血功能的，血红蛋白指标阳性，血清铁蛋白、红细胞内游离原叶咻/血清运铁蛋白饱和度二项指标一项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血作用。改善缺铁性贫血检验方法1动物实验1.1 原理用低铁饲料喂饲动物可形成实验性缺铁性贫血模型，再给予受试样品，观察其对血液细胞学、血液生化学等指标的影响，可判定该受试样品对改善动物缺铁性贫血的作用。1.2 实验动物健康初断乳大鼠，单一性别，每组大鼠8-12只。1.3 低铁饲料配方：成分添加量g玉米淀粉529.5蛋清蛋白东200.0蔗糖100.0玉米油(无添加剂)70.0纤维素50.0混合矿物盐(AIN-93G-MX)35.0混合维生素(AlN-93G-VX)10.0L-胱氨酸3.0氯化胆碱2.5*亦可使用EDTA处理的酪蛋白AIN-93G混合矿物盐配方矿物质添加量gormg/kgmixCalciumcarbonateanhydrous357.00Potassiumphosphatemonobasic196.00Potassiumcitrate,tripotassiummonohydratc70.78Sodiumchloride74.00Potassiumsulfate46.60Magnesiumoxide24.00Zinccarbonate1.65Sodiummeta-siIicater9H2O1.45Manganouscarbonate0.63Cupriccarbonate0.30Chromiumpotassiumsulfatcri2H2O0.275Boricacid(17.5%B).mg81.50Sodiumfluoride(45.24%F),mg63.50Nickelcarbonate(45%Ni),mg31.801.ithiumchloride(1638%Li),mg17.40Sodiumselenateanhydrous(41.79%Se),mg10.25AIN-93G混合维生素配方维生素添加量g/kgmixNicotinicacid3.000Capantothenate1.600Pyridoxine-HCl0.700Thiamin-HCl0.600Riboflavin0.600Folicacid0.200Biotin0.020VitaminB-12(cyanocobalamin)(0.1%inmannitol)2.500VitaminE(all-rac-a-tocophcrylacctatc)2(500IUg)15.000VitaminA(all-trans-retinylpalmilate)2(500,000IUg)0.800VitaminD-3(cholecalciferol)(400,000IUg)0.250VitaminK-I(phylloquinone)0.075Powderedsucrose974.6551.4 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个低铁对照组，以人体推荐量的5倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组（硫酸亚铁或乳亚铁，ppm»Jc2mg<gBW,以Fe元素计）受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。1.5 实验步骤1.5.1 建立缺铁性贫血大鼠模型选用健康断乳大鼠在实验环境下适应35天后饲予低铁饲料及去离子水（或双蒸水）采用不锈钢笼及食罐，同时，采用剪尾取血法放血，5天一次，每次0.30.5ml。实验过程中避免铁污染。自第3周开始每周选取部分大鼠采尾血测Hb,如多数动物Hb低于Ioog/L时，测定全部大鼠的体重及Hb01.5.2 恢复实验选取HbVlOOg/L的大鼠作为实验动物，根据贫血大鼠Hb水平和体重将其随机分为低铁对照组和三个实验组，各组均继续饲予低铁饲料，低铁对照组给予相应溶剂，实验组分别给予不同剂量的受试样品，受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，测定体重及各项血液学指标。1.6 观察指标体重、血红蛋白、红细胞压积/红细胞内游离原口卜咻。1.6.1 血红蛋白测定（IK化高铁法）消光系数法和标准曲线法任选其测定血红蛋白。在满足实验方案和仪器要求的前提下，也可采用血液分析仪测定。1.6.1.1 吸光系数法1.6.1.1.1 原理血红蛋白(haemoglobin,Hb)被铁新化钾氧化后生成高铁血红蛋白，再与就离子结合形成凯化高铁血红蛋白(红色)鼠化高铁血红蛋白(红色)极为稳定，在540nm波长下，摩尔吸光系数为44000,据此，用分光光度法测其光密度，运用吸光系数作血红蛋白的定量测定。1.6.1.1.2 仪器分光光度计。10微升微量吸管。1.6.1.1.3 试剂称取碳酸氢钠(NaHCo3,AR)140ng铁银化钾200mg、氟化钾50mg,用水溶解并稀释到IOoOmL。贮存于棕色试剂瓶内，在暗处或冰箱(4C)保存，至少可稳定数月到1年。1.6.1.1.4 实验步骤1.6.1.1.4.1 取试剂2.5mL于5mL带盖试管中，加入10L血液，混匀后，放置15分钟。1.6.1.1.4.2 选用0.5厘米光径比色杯，于54Onm波长下，以试剂调零点，将所得样品管之光密度乘以736,即为血红蛋白浓度(gL),计算公式如下：C=DMWX251×64458=D54oX736t44000×0.5HiCNCt=待测的血红蛋白(gL)浓度。D徐二制化高铁血红蛋白在540nm波长下测出的光密度。251=测定时血液的稀释倍数（血IOL加入试剂2.5mL中）44000=制化高铁血红蛋白的摩尔吸光系数0.5=比色杯的光径64458=血红蛋白的分子量1.6.1.1.5 注意事项1.6.1.1.5.1 试剂不要放在聚乙烯瓶内，以免因鼠离子与其反应而使试剂作用降低。1.6.1.1.5.2 仪器因摩尔吸光系数法完全依靠仪器的吸光度来计算，故此法要求所用的仪器性能要符合要求（如仪器的波长准确与否，以及灵敏度及线性等）否则将直接影响测定的结果。1.6.1.1.53仪器在使用前最好应以WHO规定的氟化高铁血红蛋白参考液校正后再使用。参考液最好选用ICSH（国际血液学标准化委员会）确定的由RIV（荷兰国立公共卫生研究院）制作的制化高铁血红蛋白参考液或上海医学化验所制备的氧化高铁血红蛋白标准液。1.6.1.2 标准曲线法1.6.1.2.1 原理血红蛋白（hemoglobin,Hb）在铁制化钾和凯化钾的作用下生成极为稳定的辄化高铁血红蛋白（红色）其颜色深浅与血红蛋白的含量成正比。用分光光度计在540nm波长下，测定血红蛋白标准品和参考标准物质的吸光度，制成标准曲线，测得待测样品的吸光度后查标准曲线即可得Hb的浓度。1.6.1.2.2 仪器10L血色素吸管（或定量毛细管）5mL或IOmL带盖试管分光光度计1.6.1.2.3 试剂称取碳酸氢钠（NaHCO3,AR）140mg铁辄化钾200mg、和七钾50mg,用蒸储水溶解并稀释到IooOmL,贮存于棕色试剂瓶内，保存于4冰箱可稳定至1年。1.6.1.2.4 实验步骤吸取2.5mL试剂于5mL带盖试管中，用10L血色素吸管（或定量毛细管）取大鼠尾血或静脉血10L放置于已放入试剂的试管中；混匀放置15min0选用0.5Cm光径比色杯，于540nm波长下，以试剂调节仪器零点，测定各样品管的吸光度，同时测定血红蛋白标准和参考标准物质的吸光度，绘制血红蛋白的标准曲线。查标准曲线可求得待测样品和参考标准物质的血红蛋白含量（叽）计算参考物质的回收率。1.6.1.2.5 注意事项1.6.1.2.5.1 不要将试剂放在聚乙烯瓶内，以免因乱离子与其反应而使试剂作用降低。1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系数方法计算血红蛋白的含量，因为仪器的波长准确与否、仪器的灵敏度和线性等因素均直接影响测定结果。1.6.1.2.5.3 每次测定时，在不同间隔反复测定血红蛋白标准液和参考标准物质（低、中、高3个浓度）1.6.1.3 数据处理及结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算尸值，产值VR）.3，结论：各组均数间差异无显著性；尸值2R）05,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。结果判定受试样品组与对照组比较，血红蛋白浓度升高经统计处理差异有显著性，且受试样品组前后升高幅度平均达到IOgZL以上，判定该实验结果阳性。1.6.2红细胞内游离原口卜琳测定1.6.2.1 原理血红蛋白的合成过程中，幼红细胞中的原吓咻在血红素合成酶的作用下与铁结合，当铁供应不足时，红细胞内的原口卜咻乃以游离形式累积起来超过正常水平。因此，检测红细胞内游离原吓咻（FreeerythroCyteproIoporphyrin,FEP）的含量是检查缺铁性红细胞生成的有效方法。血液样品经生理盐水稀释后，分别以乙酸乙酯：乙酸混合液（4:1）和0.5N盐酸提取分离血中游离原口卜咻，在一定波长下测定其原吓咻的荧光强度而定量。1.6.2.2 仪器162.2.1荧光分光光度计或930型荧光光度计。1.6.2.2.2离心机。1.6.2.2.3混旋器。1.6.2.3试剂1.6.2.3.1 肝素抗凝剂一支12500单位的肝素以0.9%生理盐水稀释至25mL（ImL=500单位）1.6.2.3.2 5%（W/V）硅藻土生理盐水悬浊液称取5g硅藻土加0.9%生理盐水至100mL01.6.23.34:1乙酸乙酯和乙酸混合液。1.6.2.3.40.5NHC1-1.6.23.5原口卜咻标准液。1.6.2.3.5.1原吓咻标准贮备液（50mgL）称取5mg原口卜咻,加4mL无水乙醇使之溶解，以1.5NHCI稀释至100mLo1.6.23.5.2原口卜咻标准中间液（LOmgZLJ取2mL原吓咻贮备液，以乙酸乙酯与乙酸（4:1）混合液稀释到IOomL。1.6.235.3原11卜咻标准应用液（0.1mgU取ImL原口卜咻中间液，以乙酸乙酯与乙酸（4:1）混合液稀释到IOmL。1.6.2.4 魁步骤试剂样品管空白管标准管肝素（mL）0.100.100.10全血（mL）0.02水(mL)0.020.025%硅藻土悬浊液（mL）0.150.150.15原吓咻标准应用液（mL）0.5乙酸乙酯与乙酸（4:1）混合液（mL）443.5注：按上表依次加入各种试剂，在加入乙酸乙酯与乙酸混合液前，用混旋器混合已加入的混合液，然后边混合边加入乙酸乙酯与乙酸混合液。离心15分钟，将各管上清液分别倒入IOmL比色管中，每管加4mL0.5N盐酸，振摇5分钟静止使之分层，将上层溶剂抽出弃去，测定盐酸液的荧光强度（30分钟内比色）1.6.2.5 荧光测量1.6.2.5.1 若使用日立MPF-4型荧光分光光度计测定条件为激发波长为403nm,姗Onm：发射波长为605nm,狭缝为5nm,液槽为ICm厚石英槽。1.6.2.5.2 若使用国产930型荧光光度计测试，条件为激发滤光片420,荧光滤片550,灵敏度1X500,满度开关开至最大,液槽为Icm厚石英槽,检出灵敏度为0.01g4mL。在不同量原口卜咻（Og,0.01g,0.03g,0.05g,0.07g,0.1g）呈线性关系。1.6.2.6 计算样品荧光强度-空白荧光强度100血中原叶琳含量（g,L全血）三X标准管原口卜噂含量（g）××10标准管荧光播度-空白荧光强度样品取样量（mL）1.6.2.7 数据处理及结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，产值R）W结论：各组均数间差异无显著性：产值2R）o5,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。结果判定受试样品组与对照组比较，红细胞内游离原11卜咻降低经统计处理差异有显著性，即可判定该实验结果阳性。1.6.2.8 注意事项1.6.2.8.1 荧光强度随时间延长而逐渐衰退，但30分钟内基本稳定。162.8.2加乙酸乙酯-乙酸混合液时，一定要边混合边加入，否则影响测定结果。1.6.2.9滤纸法测定：将滴有20微升血点全部剪下放入试管中，同时取同样大小空白滤纸放入标准管和空白管中，各管均加入5%硅藻土悬浊液0.2亳升，振荡后放置过夜，以下步骤同直接法。计算：FEP（微克/100亳升全血）=CBXA/DXIOoA=标准管原口卜咻含量(0.02毫克)B二标准管荧光强度-空白管荧光强度C=血样荧光强度-空白管荧光强度D=取样量1.6.3红细胞压积测定：使用全自动血细胞分析仪进行。数据处理及结果判定同“162.7”。1.7 数据处理和结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，产值<R)g结论：各组均数间差异无显著性；产值2R)o*P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。结果判定受试样品组与低铁对照组相比，若血红蛋白差异有显著性，且其前后平均升高幅度达到IOgZL以上，同时，受试样品红细胞内游离原吓咻或红细胞压积与低铁对照组相比差异有显著性，可判定该受试样品改善缺铁性贫血动物实验结果阳性。1.8 注意事项本项实验关键在于贫血模型的建立。低铁饲料含铁量最好控制在9mgkg以下，所用试剂应为分析纯，动物饮用水应为去离子水或双蒸水，采用不锈钢笼具，所用器皿应用10%硝酸溶液处理。实验过程中严防外来铁的污染及彼此交叉污染。2人体试食试验2.1 受试者纳入标准受试者为小细胞低色素贫血，且有明确的缺铁原因和临床表现的成人和儿童。2.1.1 成人纳入标准：男性Hb80gL-130gL,女性Hb80gL-120gL(>2.1.2 儿童纳入标准：6岁儿童Hb70gL-110gL;7-18岁青少年80gL-120gL.2.2 受试者排除标准2.2.1 合并有心、脑血管、肝、肾、消化道等严重疾病及精神病患者。2.2.2 过敏体质或对该受试样品过敏者。2.2.3 严重贫血患者。2.2.4 短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。2.2.5 未按标准服用受试样品、资料不全影响功效或安全性判断者。2.3 试验设计及分组要求采用自身和组间两种对照设计。按受试者的血红蛋白水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如性别、年龄、经济状况等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者不少于50例。2.4 受试样品的剂量和使用方法试食组按推荐服用方法、服用量服用受试产品，对照组可服用安慰剂或采用空白对照，也可服用具有同样作用的阳性物。受试样品给予时间30天，必要时可延长至120天。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。2.5 观察指标2.5.1 安全性指标2.5.1.1 一般状况（包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等）2.5.1.2 血、尿、便常规检查2.5.1.3 肝、肾功能检查（儿童受试者不测定此项）2.5.1.4 腹部B超、胸片、心电图检查（各项指标在试验前检查一次，儿童受试者不测此项）2.5.2 膳食调查于试验开始前、结束前进行三天的询问法膳食调查，观察饮食因素对试验结果的影响。2.5.3 症状观察食欲不振、乏力、烦躁、头晕、眼花、精神不集中、心慌、气短等。2.5.4 功效性指标儿童观察指标：血红蛋白、红细胞内游离原吓咻成人观察指标：血红蛋白、血清铁蛋白、血清运铁蛋白饱和度/红细胞内游离原吓咻2.5.4.1 血红蛋白测定：见1.6.1。2.5.4.2 血清铁蛋白测定（放射免疫法J2.5.4.2.1 原理人血清中的铁蛋白（SF）与加入的I标记的SF竞争性地与抗铁蛋白抗体结合。用第二抗体分离结合部分，分别测定总放射性与沉淀物放射性计数。依据标准SF试剂作出标准曲线，从而可在曲线上查出相应样品血清的SF浓度。*SF+Ab->*SF-Ab+*SF+SFtISF-Ab+SF*SF：标记的铁蛋白SF：未标记的铁蛋白Ab：抗铁蛋白抗体2.5.422仪器离心机、Y-射线计数仪。2.5.4.23试剂25I血清铁蛋白放射免疫分析试剂盒.02.5.424操作步骤2.5.4.2.4.1操作步骤：铁蛋白测定操作程序和试剂用量（mL）（见下表）2.5.424.2 绘制标准曲线以各标准管的B/Bo%作纵坐标，标准铁蛋白浓度为横坐标（对数边）作标准曲线。样品或质控由B/Bfl%值从曲线上查到相应的含量。组别标准曲线组待名称(T)(NBS)(B0)零(B)测总计数值非特异管标准管标准管管温育液0.20.1铁蛋白标准0.1待测血样或质控0.1铁蛋白抗体0.10.10.1叼一铁蛋白0.10.10.10.10.1充分摇匀,37C,温育1.0小时分离试剂0.50.50.50.5充分摇匀，室温15分钟3500转/分，离心15分钟，弃上清液，测沉淀计数2.5.424.3 结果计算三献结合率：NBS(CPm)一本底(cpm)NBS(%)=T(cm)本底(cpm)×l%结合率：BO(cpm)-NBS(CPm)B()/T(%)=T(CPm)本底(cpm)×l%械管(样品、质控)结合率：B(cpm)-NBS(CPm)B/B。(%)=B0(cpm)-NBS(CPm)×100%2.5.424.4 注意事项本实验为抗原抗体结合反应，操作时要注意防止可引起抗原、抗体失活的因素(如高温、冰冻等)测定时，蛾止液体岫，以第奇洞位粉藻使雌增氤离心后，抽去上清液时勿将平铺在管底的免疫复合物吸起，否则测定结果不准确。非特异管、零管是为鉴定试剂是否符合规定而设立的。血清铁蛋白浓度也可用酶联免疫吸附法测定。具体测定方法按相应试剂盒说明书进行。2.5.43血清运铁蛋白饱和度测定2.5.4.3.1原理血清中加入过量的铁，使血清中的运铁蛋白全部与铁结合，达到饱和，过剩的铁用碳酸镁吸附除去，然后按测血清铁的方法，测定总结合的铁量，即为总铁结和力。从中可计算出未饱和铁量及血清运铁蛋白饱和度。254.3.2血清铁测定血清铁(SI)是指存在于血清中与血清运铁蛋白结合的铁，它以高铁的形式附着在血清Pl球蛋白的转递蛋白上，成人正常值为50-184g100mL0缺铁性贫血时常低于50g100mL,当血红蛋白浓度降低不明显时，血清铁已减少，被认为是早期缺铁性贫血诊断依据之一。2.5.4.3.2.1格天青B彼盐比色法格天青B铁盐作为显色剂测血清铁，比过去多采用的联毗咤等作为显色剂有较高的灵敏度，其克分子吸光系数在630nm波长下为1.68×IO5Lmo,cm,<,可大大减少样品血清量,方法简便,准确。2.5.4.3.2.1.1原理Fe3ZFe2与络天青B(CAB)和十六烷基三甲基溟化钺(CTMA)反应，形成三元胶囊状络合物使试剂颜色加深，其颜色加深程度与血清铁含量成正比，在PH为4.65.5,波长为630nm时，有最大吸收峰，利用柠檬酸为铁的掩蔽剂，样品为自身空白，不需除蛋白，即可测出血清铁的含量。2.5.43.2.1.2试齐IJ2.5.4.3.2.1.2.1 缓冲溶液pH4.75,取25g无水醋酸钠，11Og氯化钠，8mL冰醋酸，用蒸镭水定容至IOoOmL用酸度计测PH应为4.75o2.5.4.3.2.1.2.2 显色剂2.5.43.2.1.2.2.10.1%络天青B钱盐溶液（A液J取0.1g络天青B钱盐，定容于100mL蒸镭水中，放在棕色瓶中可在室温下保存I个月。2.5.4.3.2.1.2.2.20.3%十六烷基三甲基溟化铁（B液取十六烷基三甲基溟化钱0.3g,用蒸储水定容至100mL。2.5.4.3.2.1.223显色剂应用液：取90mLB液，60mLA液，小心混匀，用缓冲溶液定容至100OmL,放在棕色瓶内可保存1个月。2.5,4.3.2.1,2.3掩蔽剂：称17.0g柠檬酸（C6H8O7H2O）35.0g柠檬酸钠（Na3C6H5O7H2O）约力口50mL蒸储水加热助溶，冷却后定容至100mL02.5.43.2.1.2.4铁标准液2.5.4.3.2.1.2.4.1 贮备液：3mmolL,取1.176g硫酸亚铁铉（6分子结晶水）至少量蒸馈水中，加50mL浓硝酸混匀反应10分钟，用蒸僧水定容至100OmJ2.5.4.3.2.1.2.4.2 工作液：30molL,取IOmL贮备液，用蒸储水定容至100OmL2.5.4.3.2.1.3 方法按下表加入各种试剂。样品管标准管空白1空白2空白3血清（mL）0.10.1Fe标(30molL)0.1蒸镭水（mL）0.10.1显色剂应用液（mL）3.03.03.03.03.0隐蔽剂（mL）0.10.1混匀，放置20分钟，在721型分光光度计上，波长630nm,以空白管调零点记录光密度。注：样品管和标准管以空白1调O点；空白管2以空白3调O点。2.5.4.3.2.1.4 计算样品管光密度一空白2管光密度血清铁浓度（molL）=×30标准管光密度样品管光密度一空白2管光密度或血清铁浓度（IJg/00mL）=×167.55标准管光密度2.5.4.3.2.1.5 注意事项1.1.1.1.1.1.1.1 求所用器皿用2N盐酸浸泡过夜，试褥!渡为分析纯以上，所用蒸储水为双蒸水或去离子水。1.1.1.1.1.1.1.2 缓冲液PH对结果影响较大，测定时PH应保证在4.70-4.80之间。1.1.1.1.1.1.1.3 严格限制波长的选择（需经校下）血清样品在607609nm之间有一个杂质吸收峰。原子吸收光谱法用原子吸收光谱法测定生物样品中微量元素的含量具有操作简便、快速、灵敏度较高的优点，故被广泛应用。2.5.4.3.2.2.1试齐IJ2.5.43.2.2.1.1混合酸消化液：4份硝酸，1份高氯酸混合即成。2.5.4.3.2.2.1.2铁标准溶液2.5.43.2.2.1.2.1 铁标贮备液：取LOOOOg纯金属铁，用盐酸或硝酸溶解后，用0.1N盐酸稀释到1000mL,移入聚乙烯塑料瓶内，存放在4C冰箱，ImL含Img铁。2.5.43.2.2.1.2.2 铁标工作液：取IomL贮备液，用0.1N盐酸定容至K）OmL,ImL=100pg铁。2.5.43.2.2.1.2.3 操作254.3.2.2.2.1样品收集及处理取静脉血2mL于盛有IOmg草酸钾的5mL试管中（于每试管中加入0.2mL5%草酸钾，置烘箱中烤干即成）离心（3000转/分）15分钟。将分离出的血浆吸入另一带盖小试管中，备用。254.3.2.2.2.2消化取LOmL血浆，于IoomL高型烧杯中，约加3mL混合酸消化液，上盖表皿，放置数小时或过夜，在沙浴电热板上徐徐加热煮沸，在冒白色浓烟激烈作用后溶液呈无色或淡黄色。反应终了，取下烧杯（若酸用量不够，最后可出现溶液变黑现象，此时可再加2mL混合酸消化液继续消化直至五色）冷却后用102OmL去离子水冲洗表皿和杯壁，除去表皿继续加热，直到再度冒白色浓烟，待溶液体积接近蒸干，残留酸量不超过ImL,取下冷却，用蒸饱水稀释至3mL。2.5.43.2.2.2.3测定吸取0.0mL,0.5mL,1.0mL,2.0mL,3.0mL,5.0mL铁标准应用液，用0.1N盐酸定容至100mL,混合，各容量瓶中每mL分别相当于Og,0.5g,lg,2g,3g,5g铁。将处理后的样液，试剂空白，铁标系列溶液分别导入火焰进行测定，测定条件（Pekin-EIener403型原子吸收分光光度计）：波长248.3nm;空心阴极灯电流：30mA,狭缝宽0.2mm,空气流量13.51/min,乙块流量：5.21/分。以铁含量对应浓度吸光度绘制标准曲线，根据标准曲线求得样品铁含量。2.5.4.322.2.4计算（Ai-A2）×VX=×100m式中：X血浆中铁的含量（g100mL血清）Ai-测定用样品液中铁的含量（mgL）A?一测定空白液中铁的含量（mgL2V样品处理液定容总体积（mL>m一血浆取样量（mL）2.5.4.33总铁结合量测定2.5.433.1试剂2.5.43.3.1.1铁标准液2.5.4.3.3.1.1.1 铭精B钱盐法2.5.4.3.3.1.1.1.1 Ofe（3mmolL）取1.176g硫酸亚铁铁（6分子结晶水）置蒸饰水中，加50mL浓硝酸混匀反应10分钟，用蒸锵水定容至100OmL2.5.4.3.3.1.1.1.2 工（做（30molL）取IOmL贮备液，用蒸储水定容至100OmLo2.5.4.3.3.1.1.2原子吸收分光光度法2.5.4.33.1.1.2.1贮备液：取LOOOOg纯金属铁，用盐酸或硝酸溶解后，用0.1N盐酸稀释到1000mL,移入聚乙烯塑料瓶内，存放4。C冰箱，ImL含Img铁。2.5.43.3.1.1.2.2工作液：取IOmL贮备液，用0.1N盐酸定容至100mL,ImL=100pg铁。2.5.43.3.2轻质碳酸镁（AR）（或碱式碳酸镁）其质量应符合要求。2.5.4.33.3实验步骤2.5.4.3.331应用格天青B钱盐方法测总铁结合量取0.1mL血清放入尖底离心管，加60molL铁标准液OJmL充分混合，室温放置15分钟。再加4-5mg轻质碳酸镁，放置15分钟，混合3-4次。然后以3000转/分离心58分钟，取上清液0.1mL按铭天青B钱盐比色法测血清铁的步骤进行操作，计算。254.3.3.3.2原子吸收分光光度法测总铁结合量取1.0mL血清，加铁标准液（20gmL）0.5mL,充分混合，放置15分钟。力口15Omg轻质碳酸镁，充分混匀1分钟以上，放置30分钟，混合34次。离心10分钟，取上清液ImL按原子吸收分光光度法测血清铁的操作步骤进行消化，测定，计算。254.3.3.4计算2.5.4.33.4.1血清总铁结合量可用（mg100L）表示。2.5.433.4.2未饱和铁量=血清总铁结合量一血清铁。血清铁血清蛋白运铁蛋白饱和度（）=XlOO血清总铁结合量2.5.43.4数据处理及结果判定实验数据可用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，尸值尺3,结论：各组均数间差异无显著性；尸值2尺.os，P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。2.5.4.4红细胞内游离原叶咻：见1.6.2。2.5.5结果判定受试样品组与对照组比较，血红蛋白升高且平均升高幅度210gL,血清铁蛋白增加，血清运铁蛋白饱和度升高，红细胞游离原吓咻降低，经统计处理差异有显著性，即可分别判定该指标结果阳性。2.6数据处理及结果判定试验数据为计量资料，可用，检验进行分析。凡自身对照资料可以采用配对，检验，两组均数比较采用成组，检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行/检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用检验或秩和检验；但变异系数太大（如CV>50%）的资料应用秩和检验。结果判定改善儿童缺铁性贫血：试验前后自身比较利试验后组间比较，血红蛋白、红细胞内游离原吓咻二项指标差异有显著性；同时，试食组自身前后比较，血红蛋白平均升高幅度10gL,可判定受试样品具有改善缺铁性贫血的作用。改善成人缺铁性贫血：试验前后自身比较和试验后组间比较，血红蛋白指标差异有显著性；同时，试食组自身前后比较，血红蛋白平均升高幅度21OgL,血清铁蛋白、红细胞内游离原吓咻/血清运铁蛋白饱和度二项指标中一项指标阳性，可判定该受试样品具有改善缺铁性贫血的作用。