四川省新冠病毒核酸检测操作规范（试行）.docx

四J11省新冠病毒核酸检测操作规范（试行）为贯彻落实国家卫健委关于进一步加强新冠病毒核酸检测全链条监管的通知（联防联控机制综发（2022）63号）精神，实现全省新冠病毒核酸检测实验室流程标准化、同质化，快速协同，特制定四川省新冠病毒核酸检测标准操作流程和记录表格，推广全省开展新冠病毒核酸检测的实验室应用。一、新冠病毒核酸检测资质（一）实验室资质。开展新冠病毒核酸检测医疗机构应取得二级生物安全实验室及临床基因扩增实验室备案。（二）技术人员资质。L新冠病毒核酸检测人员。新冠病毒核酸检测人员应当具备相关专业的大专以上学历或具有中级及以上专业技术职务任职资格，并有2年以上的实验室工作经历，并经理论和实践培训取得临床基因扩增或新冠病毒核酸检测培训合格证书（证书在有效期内）。实验室配备的工作人员应当与所开展新冠病毒核酸检测的样本量相适宜，以保证及时完成检测和结果报告。2 .新冠病毒核酸检测辅助人员。新冠病毒核酸检测辅助人员主要从事新冠病毒核酸检测相关的样本签收和前处理、协助核酸提取、样本打包保存、试剂耗材拆封等工作。新冠病毒核酸检测辅助人员应具备医疗卫生相关专业技术职业资格，上岗前应进行生物安全、信息系统使用、样本核收、样本保存等相关理论和实践培训，考核合格并取得新冠病毒核酸检测培训合格证书。二、新冠病毒核酸检测程序（一）检测系统的选择。新冠病毒核酸检测系统由采样管、核酸提取试剂、核酸提取仪、核酸扩增试剂、核酸扩增仪等组成。L采样管。应选择具有病毒灭活功能如含胭盐（异硫氟酸朋I或盐酸服等）或表面活性剂的采样管，并根据国家规定的应用场景选择单采管，10混或20混采样管。发热门诊或急诊的快速检测系统，应根据所用核酸检测试剂说明书选择配套的采样管。3 .核酸提取试剂及仪器。宜选择核酸扩增试剂配套或推荐的核酸提取试剂，建议首选磁珠法核酸提取试剂。根据样本量和实际情况选择与核酸提取试剂配套或兼容的、不同通道（16通道，32通道，48通道，96通道等）、不同自动化程度（半自动、全自动）的核酸提取仪。4 .核酸扩增试剂及仪器。应选择国家药品监督管理部门批准至少检测ORFlab和N基因的新冠病毒核酸扩增试剂，最低检测限应W500copiesml,优选W300copiesmlo实验室应选择至少两种扩增试剂，分别用于初检和复核。患者样本检测应选择内源性内标的核酸扩增试剂，环境样本检测应选择外源性内标的核酸扩增试剂。建议选择与核酸扩增试剂配套或推荐的核酸扩增仪，并根据检测样本量选择不同通量（48通道、96通道）核酸扩增仪。（-）性能验证或确认。在用于临床样本检测前、在仪器重大维修或搬迁后，实验室应对新冠病毒核酸检测系统进行性能验证（配套系统）或确认（非配套系统）。验证/确认的性能指标应至少包括最低检测限和精密度（至少要有重复性），并完成新冠病毒核酸检测系统性能验证/确认报告（模板见附件Do1 .最低检测限。对于配套系统，使用定值标准物质，用实验室采样保存液稀释至厂家声明的最低检测限浓度，重复测定5个该浓度样本或在不同批内重复测定20个该浓度样本（如连续测定5天，每天测定4份样本）。判断标准为，5个检测结果都须检出靶基因，20个检测结果，须至少18个检出靶基因。对于非配套系统，使用定值标准物质，用实验室采样保存液稀释至核酸扩增试剂厂家声明的最低检测限浓度及附近的3-5个浓度梯度，每个浓度梯度做20个样本，至少18个检测检出靶基因的最低核酸浓度为实际最低检测限或通过PrObit分析确认最低检测限。判断标准为实际最低检测限W500copiesml（建议300copiesml）。2 .精密度（重复性）。应至少评估弱阳性和中浓度两个水平的重复性。弱阳性水平用定值标准物质或定值质控品稀释至检测限L5-3倍浓度水平，中浓度水平建议稀释至IOOo-2000COPieS/nil。将两个水平的各10个样本按标准操作程序进行新冠病毒核酸提取和扩增，在质量控制达到要求的基础上，分别计算两个水平的CT值变异系数，判断标准为是否达到厂家声明的变异系数。检测系统通过性能验证或确认后方能用于临床样本的检测。更换试剂批号时，建议分别重复检测5个最低检测限浓度和5个弱阳性水平的样本，对新批号试剂的最低检测限和重复性进行验证。新批号试剂应通过性能验证后，方能用于标本检测。（三）核酸检测操作流程。新冠病毒核酸检测流程通常包括试剂配制、样本前处理、核酸提取、核酸扩增、结果判读和结果报告，必要时还包括结果复核。建议各实验室参照本操作流程，结合实验室实际使用的仪器设备和试剂耗材制定具有可操作性的标准操作流程。核酸检测和辅助人员在首次进入实验室操作前，必须通过标准操作流程的培训和考核后方能授权上岗。实验室所有检测人员和辅助人员都必须严格遵照标准操作流程进行核酸检测。L试剂配制（一区）。1）负责试剂配制的人员应根据待检样本数量、试剂盒规格（如：32T,48T,96T等）、质控数量、拟复查数量等信息测算试剂用量，现配现用。2）将测算数量的核酸扩增试剂盒从冻存冰箱中取出，扩增酶和反应混合液放常温解冻，将阳性和阴性质控传递到二区待用或丢弃。3）待扩增酶和反应混合液完全解冻后，用移液器将试剂转移至无菌容器充分混匀，根据试剂盒说明书将混匀的试剂用移液器或自动化设备分装至8连管或96孔PCR反应板,并检查试剂液面的一致性。将8连管盖上管盖，96孔PCR反应板贴封口膜，以保证试剂在使用前无挥发、无污染，然后传递至核酸提取（二区）或暂存4。C冰箱备用。如实验室计划保存预装8连管或96孔PCR反应板，应验证预配试剂在保存温度和时间条件下，其性能指标的稳定性，否则应现配现用。4）在新冠病毒核酸扩增试剂配制记录表（模板见附件2）中，填写配制试剂的品牌和批号、配制日期和时间、配制数量和人员等信息。同时，将上述试剂信息填写新冠病毒核酸检测流程记录单（模板见附件3）,并传递到样本前处理区。建议实验室针对每一批号试剂预制新冠病毒核酸检测流程记录单。2 .样本前处理（样本接收区或二区）。1）样本接收人员与样本运送人员核对样本信息，双签字确认样本数量等信息。样本接收数量不能超过实验室要求报告时间内的最大检测能力。2）样本签收人员应采取二级个人安全防护，在生物安全柜或负压实验室打开样本转运箱、消毒、检查样本包装是否有漏液等不合格情况。3）签收人员将初判合格的样本拆袋，震荡混匀，扫描采样管上条码编号录入实验室信息系统，并将扫码签收后的样本在96孔样本架上依次排放，静置10分钟，防止气溶胶的形成。同时，将检测板号、样本布板信息填写在新冠病毒核酸检测流程记录单上，随样本一起进入核酸提取环节。4）在样本初判和签收过程中识别到漏液、无拭子、无条码、重码、条码模糊、条码横贴等不合格样本，应填写新冠病毒核酸检测不合格样本登记表（模板见附件4）,并第一时间通知运送和采样机构（部门）相关人员。漏液样本应统一消毒、收集，按医废流程处理，重新采样检测，其他不合格样本建议妥协接受并检测。3 .核酸提取（二区）。1）用记号笔在提取预装板和洗脱预装板正侧面标注检测板号，然后在生物安全柜内，按照核酸提取试剂说明书的加样体积，将排架样本按新冠病毒核酸检测流程记录单的顺序用移液器加入核酸提取预装板。也可用自动分杯加样系统，其操作程序见仪器设备说明书。2）样本加完后，再加3个阴性质控（建议生理盐水、采样管保存液、或二区生物安全柜/核酸提取仪环境监测样本）和1个第三方弱阳性质控。加样过程注意核对样本顺序和加样量，切忌漏加、错加、多加或少加。3）根据核酸提取仪说明书，正确安装洗涤板、洗脱板、磁套，将加完样本的核酸提取预装板放入核酸提取仪相应位置并确认。如核酸提取仪有复位功能，点击复位按钮，核对并运行核酸提取程序。如实验室使用全自动核酸提取系统，其操作程序见仪器设备说明书。将新冠病毒核酸检测流程记录单放置核酸提取仪旁，并确认核酸提取仪正常运行。4）提取程序运行完成后，将核酸洗脱板从核酸提取仪拿出，在生物安全柜内根据核酸扩增试剂说明书的加样体积，通过移液器（如：8通道，12通道）或自动化加样设备将提取的核酸加至8连管或96孔PCR反应板，检查液面的一致性。5）将8连管盖上管盖/或96孔PCR反应板封膜，瞬时离心（离心时注意8连管的位置顺序和离心机配平），然后连同新冠病毒核酸检测流程记录单传送至核酸扩增区。6）从核酸提取仪取出废弃预装板，用封口膜密封后丢弃。建议将原始标本和核酸洗脱板封膜保留至报告发放后，阴性标本和核酸洗脱板按医废处理，阳性标本按要求送当地疾控中心或在实验室保存至规定时间后高压处理。4 .核酸扩增（三区）。1）根据所用核酸扩增试剂说明书，设置荧光PCR仪的扩增程序，并以核酸检测项目、扩增试剂品牌和类型（如常规、快检等）命名扩增程序文件，方便调用（如：新冠-XX品牌-常规）。2）选择对应的扩增程序，在荧光PCR仪样本编号界面输入新冠病毒核酸检测流程记录单上的标本编号和质控类型，保存该扩增批文件到月度文件夹，方便查找。建议扩增批文件命名方式为：核酸检测项目-扩增试剂品牌年月日-批次（样本号段）（如：新冠-XX品牌-20221123-P8（0101-0192）。3）确认8连管盖紧或96孔PCR反应板封口膜完全密封后将其放入荧光PCR仪，并核对扩增批文件中的样本位置和信息与新冠病毒核酸检测流程记录单一致后，运行扩增程序，同时确认荧光PCR仪开始正常运行。4）扩增程序结束后，及时将荧光PCR仪中的8连管或96孔反应板取出，放入黄色医废袋外送集中处理。切勿在实验室内打开管盖/封口膜、或进行高压处理，以防止PCR扩增片段污染实验室。5 .扩增结果判读。1）扩增程序结束后，参照荧光PCR仪操作手册，运行扩增数据分析程序，并评估分析结果。如程序自动设置的基线和阈值不合理，则需手动调节。其中，基线设定原则：a.基线起始循环数应避开扩增开始时不稳定的几个循环，b.基线结束循环数应在指数扩增期前，c.基线应选择比较平坦区域；阈值设定原则：a.阈值一般置于扩增曲线的指数扩增初期，b.阈值荧光信号高于阴性质控。2）查看三个阴性质控扩增结果，内标是否有典型扩增曲线（外源性内标试剂有典型扩增曲线，内源性内标试剂应无扩增曲线），靶基因是否有扩增曲线，综合评价阴性质控是否在控。3）查看弱阳性质控孔扩增结果，内标是否有扩增曲线（视第三方质控品而定），靶基因是否有典型扩增曲线，靶基因CT值是否在可控制的范围，评价弱阳性质控是否在控。4）查看所有样本的内标扩增曲线，判断是否有内标离群和内标未起的情况，评价采样质量和检测质量。5）三阴一弱阳性质控在控，被检标本内标有典型扩增曲线，无离群CT值，靶基因无扩增曲线，可判读为阴性结果。6）三阴一弱阳质控在控，排除采样（疫苗/环境）污染,排除实验室（阳性样本/弱阳性质控/扩增产物）污染，排除非特异信号，被检标本靶基因呈典型扩增曲线，可判读为阳性结果，并报告CT值。7）三阴一弱阳质控在控，被检标本单靶基因有扩增曲线，则根据试剂盒说明书进行判读。如果此单靶基因阳性可报告新冠病毒核酸阳性，在双样本、双试剂复查阳性后可报单靶标阳性及CT值。8）如出现失控（阴性出现扩增、弱阳性无扩增、所有标本内标无扩增或大量离群），根据原因分析，去除原因（如核酸污染、质控品降解、仪器故障等）后，应采用原提取核酸或原始标本对该批次进行复查。如个别标本内标无扩增或离群，单靶基因阳性、弱阳性、异常扩增曲线、阳性结果，可采用原提取核酸、原始标本，必要时重新采样，双试剂复查。具体原因和复查方案可参照下表：新冠病毒核酸检测复查方案复查情况可能原因复查方法内标无扩增标本采集问题重新采集标本标本内有抑制物分析原因，稀释复查样本未充分混匀分析原因，充分震荡混匀后重新提取核酸提取问题分析原因，重新提取核酸扩增问题分析原因，重新扩增阴性质控失控阳性标本的污染实验室去污染，重新提取扩增弱阳性质控的污染实验室去污染，重提扩增、换试剂扩增扩增产物污染实验室去污染，重提扩增、换试剂扩增试剂污染分析原因，换试剂批号弱阳性质控失控质控品问题更换质控品核酸提取问题重新提取核酸核酸扩增问题分析原因，重新提取或扩增扩增试剂问题更换扩增试剂仪器问题分析原因，排除故障单靶阳性单基因阳性重采样本双试剂复查弱阳性感染初期或恢复期双试剂复查采样污染重新采样复查实验室污染实验室去污染，重提扩增、换试剂扩增异常扩增曲线仪器问题分析原因，排除故障核酸提取问题分析原因，重新提取核酸扩增问题分析原因，重新扩增样本问题重新采样复查双靶标阳性感染期换一种扩增区域不同的试剂复查采样污染重新采样复查实验室污染实验室去污染，重提扩增、换试剂扩增5.结果报告。1）新冠病毒核酸检测报告（模版见附件5）内容应至少包括患者信息、样本信息、检验项目、检验结果、检测方法、检测限、检测人员、审核人员、情况说明等。可采用纸质、快递、网络或信息化系统等形式发放新冠病毒核酸检测报告，结果全国互认。2）发热门诊、急诊患者，应在6小时内报告核酸检测结果；对于普通门诊、住院患者及陪护人员等人群，原则上在12小时内报告结果；对于“愿检尽检”人群，一般在24小时内报告结果。实验室应当为受检者出具检测报告，并告知其查询方式，不得以任何理由不出具检测报告。3）阳性结果，经复查出具报告，填写新冠病毒核酸阳性结果记录表（模板见附件6）,并立即上报实验室负责人,由实验室负责人上报相关部门和领导，必须在报告出具2小时内上报国家和当地卫生疾控部门。混采阳性标本应根据各地区规定，由相关部门和实验室完成单采追阳。三、新冠病毒核酸检测质量控制（一）室内质量控制。为监测检测系统的稳定性，及时发现采样、仪器设备、试剂耗材、人员操作等问题导致的系统误差，新冠病毒核酸检测采用内源/外源性内标，每批次1个弱阳性质控和3个阴性质控样本作为质量控制策略。内标应有典型扩增，阴性质控应无靶基因扩增。对弱阳性质控应针对每个检测系统（可以荧光PCR扩增仪为主），记录每批次弱阳性质控CT值，绘制质控图，利用质控规则（晨、22s）分析和判断是否在控，以保证新冠病毒核酸检测结果的准确、可靠。L内标（监测假阴性）。1）内源性内标可监测样本采集（单采）、核酸提取过程和核酸扩增过程是否正确。2）外源性内标可监测酸提取过程、核酸扩增过程是否正确。2 .阴性质控（监测假阳性）。建议实验室使用生理盐水、实验室环境采样监测实验室检测流程、环境、仪器设备的核酸污染、样本污染。3 .弱阳性质控（监测检测能力）。建议实验室使用第三方假病毒质控品稀释到L5-3倍最低检测限作为弱阳性质控，监测检测系统的稳定性和可靠性。勿使用高浓度质控品，尤其是DNA质粒，避免造成实验室严重污染。（-）室间质量评价。室间质评是外部监测核酸检测质量，发现检测系统缺陷的重要途径。实验室应常态化参加国家级或省级临床检验中心组织的新冠病毒核酸检测室间质评。检测量大和承担重点人群筛查任务的实验室，要适当增加室间质评的频率。不按要求参加室间质评、室间质评结果不合格，或检测结果质量问题突出的，不得开展新冠病毒核酸检测。附件：1.新冠病毒核酸检测系统性能验证/确认报告（模板）2 .新冠病毒核酸扩增试剂配制记录表（模板）3 .新冠病毒核酸检测流程记录单（模板）4 .新冠病毒核酸检测不合格样本记录表（模板）5 .新冠病毒核酸检测报告（模板）6 .新冠病毒核酸阳性结果记录表（模板）新冠病毒核酸检测系统性能验证/确认报告（模板）新冠病毒核酸检测系统性能验证/确认报告是根据拟验证/确认试剂说明书的要求，由实验室工作人员完成，性能验证指标包括最低检测限和精密度。1 .检测系统。新冠病毒核酸检测系统包括采样管、核酸提取试剂、核酸提取仪、核酸扩增试剂、核酸扩增仪等。新冠病毒核酸检测系统检测方法荧光PCR法采样管（保存液）XX保存液，批号口单采口混采核酸提取试剂XX试剂，试剂批号核酸提取仪XX厂家，实验室仪器编号核酸扩增试剂XX厂家，试剂批号核酸扩增仪XX厂家，实验室仪器编号标准物质XX厂家质控品XX家稀释液口单采样本保存液口混采样本保存液口含新冠病毒核酸阴性混采样本的2 .最低检测限。验证/确认新冠病毒核酸检测系统ORFlab.N和E三个靶基因的最低检测限。将标准物质用实验室使用的采样管保存液稀释至厂家声明的检测限浓度，按标准操作程序进行核酸提取和荧光PCR扩增，在质量控制达到要求基础上，进行数据分析，所得结果如下。新冠病毒核酸检测系统最低检测限验证/确认报告项目名称ORFlabN基因E基因检测限5×102copiesml5×102copiesml5×102copiesml重复数（次）555检测结果（阳性百分比）100%100%100%判断标准重复5次100%阳性判断结论符合试剂说明书声明的要求。注：最低检测限以科学计数法表示，单位均为CoPieS/mlO3 .精密度。验证/确认新冠病毒核酸检测系统ORFIab、N和E三个靶基因的精密度。验证/确认选取检测限L5-3倍浓度水平假病毒（样本保存液稀释），按标准操作程序提取核酸和荧光PCR扩增，在质量控制达到要求基础上，计算CT值的变异系数，所得结果如下。新冠病毒核酸检测系统精密度验证/确认报告项目名称ORFlabN基因E基因样本号Ct值变异系数Ctfl变异系数Ct值变异系数135.341.08%33.920.76%33.160.68%234.8733.4133.77334.8633.4833.81434.6933.3933.71534.5033.2333.46635.4133.2033.30734.6333.0233.42834.633.1433.44934.5233.1633.221035.4533.3833.58判断标准试剂说明书声明：5%判断结论符合试剂说明书声明的要求。4 .验证/确认结论本性能验证/确认指标包括新冠病毒核酸检测系统的最低检测限和精密度，数据客观、真实、准确，结果符合试剂盒声明的要求，该系统可用于实验室新冠病毒核酸检测。时间:时间:时间：科室负责人（签字）：项目负责人（签字）：实验操作人（签字）：新冠病毒核酸扩增试剂配制记录表（模板）配制日期配制时间试剂品牌试剂批号试剂用量（盒）配制数量配制人96孔反应板（板）8连管（条）新冠病毒核酸检测流程记录单（模板）年月日样本批次号：检测板号：试剂准备（一区）提取试剂厂家：批号：扩增试剂厂家：批号：设备使用：超净工作台：正常口异常旋涡混合器：口正常口异常离心机：口正常口异常操作者：扩增分析（三区）1 .扩增仪编号：2 .开机自检及运行是否正常：口正常口异常3 .质控结果：阴性质控ORFlabNEIC弱阳性质控ORFlabNEIC样本ICCT值范围:4 .质控分析：口在控口失控（原因分析：_）失控处理：.5 .检测结果：口全阴口疑似复查口整板复查复查标本号:复查原因：操作者：样本核收（前处理区）质控浓度：（copies/ml）批号：厂家：样本排布方法：按下表数字序列排布；设备使用：生物安全柜：口正常口不正常离心机：口正常口不正常旋涡混合器：口正常不正常样本数量：起止编号：一操作者：核酸提取（二区）提取仪编号：开机自检及运行是否正常：口正常口异常操作者：123456789101112ABCDE阴性质控F阴性质控G阴性质控H弱阳性质控特殊情况备注：新冠病毒核酸检测不合格样本记录表（模板）日期条码号不合格原因处置情况采样点是否反馈记录人漏液无条码双条码条码模糊条码横贴无拭子其他协测妥检新样重采XXXXXXXXXX（实验室名称）新冠病毒核酸检验报告（模板）姓名（Name）:性别（Gender）：年龄（Age）：申请项目（OrderName）：病区(Section)：床号(Bed No)：靶标基因缩写结果Ct值参考区间检测方法检测限L新型冠状病毒ORFIab基因2 .新型冠状病毒N基因3 .新型冠状病毒E基因SARS-CoV-20RFlabSARS-CoV-2N gene SARS-CoV-2E gene性性性性性性附附附 8 8 7 3 3 3 > > >荧光PCR法荧光PCR法 荧光PCR法500拷贝/ml500拷贝/ml500拷贝/ml结论：新冠病毒核酸检测阴性（单采/混采）病历号(MediCaIRecordNo)：样本编号(SPeeimenNo)：样本类型(TyPeofSpecimen)：声明：1.此报告仅对本次送检样本负责。2 .检测结论根据试剂盒说明书声明的标准判断。3 .检测结果可能受到采样时间、采样部位、方法学限制等影响，结果需结合临床进行分析。申请医生:采集时间:接收时间:报告时间:检验者:审核者:联系电话：XXXXXXXXX实验室地址：XXXXXXXXXXXXXXXXXXX新冠病毒核酸阳性结果记录表（模板）检测日期条码号采样方式采样时间第一次（初筛）笫二次（复核）报告时间报告人单采混采样本来源扩增试剂结果（CT值）扩增试剂结果（CT值）ORFlabN基因E基因内标ORFlabN基因E基因内标