羊链球菌病诊断技术.docx

ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号DB15内蒙古自治区地方标准DBXX/XXXXX-XXXX羊链球菌病诊断技术DiagnostictechniquesofsheepStreptococcos点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX -XX-XX 发布XXXX-XX-XX实施内蒙古自治区市场监督管理局发布本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧科学院提出。本文件由内蒙古自治区畜牧标准化委员会(SAM/TC19)归口。本文件主要起草单位：内蒙古金草原生态科技集团有限公司，内蒙古盛健生物科技有限责任公司，内蒙古杜美牧业生物科技有限公司，巴彦淖尔市青青草原牧业有限公司。本文件主要起草人：王娜、戴伶俐、张月梅、白帆、达来宝力格、赵世华、刘学文、谢慧慧、张帆、杨斌、宋越、钱琳娜、刘威、王建光、杨文圃、马海鹏。羊链球菌病诊断技术1范围本文件规定了羊链球菌病的诊断技术。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法GB/T19915.2-2005猪链球菌2型分离鉴定操作规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1羊链球菌病羊链球菌是由C群马链球菌兽疫亚种引起的一种急性、热性、败血性传染病，也称羊败血性链球菌。该病以咽喉部及下颌淋巴肿胀、大叶性肺炎、呼吸异常困难、出血败血症，胆囊肿大为特征。4诊断技术4.1初步诊断根据典型症状和病变及触片镜检为革兰氏阳性球菌，多呈链排列，也有单个菌体排列，初步诊断为本病，确诊该病仍需进行病原菌的分离鉴定。4.1.1 临床症状4.1.1.1 最急性型症状患羊没有明显临床症状，24h内死亡。4. 1.1.2急性型症状病羊体温升高到41C,精神沉郁、食欲废绝、反刍停止、流涎、呼吸困难、弓背、不愿走动，鼻孔流浆液性、脓性分泌物。眼结膜充血，流泪，流出脓性分泌物。有些病例可见眼睑、面颊以及乳房等部位肿胀。咽喉肿胀，颌下淋巴结肿大。粪便带有黏液血液，最后衰竭倒地，多窒息死亡，有些病例可见病畜死前有磨牙、抽搐等神经症状。病程l3d°4. 1.1.3亚急性型症状体温升高、食欲减退，不愿走动，呼吸困难、咳嗽，鼻流黏性透明鼻液，病程714d.4. 1.1.4慢性型症状一般轻度微发热，消瘦，食欲减退，步态僵硬。有些病羊出现关节炎。病程1个月左右。4.1.2病理变化病理变化主要以败血性症状为主，尸僵不明显;各脏器广泛出血，尤以膜性组织（大网膜、胸膜、腹膜、肠系膜等）最为明显;各脏器浆膜面常覆有黏稠、丝状的纤维素样物质;扁桃体水肿、出血、坏死，头颈部淋巴结肿大、出血;咽喉部黏膜高度水肿、出血;上手吸道卡他性炎，气管黏膜出血;肺实质出血、肝变，呈大叶性肺炎，肺脏常与胸壁粘连;胸腔内有黏性渗出物;肝脏肿大，表面有出血点;胆囊肿大，胆汁外渗;肾脏质地变脆、肿胀、被膜不易剥离。5病原分离鉴定5. 1方法概要检验程序的流程示意图见附录A（资料性附录）。5. 2试剂和材料除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682T992的蒸镭水。各种培养基的制备方法见附录B（规范性附录）。5. 3仪器和设备5. 3.1匀质器和匀质杯。5.2.2 天平：称量范围Og-1OOOg,读数精度0.0001g5.2.3 培养箱：37C±IeC05.2.4 恒温水浴锅。5.4.1样品采集对病死羊主要采集其气管和肺脏等组织；对活羊可采取鼻腔拭子。5.4.2分离培养5.4.2.1送检菌株的分离划线接种于含5%马血清的胰蛋白陈大豆琼脂平板(TSA)或普通琼脂绵羊血平板，37培养16h20h,使之形成单个菌落，以供鉴定用。5.4.2.2病料的分离和触片检查用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线接种于5%马血清的胰蛋白陈大豆琼脂平板(TSA)或普通琼脂绵羊血平板(见第B.2章)，于37培养16h20h后观察。同时取病料做组织触片，革兰氏染色(按GB/T4789.28的方法进行染色)后镜检，如见粉红色小杆菌则表明病料中可能含有多杀性巴氏杆菌。5.4.2.3鼻腔拭子的分离鼻腔拭子样品加入到含有5ml,灭菌的含5%马血清胰蛋白陈大豆肉汤(TSB)(见第B.3章)的试管中，于37培养16h-2Oh后，划线接种于普通琼脂绵羊血平板或5%马血清的胰蛋白陈大豆琼脂平板(TSA)(见第B.1章)。5.4.2.4动物产品的均质、增菌和分离以无菌操作取检样25gt加人装有225ml,灭菌含5%马血清胰蛋白月东大豆肉汤(TSB)(见第B.3章)的广口瓶内，均质，于37培养12hT6h后，划线接种于5%马血清的胰蛋白陈大豆琼脂平板(TSA)或普通琼脂绵羊血平板(见第B.2章)。5.4.3初步鉴定羊链球菌在37C培养18h后，在普通琼脂绵羊血平板和含5%马血清的胰蛋白陈大豆琼脂平板(TSA)上形成圆形微凸起、表面光滑、边缘整齐、灰白色的菌落，直径约OJmnrLOmin,菌株B溶血。将可疑菌落做革兰氏染色，本菌为革兰氏阳性球菌，固体和液体培养物均以单个菌为多，无芽胞，能形成荚膜(按GB/T4789.28的方法进行染色)。菌落生长特征、革兰氏染色、可初步确定为羊链球菌。5.4.4生化鉴定经初步鉴定后，细菌在马丁肉汤中培养24h后，肉汤呈中等混浊，无菌膜,有少量絮状沉淀，放置1周后上部变澄清。在6.5%NaCl中不能生长，能发酵葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、水杨昔，不能发酵海藻糖、甘露醇，马尿酸钠水解试验阴性，纤维素溶解试验阴性，不还原硝酸盐，不产生口引睬，甲基红反应阴性。此生化结果符合羊链球菌的特点。5. 4.5羊链球菌特异性PCR检测6试验结果分析判定5.1 符合以下特性者应判为多杀性巴氏杆菌一羊链球菌在37培养18h后，在普通琼脂绵羊血平板和含5%马血清的胰蛋白陈大豆琼脂平板(TSA)上形成圆形微凸起、表面光滑、边缘整齐、灰白色的菌落，直径约O.ImmT.Omni,菌株B溶血。将可疑菌落做革兰氏染色，本菌为革兰氏阳性球菌，固体和液体培养物均以单个菌为多，无芽胞，能形成荚膜。- 革兰氏阳性球菌，大多数单个存在；一马尿酸钠水解试验、纤维素溶解试验、还原硝酸盐、呵睬、甲基红均为阴性；- 发酵葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、水杨甘，不能发酵海藻糖、甘露醇。- 羊链球菌通用基因PCR检测阳性。5.2 符合以下特性者的菌株可判定为羊链球菌一符合6.1的特性；一通用基因PCR检测阳性。7废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。附录A（资料性）羊链球菌检测附录B(规范性)各种培养基的配制方法BJ普通琼脂绵羊血平板牛肉膏3.Og蛋白陈10.Og抓化钠(NaCI)5.Og磷酸二氢钾(KH2P04)1.0g琼脂15.Og蒸镭水1OOOmL脱纤维无菌绵羊血50mL除无菌绵羊血外，混匀，加热溶解，调PH至7.6分装，115C灭菌15min,冷却至45C加入5%无菌脱纤维绵羊血倾注灭菌平板B-2胰蛋白月东大豆琼脂培养基(TSA)配方:(gL)胰酪蛋白月东15g大豆蛋白陈5g氯化钠5g琼脂15g纯化水1000ml取上述成分除琼脂，混合，微热溶解，调节PH值使灭菌后在25°C的PH为7.3±0.2,加入琼脂，加热融化后，分装，灭菌，冷却至约60C,在无菌操作要求下倾注约20ml,至无菌平皿中。加盖后在室温放至凝固。平皿培养及保存:制备好的培养基平皿宜在2C-8°C保存，一般以一周为宜或按厂商提供的标准执行。采用适宜方法在平皿上做好培养基的名称、制备日期记录的标记。B.3胰蛋白陈大豆肉汤(TSB)配方:(gL)胰酪蛋白陈17g大豆蛋白陈3gD-葡萄糖2.5g氯化钠5.Og磷酸氢二钾2.5gPH7.3+/-0.2用IOoOnlI去离子水溶解30g培养基粉末。调节PH至7.3。TSB培养基灭菌条件是，12Ie高压蒸汽灭菌15mino附录C（资料性）羊链球菌PCR扩增引物序列羊链球菌PCR扩增引物序列见表1o表1羊链球菌PCR扩增引物序列基因引物名称序列(5'-3')目的片段bpMl-FCtatcggtggtcgtaatggaga类“蛋白Ml-Rcctgcctaactgcggct700Fnz-FGaggtggaccagcttcacctFnzFnz-Rgaggaagacggtccgcg540SodA-FCagcattcctgctgacattcgtcaggSodASodA-RCtgaccagccttattcacaaccagcc230