保健食品功能检验与评价方法（2023年版）缓解体力疲劳.docx

保健食品功能检验与评价方法（2023年版）缓解体力疲劳I .1实验项目II .1动物体重1.1.2 负重游泳实验1.1.3 血乳酸1.1.4 血清尿素1.1.5 肝糖原或肌糖原1.2 试验原则1.2.1 动物实验所列指标均为必做项目。1.2.2 实验前必须对同批受试样品进行违禁成分的检测。1.2.3 运动实验与生化指标检测相结合。1.3 结果判定负重游泳实验结果阳性，血乳酸、血清尿素、肝糖原/肌糖原三项生化指标中任二项指标阳性，可判定该受试样品具有缓解体力疲劳的作用。缓解体力疲劳检验方法动物实验1负重游泳实验1.4 检验原理运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最直接的表现，游泳时间的长短可以反应动物运动疲劳的程度。1.5 仪器与器材游泳箱（大小约50cm×50cm×40cm）电子天平、铅皮。1.6 实验方法1.1.1 验动物推荐使用纯系小鼠，成年小鼠，体重18-22g01.1.2 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组,必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。1.1.3 实验步骤末次给予受试样品30min后（酒类样品测试当天可以不灌胃）将尾根部负荷5%体重铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深不少于30cm,水温25°C±1.0C,记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间。1.4 数据处理及结果判定游泳时间为计量资料,采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算尸值，F值Foos,结论：各组均数间差异无显著性；尸值、凡a，P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。若受试样品组负重游泳时间明显长于对照组，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。1.5 注意事项1.5.1 每一游泳箱一次放入的小鼠不宜太多，否则互相挤靠，影响实验结果。1.5.2 水温对小鼠的游泳时间有明显的影响，因此要求各组水温控制一致，每一批小鼠下水之前都应测量水温，水温以25°C为宜，如果过低可能引起小鼠痉挛，影响实验结果，过高（30）则游泳时间太长不便于操作。1.5.3 铅皮缠绕松紧应适宜。1.5.4 观察者应在整个实验过程中使每只小鼠四肢保持运动。如果小鼠漂浮在水面四肢不动，可用木棒在其附近搅动。1.5.5 不同批的小鼠因饲养环境、季节等原因的变化体质上会出现差异。因此受试样品组和对照组应采用同一批动物同时进行实验。2血清尿素测定全自动生化仪测定和二乙酰一后法任选一种。2.1 全自动生化仪测定：按有关仪器说明书和试剂盒操作。2.2 二乙酰一的法2.2.1 原理样品中尿素在氯化高铁一磷酸溶液中与二乙酰一后和硫氨服共煮，形成一种红色的化合物DiaZine,其颜色的深浅与尿素含量成正比。与同样处理的尿素标准管比较，可求出尿素的含量。2.2.2 仪器和试剂2.2.2.1 721分光光度计，IOmL带塞试管，ImL（或1.5mL）塑料离心管，电炉，锅，灌胃针头。2.2.2.2 尿素试剂盒（二乙酰一后法二乙酰一后应用液、氯化铁一磷酸应用液、尿素标准液（200mgL）2.2.23若无试剂盒，可自行配制试剂。试剂配制方法如下：lgL二乙酰一后溶液：取二乙酰一后LOg,氨基硫腺（thiosemicarbazide）0.2g,氯化钠4.5g,溶于蒸储水并加至100OmLo33gL三氯化铁溶液：取三氯化铁LOg溶于浓磷酸20mL中，加蒸储水IOmL,摇匀。酸溶液：取蒸储水800mL,慢慢加入浓硫酸50mL,边加边摇；再加入85%璘酸50mL,摇匀。加入33gL三氯化铁溶液1.5mL,加水至IL01 OmmolZL尿素标准液（尿素28.01mg/dL精确称取尿素（AR）15O.3mg溶于16mmolL苯甲酸溶液并加至250mLO16mmolL苯甲酸液：取苯甲酸2.0g溶于蒸储水IooOmL中，加浓硫酸0.8mL。2.2.3实验方法2.23.1 实验动物成年小鼠或大鼠，小鼠体重18-22g,Wistar或SD大鼠体重160-200go推荐使用雄性小鼠。2.23.2 剂量设计和分组大鼠以人体推荐量的5倍为基本剂量。其余同1.3.2。2.23.3 实验步骤223.3.1高尿素模型的建立及标本制备：末次给受试样品30min后,在踱为30的水中不负重游泳90min,休息60min后采血。大鼠采尾血，小鼠拔眼球采全血约0.5mL（不加抗凝剂）置4'C冰箱约3h,血凝固后2000rmin离心15min,取血清备用。血清中的尿素在室温下可稳定24h,在4一6°C可稳定7天以上。用二乙酰一的法测定。2.23.3.2试剂盒操作步骤（本推荐使用的试剂盒适用于手工操作）测定管标准管空白管尿素标准液（mL）0.02标本（mL）0.02二乙酰月弓应用液（mL）3.003.003.00氯化铁一磷酸应用液（mL）2.502.502.50充分混匀，置沸水浴中煮沸10分钟，再于冷水中冷却。在520nm波长处（或绿色滤光板），以蒸储水调零,测定各管吸光度值。计算公式：测定管光密度一空白管光密度尿素（mgL）=X标准液浓度值X10标准管光密度一空白管光密度测定管光密度一空白管光密度尿素（mmolL）=X标准液浓度值:2.8标准管光密度一空白管光密度标准液浓度值为200mgLo2.23.3.3自行配制试剂按下表操作：试剂测定标准管空白管血浆/血清（mL）0.051OmmoIZL尿素标准液（mL）0.05蒸储水（mL）0.05IgZL后溶液（mL）2.52.52.5酸溶液（mL）2.52.52.5充分混匀，置沸水浴准确（A值）15min,立即用自来水冷却。用波长520nm,以空白管调零，读取各管吸光度尿素含量计算尿素（InmOIL）=AUXlO/As尿素（mgdL）=AuX28.01As式中Au-测定管吸光度As-标准管吸光度2.3 数据处理及结果判定尿素数据为计量资料,可用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算产值，F值S,结论：各组均数间差异无显著性：产值2R）wP0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计：若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。若受试样品组血清尿素低于对照组，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。2.4 注意事项2.4.1 为避免色度转移，应在标本加入后30min内读出吸光度值。2.4.2 一般标本测定管反应后应澄清，严重脂血可制备血滤液重新测定。243煮沸时间应准确。3肝糖原测定：蕙圉法。3.1 检测原理慈酮可与游离糖或多糖起反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。测定其光密度，可以确定糖原的含量。3.2 仪器和试剂仪器：721型分光光度计，离心机，扭力天平，匀浆器，振荡器，移液泵，沸水浴，灌胃针头，手术器械，玻璃漏斗,加样器，2mL、5mL、IomL吸量管，20mL带塞刻度试管，IomL带塞离心管。3.2.1 试剂：5%三氯醋酸（用蒸储水配）（TCA）葡萄糖标准液，浓硫酸（AR）慈酮试剂。意酮试剂：溶液中含0.05%的意酮，1%的硫服，用72%的H2SO4配制。配制方法如下：72%H2SO4配制：烧杯中加入28OmL蒸馅水,再加入浓硫酸720mL（比重1.84）慈酮试剂配法：当HfO4温度降至809（TC时放入50Omg恿酮，IOg硫腺，适当摇动烧杯混匀。冷却后存放于冰箱中，可保存两周。3.3 实验方法3.3.1 实验动物同2.2.3.13.3.2 剂量设计和分组大鼠剂量以人体推荐食用量扩大5倍作为基本剂量，其余同132。3.3.3 实验步骤末次给样后30min娜创物，取肝联生理盐水漂洗后用碗吸干，精赚取肝脏Ioomg,加8mLTCA,每管匀浆Imin,将匀浆液倒入离心管，以3000rmin离心15min,将上清液转移至另一试管内。取ImL上清液放入IOmL离心管中（每样品可做两平行管以保证获得可靠结果）每管加入95%的乙醇4mL,充分混匀至两种液体间不留有界面。用干净塞子塞上，室温下竖立放置过夜（也可选用将试管放在37一40°C水浴3h）。沉淀完全后，将试管于3000rmin离4>15min.小心倒掉上清液并使试管倒立放置IOmino用2mL蒸储水溶解糖原，加水时将管壁的糖原洗下。如管底的糖原不立即溶解，振荡管子直到完全溶解。制作试剂空白和标准管：试剂空白：吸2mL蒸锚水到干净离心管。标准管：吸0.5mL葡萄糖标准液（含IoomgZdL葡萄糖）和1.5mL蒸储水放入同样的管子。此时将IOmL慈酮试剂用力加入各管，液流（慈酮试剂）直接进入管子中央，保证充分混合好。从管子中注入慈酮试剂时起，将管子放在冷水龙头下冲凉。在所有管子都达到凉水温度后，将其浸于沸水浴（水浴深度略高于管子液面）15min,然后移到冷水浴。将管内液体移入比色管，在620nm波长下，用试剂空白管调零后测定吸光度。根据所称取的肝脏重量换算成肝糖原含量（以mg/g肝表示）并进行统计分析。333.3 糖原含量计算：DU提取液体积每100克肝组织中糖原的亳克数=×0.5××100X0.9DS肝组织克数DU：样品管吸光度DS：标准管吸光度0.5：为0.5mL葡萄糖标准液液中的葡萄糖含量。0.9：为将葡萄糖换算成糖原的系数。提取液体积：为8mL肝组织克数：为0.1g333.4 处理及结果判定肝糖原数据为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，产值尸Sg结论：各组均数间差异无显著性：产值2R）o5,P0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。333.5 试样品组肝糖原含量明显高于对照组，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。333.6 事项333.6.1 的实验方法均为定量要求，因此所有取样加试剂均需准确。333.6.2 测定中冷却、加热时间与氧化还原作用有关，因此时间要控制准确。333.6.3 显色剂不稳定，以临用时配制为宜，注意避免采用绒布或被污染的糖类进入恿酮反应。4血乳酸测定4.1 原理4.1.1 自配试剂测定方法：在铜离子催化下，乳酸与浓硫酸在沸水中反应，乳酸转化为乙醛，乙醛与对羟基联苯反应产生紫色化合物，在波长56Onm处有强烈的光吸收，故可进行定量测定。4.1.2 乳酸盐测定仪测定方法：检测探头上装有一片三层的膜，其中间层为固定的乳酸盐氧化酶。表面被膜覆盖的探头位于充满缓冲液的样品室内，当样品被注入样品室后，部分底物会渗进膜中；当它们接触到固定酶（乳酸盐氧化酶）时便迅速被氧化，产生过氧化氢。过氧化氢（H2O2）继而在钳阳极上被氧化产生电子。当过氧化氢生成率和离开固定膜层的速率达到稳定时便可得到一个动态平衡状态，可用稳态响应表示。电子流与稳态过氧化氢浓度成线性比例，因此与乳酸盐浓度成正比。4.2 仪器与试剂421仪器：4.2.1.1 血乳酸测定一自配试剂测定方法：微量吸管，恒温水浴锅，电热水箱，分光光度计。4.2.1.2 乳酸仪测定方法：乳酸仪、加样器、振荡器。4.2.2试齐I4.2.2.1 自配试剂测定方法：4%CUSO4、浓硫酸（ARl%NaF溶液。蛋白沉淀剂：按体积分别取一份10%的鸨酸钠，一份l3molL硫酸，再与28份蒸储水混合即成。沉淀剂一NaF混合液：按体积分别取3份沉淀剂，1份l%NaF混合即成。1.5%对羟基联苯溶液：称取1.5g对羟基联苯溶于IOomL热的0.5%NaOH中（可保存半年）乳酸标准储备液（lgL）称取106.6mg乳酸锂或17Img乳酸钙，以10%的三氯乙酸定容至100mL（室温下可保存半年）乳酸标准应用液（001gL）准确吸取LOmL乳酸标准储备液稀释定容至100mL,此液要求现用现配。4.2.2.2乳酸仪测定方法：破膜液、磷酸盐缓冲液、氯化钠。4.3实验方法4.3.1 实验动物同2.2314.3.2 剂量设计和分组：大鼠以人体每日每公斤体重推荐量的5倍为基本剂量，其余同132。4.3.3 实验步骤433.1高血乳酸模型的制作及血标本制备：末次给样30min后采血，然后不负重在温度为3（C的水中游泳IOmin后停止。乳酸仪测定方法：在游泳前各采血20L加入40L破膜液中，立即充分振荡破碎细胞：游泳后立即采血20L力口入40L破膜液中振荡；休息20min后再各采血20L力口入40L破膜液中振荡，用乳酸仪测定。自配试剂测定方法同样在上述三个时间点各采血20L按以下步骤操作。大鼠采尾血，小鼠用毛细管从内眦采血。43.3.2测定步骤43.3.2.1 自配试剂测定：于5mL试管中加入0.48mL1%NaF溶液，准确吸取全血20L加入试管底部。用试管上清液清洗微量吸管数次，再加入1.5mL蛋白沉淀剂，振荡混匀，于3000rmin离心IOmin,取上清液，按下表操作。空白管（mL）标准管（mL）测定管（mL）沉淀剂一NaF混合液0.5乳酸标准应用液0.5上清液0.54%CuSO40.10.10.1浓硫酸333充分混匀，置沸水浴加热5min,取出后放入冰水浴冷却IOmin1*1释堪联采0.10.10.1上述步骤完成后，摇匀，置30水浴30min（每隔IOmin振摇一次）取出后放入沸水浴中加热90s,取出冷却至室温，在波长560nm处用5mm光径比色皿比色，空白管调零。43.3.2.2 乳酸盐测定仪测定方法：按仪器操作说明书操作。4.333血乳酸含量计算A艇曾4.33.3.1自配试剂测定方法：血乳酸含量（mgL）=×100×10A&四青4.3.332乳酸盐测定仪测定方法：直接从乳酸仪上读数，实际值=测得值X3（20L样品加入40L破膜液中，已稀释了3倍）4.4数据处理及结果判定乳酸测定数据为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,尸值Fog结论:各组均数间差异无显著性;产值2Rw5,PW0.05,用多个实验组和个对照组间均数的两两比较方法进行统计：对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。实验结果判定：以三个时间点血乳酸曲线下面积来判断。任一试验组的面积小于对照组，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。血乳酸曲线下面积计算方法：血乳酸曲线下面积=12X（游泳前血乳酸值+游泳后Omin的血乳酸值）×10+12×（游泳后Omin的血乳酸值+游泳后休息20min的血乳酸值）×20=5X（游泳前血乳酸值+3X游泳后Omin的血乳酸值+2X游泳后休息20min的血乳酸值）5结果判定负重游泳实验结果阳性，且血乳酸、血清尿素、肝糖原/肌糖原三项生化指标中任二项指标阳性,可判定该受试样品具有缓解体力疲劳的作用。