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肠道菌群通过调节免疫细胞参与肠外疾病的研究进展2023摘要肠道内储存了大量微生物，它们通过多种途径对人体肠道内和肠外免疫系统产生了重要影响，这一过程包括肠道菌群自身成分的易位、代谢产物的循环以及免疫细胞的迁移。本文介绍了肠道菌群如何影响免疫系统并参与肠外疾病，重点对肠道免疫细胞的作用及机制进行了阐述。消化道作为人体内表面积最大的器官，贮藏了大量的细菌、病毒等微生物，肠道内微生物总共含有大约330万个基因，约是人类基因组的150倍。肠道微生物总共有1000至(J1150种，而每个人的肠道内只有约160种优势菌种，说明不同个体间肠道菌群的构成存在巨大差异，这可能与个体间的遗传和环境因素的不同有关L2。消化道作为一个复杂的免疫器官含有大量的免疫细胞和复杂的肠道相关淋巴组织(gutassociatedlymphoidtissue,GALT)3免疫细胞具有独特的迁移能力，可通过淋巴管道和血液循环转移至远隔组织、器官并参与机体局部的免疫调控4。已有实验证明，大量的免疫细胞能通过循环系统进入肠道，也能从肠道迁出至远隔部位5,6。随着研究的深入，研究者们发现肠道菌群的构成与多种疾病的发生发展息息相关7,甚至成为其始动因素。本文主要介绍了肠道菌群对机体免疫反应的影响，以及肠道免疫细胞向肠外组织迁移、参与远隔器官炎症反应的机制，进而影响疾病的发生发展。一、肠道菌群对免疫系统的作用肠道菌群和肠道内免疫细胞的相互作用对维持局部稳态和系统性的免疫平衡方面至关重要8。生理状态下，机体与肠道菌群间维持着适度的免疫反应以抵御病原体入侵，二者之间保持互利共生的状态；而在疾病时，这一平衡被打破，出现肠道菌群紊乱并引发机体免疫级联反应。(一)肠道菌群及其成分突破肠屏障肠道屏障的完整性是维持机体稳态的必要条件，肠道黏膜通过产生毒性分子、分泌黏液、上皮细胞间的紧密连接以及黏膜免疫来阻止病原体入侵。炎性细胞因子的释放、细菌与肠上皮细胞的相互作用、免疫细胞穿越肠屏障等均可破坏肠道上皮的紧密连接和肠道屏障的完整性，导致肠道通透性增加，此时脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和其他水溶性分子即可经细胞旁途径穿过肠道黏膜9。ST段抬高型心肌梗死(STSegmentelevationmyocardialinfarction,STEMI)患者血液中细菌含量和炎症水平预示不良结局10。通过破坏肠道屏障或人为注入LPS会加重糖尿病小鼠的肾脏损害11。多种自身免疫性疾病如1型糖尿病(type1diabetesmellituszT1DM)x心肌炎等需要外来抗原以触发12,13o2018年来自耶鲁大学的研究者发现14,一种名为鹑鸡肠球菌(EnterOCOCCUSgallinarum)的肠道菌群与自身免疫病之间形成了恶性循环：系统性红斑狼疮或自身免疫性肝病导致肠道屏障损伤，而损伤的肠屏障有利于鹑鸡肠球菌易位到肝脏等位置，继而促进自身免疫复合物的产生、加重自身免疫疾病。以上研究表明肠道来源的病原相关模式分子（pathogen-associatedmolecularpatternszPAMP）如LPS进入循环后通过与机体中广泛存在的模式识别受体（patternrecognitionreceptorPRR结合而产生全身低度的炎症反应并影响多种疾病的进程。此外，某些具有免疫活性的肽段或者肠道菌群因肠漏进入机体，能在肠道或肠外组织激活适应性免疫反应而导致自身免疫，豚病的发生。（二）肠道内代谢产物影响免疫反应肠道细菌可以通过分解食物或机体排出的大分子物质而生成多种代谢产物，如人体所必需的维生素，其中有些代谢产物经肠道黏膜进入机体并参与免疫反应的调节。这些小分子物质中研究较多的是短链脂肪酸（short-chainfattyacids,SCFAs厢氧化三甲胺（trimetlylamineoxide,TMAOSCFAs的作用主要是抑制炎症,实验证明小鼠结肠微生物可以合成丙酸盐，并通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性来抑制肠道细胞产生IL-1715。此外,SCFAs也可以诱导Treg的产生ArPaia等16的研究发现给抗生素清扫小鼠（即预先抗生素灌胃或饮水处理）外源性补充丁酸盐可以使脾脏和外周淋巴结中Foxp3+Treg细胞增多。进一步研究发现肠道微环境紊乱会导致心梗和卒中后恢复不良,而通过补充SCFAs可以改善不良结局17,18。TMAO是肠道菌群产生的三甲胺经肝脏氧化而产生的物质,与心血管疾病具有明显相关性19,20。体外试验发现TMAO可以增加血小板的聚集21,是急性心梗的重要病理基础。TMAO还可以使血管平滑肌细胞和内皮细胞的促炎细胞因子表达增加，并激活NLRP3(NOD-Iikereceptorthermalproteindomainassociatedprotein3)炎性体22,23,导致血管内皮损害，进而加速脂滴进入最终导致动脉粥样硬化的形成。(三)肠道菌群调控免疫细胞分化初始T细胞在受特定信号刺激时分化为多种效应细胞，比如ThKTh2、Thl7和Treg细胞。现有研究发现某些特定的肠道细菌具有诱导T细胞向特定亚群分化的能力，即肠道菌群可以影响T细胞的分化方向24,其中分节丝状菌(segmentedfilamentousbacteria,SFB)促进Thl7产生的证据最充分25,26,27,28o此外，梭状芽泡杆菌属可以诱导肠道Treg细胞的分化29,30,嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila)促进滤泡辅助T细胞(TFollicularHelperCells,Tfh)的分化31,而TanoUe等32从人类粪便中分离出的11种菌株能共同促进IFN-YCD8+细胞的分化而不介导炎症反应。(四)不同免疫细胞亚群对特定菌群信号的识别不同细胞亚群对菌群信号的识别方式不同，传统T细胞所表达的T细胞抗原受体(Tcellreceptor,TCR)是多样且特异的,它们通过这些TCR识别特定的菌群；而非传统T细胞的TCR缺乏多样性，如T细胞、黏膜相关恒定T细胞、NKT细胞，它们通过识别与菌群代谢产物结合的泛特异性抗原提呈分子感知菌群信号。此外，这一过程还需要其他细胞预先对菌群抗原进行加工处理，如树突状细胞、巨噬细胞、上皮细胞、固有淋巴样细胞和肠神经系统24。这些免疫细胞可以通过不同的识别机制接受肠道菌群的调控进而参与肠外疾病的发生发展，深入剖析这些机制有利于人为调控肠道菌群对肠外组织疾病的影响。二、肠道菌群调控细菌特异性免疫细胞的分子机制肠道内存在种类众多的抗原，免疫细胞通过识别不同的抗原而发生多种免疫反应其中自身反应性T细胞通过TCR期ETCR途径被肠道菌群活化，从而导致损伤性自身免疫反应疾病的发生，通过干预肠道群菌治疗自身免疫病具有良好的应用前景33。此时，我们不禁提出问题：肠道菌群如何诱导特定的自身免疫性T细胞激活？(一)交叉反应/分子模拟抗原与抗体之间的反应并不是绝对特异的，因为两种抗原之间的重要结构或序列存在相同性，即二者有交叉反应。现已发现肠道菌群来源的异体抗原与宿主自身抗原之间存在一定的交叉反应并通过分子模拟的方式导致自身免疫性疾病的发生34,35。TCRM鼠中95%以上的CD4+T细胞可以表达针对肌球蛋白重链6(MYH6)的受体而出现自发性心肌炎，这一过程需要肠道菌群提供模拟肽。在过继转输实验中,WTCRM鼠的脾脏T细胞进行CFSE荧光标记并通过尾静脉注射至Rag1-鼠体内，发现这些细胞会先进入肠道固有层、结肠斑、肠系膜淋巴结(mesentericlymphnodes,mLN)并获得增殖,然后迁移到心脏36。作者发现是肠道内多形拟杆菌的-半乳糖苗酶(B-gal)模拟肽与MYH6具有高度相似性，%gal在肠道激活了MYH6特异性CD4+T细胞,使其分化为Th17细胞，继而向心脏迁移后与心肌组织同源的自身抗原发生反应，诱导心肌炎的病理过程。Miyauchi等37发现了更为复杂的分子模拟机制，他们发现2种细菌共同作用导致实验性变态反应性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)模型小鼠出现严重的中枢脱髓鞘表现。罗伊乳杆菌(lactobacillusreuteri)表达的UvrA肽段可以作为模拟肽活化针对MOG35-55的T细胞，但由于反应很微弱并不足以导致症状的出现。而异杆菌属(allobaculum)的细菌可以促进肠道Th17的增生，从该菌属定植的小鼠体内提取出小肠或脾脏细胞，经体外MOG35-55刺激后能产生更多的IL-17等促炎细胞因子。单独在小鼠肠道内种植一种细菌都不足以产生严重的EAE病理表现,并且异杆菌属和uvrA基因缺陷的罗伊乳杆菌的共同种植所产生的EAE症状也明显弱于野生型菌种。只有当两种细菌共同定植于小鼠体内才能导致严重的EAE病理表现，说明肠道中两种细菌协同配合加重了EAE的自身免疫反应，其中罗伊乳杆菌提供较弱的模拟肽，异杆菌属则促进Thl7的产生。(一)SFB选择性激活表达双重TCR的自身反应性T细胞另一种机制是通过双TCR细胞实现，由于不彻底的等位基因排斥,人体内有大约33%的T细胞表达2种TCRo识别SFB抗原主要依赖V14+,而KRN转基因受体是V6÷oSFB可以升高K/BxN鼠肺部Th17细胞并且促进肺和脾的TM7表型由V6+向V6÷V14+转化，但SFB不能诱导Rag-KO鼠Thl7细胞。Rag敲除小鼠因无法完成TCR基因重排而不能表达内源性TCR受体，这说明SFB通过TCR特异性激活并诱导免疫细胞向Th17分化的条件是，该细胞需同时含有SFB受体和KRN受体28o(三)旁观者效应通常T细胞的活化、增殖，需经APC的MHC类分子提呈抗原，并有共刺激分子的参与。但也有研究发现，T细胞可在TOll样受体(Toll-Iikereceptors,TLR)信号和细胞因子的刺激下活化38,39。不同于交叉反应，旁观者效应并不受TCR限制，因此该过程中可以激活不同TCR的T细胞，表现为多克隆性40。与SFB诱导Thl7细胞需要特异的TCR信号不同，Teng等人41发现SFB可以通过树突状细胞(dendriticcellzDC)介导的旁观者作用诱导派尔斑内Tfh分化并迁移至脾脏。虽然Rag敲除的小鼠不能产生自身TCR,即体内只存在转基因KRN受体而缺乏SPF的受体，但将Rag-KOKRNCD4÷T细胞过继转输到TCra-/-BxN小鼠体内后,SFB依然可以诱导其产生Tfh细胞(主要在派尔斑和脾脏在肠道微生物与肠道黏膜间的复杂免疫反应中，通过上述机制能错误地激活致病性自身反应性细胞，导致自身免疫性疾病的发生。但需要注意的是,上述实验主要是在基因编辑的小鼠上完成的，它们已经通过转基因的方式获得了一个TCR,所以这些机制在人体内能发挥多大的作用尚不清楚。三、肠道免疫细胞迁移与肠外疾病随着细胞示踪技术的发展以及相关工具鼠的出现，越来越多的研究证实肠道免疫细胞可以迁移至肠外器官并参与疾病发生42。2003年的实验证明了肠道免疫细胞参与TlDM的进展43,研究者发现移植不同年龄NOD小鼠的脾脏、肠系膜淋巴结的细胞到NODscid小鼠体内可导致T1DM的发生。尽管脾脏细胞的致病性最强，但mLN细胞的致病性出现最早(来自3周龄的供体小鼠即可诱导，该周龄小鼠体内还未出现胰岛炎症随后他们通过基因编辑使胰岛细胞表达特定抗原，再口服该抗原以获得肠道免疫,发现胰岛内有表达肠道归巢受体47的CD8细胞，说明受肠道菌群活化的免疫细胞迁移到了具有特定抗原的胰岛。这提示肠外疾病的进展可能依赖于免疫细胞向肠外组织迁移、转运。(一)肠道免疫细胞在生理和病理状态下都存在迁移近年来，通过追踪带荧光免疫细胞的方法可以直接证明肠道免疫细胞向外周淋巴结、脾脏和其他器官迁移。2014年Morton等6使用内镜对Kaede转基因鼠降结肠进行紫光照射，使得照射部位的细胞表达红色荧光，进而追踪肠道免疫细胞的分布44。该实验发现Kaede-red÷CD45+细胞最早出现于尾淋巴结，随后mLN、腹股沟淋巴结、脾也出现肠道来源的髓系和淋巴系细胞。通过对派尔集合淋巴结注射CFSE荧光染料以及使用KikGR转基因鼠的方法，Brea等44和Singh等45都发现卒中后3d即有肠道免疫细胞向骨髓、脾脏、颈部淋巴结等免疫器官和损伤的大脑半球迁移,并优先选择向中枢而非周围免疫器官迁移。脑出血的小鼠模型中也发现，在血肿周围肠道来源的T细胞比例高于假手术组46。这些研究说明肠道与外周组织间有大量的免疫细胞交换，在正常情况下，机体通过调节免疫反应维持免疫耐受；而在病理条件下，肠道局部免疫细胞受周围炎症介质的趋化而向该位点迁移并发挥抗炎或促炎作用。(二)多种肠道免疫细胞迁移影响肠外疾病1.肠道DC细胞迁移抑制EAE炎症：树突状细胞属于抗原提呈细胞,通过摄取肠道黏膜处的抗原，并在mLN内提呈给T细胞而诱导适应性免疫反应。此外,固有层的CD103+DC具有明显的诱导Treg的倾向47。某些细菌可以增加致耐受性DC细胞诱导Treg的能力，并影响EAE的进展48,49。有研究发现，给予多糖A(polysaccharideA,PSA)后小鼠颈部淋巴结(cervicallymphnode,CLN)内CD103+DC细胞增多，并且这一现象只出现在已经诱导EAE的模型中，此外初始T细胞与这些DC细胞接触后可向FoxP3+转化50。该团队的进一步研究51发现，DC细胞是通过依赖TLR2的方式促进CD39+细胞产生并发挥免疫调节作用,而FoxP3似乎不是必要的。体外实验证明PSA可以增加CD39+细胞数量，并在迁移实验中发现PSA增加了CD39÷T细胞的迁移能力52。虽然没有直接的证据说明DC细胞或CD39+细胞发生了迁移，但这些结果足以提示肠道来源的迁移型DC可以进入mLN和CLN(在中枢炎症的条件下)并诱导CD39+T细胞的分化，进而通过产生IL-10等细胞因子减轻炎症反应。CD103+DC在EAE模型中向CLN迁移的机制目前还没有阐明，但猜测可能与局部的炎症存在有密切的关系，比如炎症部位趋化因子的影响。2.Th17细胞迁移并参与多种疾病:Th17细胞主要存在于肠道，维持肠道的免疫反应以抵抗病原体的侵入。而在一些情况下，肠道来源的TM7细胞还可以迁移到炎症部位并发挥作用。肠道Thl7细胞的迁移包括由肠道进入循环和由循环进入肠外组织两步。第一步主要依赖鞘氨醇-1-磷酸受体I(SIPrI)53,54,55,而第二步主要由CCR6/CCL20轴介导。在对ANCA相关肾炎模型的研究中发现,肠道Th17细胞向高表达CCL20的炎症肾组织迁移。同时小鼠的肠道和肾脏中Th17细胞均减少,提示肠道可能作为Th17细胞的储存库，当周围组织出现炎症时则会动员肠道细胞的浸润53。在K/BxN鼠肺部炎症的实验也发现这些鼠的肺部CCL20表达升高28。YU等54,55发现在肠道TNF÷T细胞和Thl7细胞的共同作用下,能使甲状旁腺激素和卵巢切除导致的骨流失加重。肠道菌群可以促进TNF+T细胞分化，并通过CCL20/CXCR3轴向骨髓迁移,导致骨髓CCL20水平升高,进而使Th17向骨髓迁移增多。这说明炎症反应可以使局部趋化因子的水平升高，从而吸引肠道Thl7细胞浸润并加重炎症反应，但这些趋化因子升高的具体机制尚不明确。此外，Yu等54,55的实验提示肠道菌群可同时对多种类型细胞产生影响，受影响的细胞通过协同作用而加重疾病。目前抑制肠道Thl7细胞迁移的抗转运剂已被证明可用于减轻多发性硬化(multiplesclerosis,MS2022年Charabati等56发现,DICAM与Thl7细胞穿过血脑屏障向大脑组织转运密切相关,同时炎症可导致血脑屏障DICAM的配体表达升高。随后他们使用DICAM的单克隆抗体来阻断Th17细胞通过血脑屏障，并在多种EAE模型验证了阻断该通路可以缓解MS。3.IL-17T参与缺血性脑损伤IL-17T是产生IL-17的另一重要细胞，它在肠道局部主要通过TLR的方式参与黏膜免疫。Benakis等57发现在小鼠脑缺血性损伤模型中，有大量的IL-17T聚集于脑膜，而经抗生素喂养的小鼠软脑膜中IL-17T和中性粒细胞数量明显减少。进一步研究发现，抗生素喂养的小鼠mLN内CD103+DC数目增加，且其诱导Treg细胞分化的效率更高而这些Treg又通过分泌IL-10抑制肠道IL-17T细胞的产生，使脑损伤时进入脑组织的IL-17T减少。不同于Th17的研究，该研究发现肠道内一种能分泌IL-17的非传统T细胞也具有向远隔组织迁移的能力，但是关于其产生、分化和迁移的机制仍需进一步研究。4.调节性T细胞与1型糖尿病：1型调节性T细胞(type1regulatoryTcellzTr1)是不表达FOXP3的一类调节性T细胞，通常在免疫耐受的环境中由外来抗原，如不成熟DC反复刺激、抗CD3单抗和CD46单抗联合刺激所产生，它通过分泌高水平的IL-IO而发挥免疫抑制作用。研究者通过改变肠道菌群或使用CD3单抗的方法可以诱导小肠产生Trl这些Trl细胞与其他细胞相比表达更多的趋化因子。将小肠Trl经静脉过继转输至NODscid小鼠体内，发现这些细胞可以延缓糖尿病的发生,并使胰腺内IFN-Yfi勺分泌减少58,提示肠道来源的Trl具有趋向性并通过分泌IL-IO而抑制炎症。CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)可在胸腺中天然产生,也可在外周被抗原诱导产生，它们通过细胞接触而发挥抑制炎症的作用。研究人员发现，丁酸梭菌可以使胰淋巴结和胰腺内表达肠道归巢受体407的Treg细胞增加59,其机制可能与丁酸梭菌的产物丁酸盐有关60。应用S1Prl的拮抗剂FTY720可以抑制胰淋巴结内047+Treg的募集，说明Treg细胞通过淋巴途径迁出肠道。代谢物丁酸盐能升高胰腺CXCL12水平,并增加结肠Treg的迁移能力，提示CXCR4/CXCL12轴在肠道Treg向胰腺迁移的过程中发挥重要作用。肠道是免疫耐受的重要场所，可以产生包括Treg和Trl在内的大量调节性T细胞。上述研究说明这些细胞在某些条件下可以迁移并参与肠外疾病的调节，不过由于这些实验都基于DM并且未阐明这些肠道来源细胞的产生和迁移机制，因此该途径是否能影响其他疾病仍需进一步探索。值得一提的是，过表达TGF-B的负调控因子Smad7可以促进肠道T细胞向促炎方向分化以及向中枢的迁移，进而加重MS61,这为我们进一步探究提供新线索。5.IgA+B细胞参与多发性硬化：B细胞作为适应性免疫的另一成员在维持机体稳态方面亦发挥重大作用，其主要作用为产生抗体介导体液免疫，同时也具有一定的分泌功能。研究发现EAE模型小鼠的中枢神经系统内存在着IgA+B细胞，其对缓解疾病起到重要作用62,63。EAE小鼠及MS患者脑部较健康者有更多的IgA+B细胞，这些细胞通过分泌IL-10而减轻炎症反应。止匕外，MS患者体内能与IgA结合的肠道菌群也不同于健康人。接着，研究者对脑内的IgA+B细胞来源做了研究，他们发现脑内分泌IgA的细胞能对肠道菌群发生反应，说明这些细胞可能来自肠道。虽然没有这群细胞迁移的直接证据，但Rojas等62通过构建小鼠模型发现肠道中分泌IgA的细胞能进入炎症发生的部位。关于浆细胞向中枢迁移的机制尚不清楚,但研究发现骨髓和EAE动物模型中枢神经系统的浆细胞可以通过下调CD138表达而降低对胶原纤维I的粘附。此外，浆细胞表达的CXCR4分子有助于向表达CXCLl2的脊髓驱化，这些提示浆细胞趋化因子的改变可能有助于迁移过程。从上述研究中我们发现趋化因子对肠道免疫细胞迁移的作用不容忽视。它们是一组可以诱导多种细胞，如中性粒细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞的趋向性的小分子，具有趋化白细胞向炎症部位募集、调节稳态的作用。趋化因子及其配体数量和种类繁多，两者之间的作用也不是对应的关系，因此在不同细胞、环境下趋化因子的表达及其与受体结合发挥的作用不同。DC向引流淋巴结的迁移依赖于CCL21CCR7fTh17细胞的迁移依赖CCR6的表达,Treg细胞依赖CCR4而小肠通过CCL25以吸引表达CCR9和047的细胞向肠道移动64,65。可见趋化因子是介导免疫细胞在炎症部位游走并进入特定组织的重要因子，并且极有可能在肠道免疫细胞向外周迁移的途径中发挥重要作用。四、结语肠道菌群对免疫系统的影响广泛而多样,既可以通过自身组织成分如LPS和菌体抗原，也能通过代谢产物来调控免疫。肠道免疫细胞不只在局部发挥作用，还可以在肠道菌群的作用下，通过分子模拟、双TCR细胞、旁观者效应等机制参与肠外组织或淋巴器官的炎症性疾病。近年来已有大量研究发现多种肠道免疫细胞参与了肠外疾病的调节：DC细胞摄取抗原并迁移到外周诱导T细胞向特定方向分化，Th17细胞向靶器官迁移并分泌IL-17而加重炎症反应，具有分泌功能的浆细胞迁移到炎症部位，并通过非抗体依赖途径发挥作用。虽然肠道免疫细胞向周围迁移并参与疾病进展的事实毋庸置疑，但不同疾病微环境、免疫细胞亚群与肠道各菌群间的关系复杂。其中，肠道特异性免疫细胞的转运调控机制对肠外疾病的影响至关重要53,60,66,肠道菌群在产生致病或调节性免疫细胞上，以及免疫细胞通过趋化因子迁移至肠外组织的过程中究竟发挥了什么样的作用，是我们未来研究的重点和难点。参考文献（略）