高产纤维素酶菌株的筛选.docx

高产纤维素酶菌株的筛选作者：周成徐磊肖新谢越汪建飞马忠友来源：安徽农学通报2016年第08期摘要：该研究从农田土壤中分离得到67株细菌，并从中选出一株高产纤维素酶菌株。将这些菌株接种到纤维素培养基上，在pH5.5和28°C的条件下，利用刚果红染色溶液进行染色后，测其水解透明圈与菌落的比值的大小，进行初步筛选。将这些初筛的菌株接种到培养基中进行摇床培养后，制得粗酶液，并分析竣甲基纤维素酶(CMC)活力测定和滤纸酶(FP)活力及-葡萄糖昔酶(BG)o在不同温度的条件下，对纤维素酶活力测定，最终筛选出曲霉A25(Aspergillussp.)这一株菌株，最适酶活温度为50C。产纤维素酶酶活力分别为：CMC酶活达2340.92U/mL；FP酶活达2.66UmL；BG酶活达164.72UmLo关键词：竣甲基纤维素酶；滤纸酶；-葡萄糖昔酶；曲霉A25中图分类号S154文献标识码A文章编号1007-7731(2016)08-22-04Abstract：67strainsofsoilbacteriawereisolatedformfarmland,fromwhichahigh-yieldingcellulasestrainwasscreened.Thesestrainswereinoculatedonthecellulosemedium,andapreliminaryscreeningwasconducted,inwhichwemeasuredhydrolysistransparentcircleandtheratioofthesizeofthecolonyunderpH5.5and28conditionsbyusingtheCongoRedStainingTurthcrmorc,theseselectedstrainswerecultured,andacrudeenzymeliquidwasextractedforanalyzingtheactivitiesofcarboxymethylcellulose(CMC),filterpaperenzyme(FP)and-glucosidase(BG).Underdifferenttemperatureconditions,theactivityofcellulasewasdetermined,andultimatelythisonestrainofAspergillusA25wasobtained.Itsgreatactivityisundertheconditionofoptimumtemperaturefor50*C.Producingcelluloseenzymeactivitywasasfollowing：CMCamountedto2340.92U/mL,FPactivityamountedto2.66U/mL,andBGactivityamountedto164.72U/mL.Keywords:Cerboxymethlcellulose；Fillerpaperenzyme；-glucosidase；AspergillusA25纤维素物质是地球上含量最丰富的碳水化合物1,而目前人类对纤维素的开发与利用还非常有限，因此如何更有效地开发和利用纤维素资源已成为当今世界的热门课题之一。目前，对纤维素的降解利用主要是用酸碱处理等化学手段，以及汽爆及蒸汽加热等物理手段2。生物法由于对设备要求低，分解后的产物易回收利用，以及对环境污染较小等特点而备受重视。纤维素是一个复杂酶系，根据其功能的不同可分为3类：作用于纤维素非结晶区的内切葡聚糖酶(CMC)；作用于无定型区切割糖昔键的外切葡聚糖酶(FP)；以及作用于纤维二糖的-葡萄糖甘酶(BG)3-5。协同作用才能将结构复杂的天然纤维降解。纤维素酶在食品、洗涤、纺织、饲料、造纸等方面具有广泛的应用和发展前景5。通过对本实验室保存的67株菌株进行初筛和复筛，A25这一株菌株是本次实验所筛选的，具有较高降解纤维素活力的菌株，本文对其纤维素酶的生产培养特性进行研究，对于了解其降解机制以及实际应用都有重要意义。1材料与方法1.1 材料从农田土壤中分离得到67株土壤细菌。1.2 实验方法1.2.1 DNS法标准曲线的制备称0.05g经105°C烘干至恒重的葡萄糖溶于少量蒸储水中，用蒸储水定溶至50OmL配制成浓度为50gmL的葡萄糖溶液。取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、LomL和1.2mL葡萄糖溶液再加入蒸镭水将体积配制至IOmL。再分别从中取2mL,再加蒸福水LomL再加DNS试剂2.0mL摇匀，置于沸水中煮沸5min,取出置与冷水中冷却到室温，测其OD530值C根据OD值，以葡萄糖浓度为纵坐标，吸光值为横坐标，到出直线回归方程(Y=aX+b)o122产纤维素酶菌株的培养在无菌条件下，将67株菌株接种到纤维素培养基中，放在培养箱里温度为28,培养48h。1.2.3 刚果红染色把培养好的霉菌用刚果红染色剂覆盖培养皿一层进行染色30mino然后用0.9%生理盐水冲洗23次，观察其透明圈的大小，并计算出H/C的比值即酶活，(酶活性二透明圈直径的值与菌落直径的比值)°根据比值的大小进行初步筛选。124粗纤维酶液的制备在无菌操作下，将初步筛选的7株霉菌分别接种到液体发酵培养基中，摇瓶培养34d,温度为28,转速为160r。1.2.5 纤维素酶发酵液的处理纤维素酶霉菌摇瓶培养好后，用循环水式抽滤机进行抽滤。将滤液转入到原三角烧瓶中，放入冰箱备用。126酶活力的测定采用DNS法(3,5-二硝基水杨酸比色法)6-7o127竣甲基纤维素钠(CMC-Na)酶活力测定以2.0mL20%(wv)竣甲基纤维素钠溶液为底物，用pH5.0柠檬酸缓冲液配制)。力口ImL稀释酶液于50C,恒温水浴反应30min,然后加入2mLDNS显色液，终止反应，煮沸5min,再放入冰水中冷却至室温。用722S分光光度计在530nm处测定光密度OD值，同时相同条件作空白样调零。128滤纸（FP）酶活力测定精确吸取4.0mL稀释酶液和LOmLPH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，置于试管中，加入新华5号滤纸条（1x3Cm）一条，滴入甲苯23滴防腐。40C反应24ho吸取上述滤纸酶液2.0mL加入蒸储水LomL2.0mLDNS显色液，终止反应。沸水煮沸5min,然后再放入冷水中冷却至室温。在53Onm处测定光密度OD值，同时相同条件下作空白调零。1.2.9 -葡萄糖酶（BG）活法测定取LOmL稀释酶液加2.0mLpH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液配制的1%的水杨酸溶液.50酶解30min,加入2.0mLDNS显色液，终止反应，于沸水中水浴5min,用冷水冷却至室温，在53Onm处测定其OD值，同时相同条件下作空白调零。1.4 滤纸崩溃实验取稀释酶液4.0mL和LOmLpH4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液置于试管中。（15×50cm）加入新华5号滤纸条（1x3Cm）一条，滴入甲苯23滴（防腐），于恒温箱内40C保温24h。观察滤纸崩溃情况，观测标准如下：+表示滤纸完全沉在底部，摇动试管后滤纸呈糊状；+表示滤纸完全下沉，摇后呈小片状；+表示滤纸沿底部呈毛状，摇后部分溶化；-表示滤纸直立完整无缺，摇后不溶化。1.5 还原糖含量的测定采用DNS法9测还原糖。2结果与分析2.1 高产纤维素酶菌株的初筛将67株菌株接种到竣甲基固体培养基中进行培养48h,用刚果红染色静止30min后测其H/C的比值，结果见表2o从本实验室保存的67株菌株中，将各菌株分别采用纤维素固体培养基进行富集培养并进行筛选，从中筛选出高产纤维素酶菌株。从表2这些菌株的透明圈的直径与菌落的直径比值大小可以看出，A25、A5、07、0809、D2、H7、HD的H/C比值较高，这7株产纤维素酶能力较强，红色水解透明圈较明显、较大，具有较高的纤维素酶活力。H/C是透明圈与菌落的比值，比值越大酶活越强。根据红色水解透明圈出现的快慢、大小可大致得出该菌株的产纤维素酶情况，这可作为初次判断的依据。通过表2的结果说明A25、A5、07、0809、D2、H7、HD7株菌株具有较高的酶活力。2.2 葡萄糖标准曲线的绘制参照1.2.1所描述的方法制备出标准葡萄糖曲线（图1）,根据标准葡萄糖曲线求出直线回归方程y=00034x-0.505,R2=0.9968（y：葡萄糖浓度，x：OD530的值），通过直线回归方程可以计算纤维素酶酶促反应中产生葡萄糖的浓度，从而根据酶活力单位定义算出酶活。2.3 高产纤维素酶菌株的复筛挑选上述试验中滤纸酶活性较高的7个菌株进行进一步试验，将所获得的菌株A25、A5、07、0809、D2、H7、HD菌株接到液体发酵培养基中进行摇床发酵培养后，在获得发酵液的基础上制得粗酶液。测定其滤纸酶活、CMC酶活和-葡萄糖昔酶活。各菌株均设3个处理，取其平均值，如表3。2.4 温度对酶促反应的影响温度对酶促反影响的原因主要有以下2个方面，一是温度对酶蛋白稳定性的影响，即对酶热变性失活作用，二是温度对酶促反应本身的影响，其中可能包括影响酶和底物的结合，影响VmaX,影响酶和底物分子解离基团的pK,影响酶与抑制剂、激活剂或辅酶的结合等8。吸粗酶液2mL和2mLDNS和ImL蒸镭水加入试管分别于40、50、60、70和8（C不同水浴锅中处理30min后，对菌体的酶活进行检测，其结果见图2o由图2可见，反应温度对菌株A25的酶活有显著影响，其最适酶活温度为50,当水浴处理温度高于50C或低于50时，该菌株A25酶活减弱，但是培养液仍具有较高的纤维素酶活力；同时也表明该菌株所产的纤维素酶具有较高热稳定性。可见，50所测得的酶活力最高，即此酶的最适酶活温度为50Co3讨论3.1 高产纤维素酶菌株的初筛纤维素在纤维素酶的作用下水解成纤维二糖和葡萄糖，水解后的糖类与刚果红染料形成红色沉淀，使产酶菌株的菌落周围出现清晰的红色水解圈，根据水解圈的大小可粗略的估计菌株产酶的情况，然后选取透明圈较大的菌株进行接种。刚果红是对纤维素酶进行初步筛选的试验方法，实验方法比较简单。通过它可以使纤维素固体培养基上的菌种的代谢产物形成浅红色水解透明圈。用刚果红染液覆盖培养皿一层静止染色30min,纤维素酶菌株产纤维素酶越多，产生的红色水解透明圈越大，产纤维素酶速度越快，浅红色水解透明圈出现的越早。虽然水解透明圈H/C的比值大小直接反映了酶活水平的高低，但不能完全代表菌株产酶能力，不能定量说明该菌株产纤维素酶的能力。也有研究表明液体样品的酶浓度与透明圈的直径（下转127页）（上接24页）成线性关系，可以对酶活进行初步定量10。3.2 高产纤维素酶菌株的复筛已知纤维素酶的作用方式：Co酶是使天然纤维素晶体分链，起一个分离和水合作用，从而使天然纤维素裂解成为直链纤维素；而Co酶虽不能水解天然纤维素，但能水解直链纤维素的PL4-葡萄糖甘键生成纤维二糖，纤维二糖再经-葡萄糖昔酶水解成为葡萄糖。前人研究认为，纤维素的降解关键是滤纸酶活的高低，再结合P-葡萄糖首酶活，而CMC酶活只作参考。通过对7个菌株发酵液的滤纸酶活、CMC酶活、P-葡萄糖首酶活进行测定，初步筛选出产纤维素酶活力较高的A25菌株。初步试验表明，在50C反应时间30min,pH5.5时A25菌株产生的纤维素酶的活性有较大提高。建议对A25进行进一步的优化试验，以探明其最适的产酶条件，或对其进行进一步的诱变，以提高其酶活性应用于生产实践。3.3温度对纤维素酶活性的影响从粗酶液中吸粗酶液2mL和2mLDNS和ImL蒸播水加入试管中，在不同的水浴温度下水浴处理30min后，对菌体的产酶量进行检测。为了确定酶活的最适温度，通过测408（C不同温度下的实验确定酶活，不同培养温度对纤维素酶有不同的影响，结果表明，曲霉A25水浴处理在4(C时酶活力表现较低，50时酶活力达到最大值，水浴处理温度超出50时酶活力逐渐变小。对于纤维素酶活的最适温度为50,即纤维素酶产量的最适温度在50Co参考文献lMichaelEH1MarkFR,CharlesE.CellulaseforcommodityproductsfromcellulosicbiomassJj.Curr.Opin.Biotcch.1999.10(4)：358-364.2Beltrame,CamitiP,VisciglioA,etal.Fractionationandbioconversionofsteam-explodedwheatstrawJ.BioresounTechnol.,1992,39：165-1871.3任立伟.纤维质酒精发酵的菌种选育及发酵条件的研究D.长春：吉林农业大学，2003.4王巧兰，郭刚，林范学.纤维素酶研究的综述J湖北农业科学，2004,3：14-19.5JBhatMK-CellulasesandrelatedenzymesinbiotechnologyIJJ.Biotcchnol.Adv.,2000,(18)：355-383.6赫特尔马赫B.酶的测定方法M.钱嘉渊，译.北京：中国轻工业出版社，1992：102-119.7格拉泽AN,二阶堂弘.微生物生物技术M.陈守文，喻子牛，译.北京：科学出版社，2002：55-56.8诸葛健，王正祥编著工业微生物实验技术手册M.北京：中国轻工业出版社，1994.9张惟杰.糖复合物生化研究技术M.2版.杭州：浙江大学出版社，1999：73-75.10TeatherRM,WoodPJ.Useofcongored-polysaccarideinteractioninenumerationandcharacterizationofCellulilyticbacteriafromthebovinerumenJ.AppLEnviron.Microbiol,1982,38：148-158.(责编：张宏民)表1标准葡萄糖曲线的制备标准序号浓度(molL)加葡萄糖液(molL)加蒸储水量(molL)O001012000.29.822400.49.632800.69.443200.89.253601.0964001.28.874401.48.6表2刚果红透明圈比值结果菌株H/C比值菌株H/C比值菌株H/C比值AS2.5±0.508091.58±0.14AMI.37±0.03O62.35±0.31O51.15±0.09B11.37±0.06D31.9±0.IA332.27±0.73O71.48±0.07H73.4±1.15Z41.28±0.19D81.41±0.30Z273.21±0.11A221.37±0.08H51.26±0.06D62.05±0.30XiF1.80±0.09Ais1.39±0.10YB82.13±0.40A281.34±0.03卜41.44±0.14IIQ413.43±0.15A131.60±0.28C11.72±0.10D131.17±0.12D141.71±0.17O51.23±0.13A252.18±0.06D41.70±0.22F11.24±0.01X-1K2.03±0.12H11.30±0.18O31.45±0.08D91.6±0.45F31.89±0.05D131.30±0.04O21.32±0.07HD1.67±0.06C21.67±0.20H61.67±0.17HM1.7±0.35403.64±0.28D134.13±0.70A121.3±0.0708091.98±0.62D23.3±1.3()B21.46±0.18A311.62±0.19Z0191.28±0.19Al1.57±0.0806062.71±0.30O11.53±O.O5A211.39±0.17H21.49±0.10C32.59±0.33X-3K2.15±0.22D181.22±0.0506272.47±0.17F22.03±0.31A252.83±0.76D52.74±0.38A1.31±0.04C1161.54±0.24D91.67±0.90Cin1.58±0.09A271.91±0.10D6O1.43±0.06- - IlI I - z .2.O.8.6.4.2O L LO.O.O.。50100150200250300350400450500吸光值图1DNS法葡萄糖标准曲线表3纤维素酶菌株复筛结果菌株CMC酶活(WmL)FP酶活(WmL)BG酶活(WmL)40814.29±166.161.64±0.2350.82±1.31D22977.22±255.302.09±0.8169.44±1.0008092462.71±313.812.38±0.47156.63±5.29Azs2340.93±289.652.66±1.37164.72±28.87As1575.35±219.941.67±0.25279.40±24.31A3756.93±32.071.59±0.1878.75±5.23Z27656.08±46.421.58±0.20111.94±28.06HD1383.31±158.211.46±0.1951.69±1.21H62097.33±162.971.45±0.1087.45±12.17D5639.33±18.111.39±0.1551.72±1.97XiF816.22±37.021.30±0.7354.46±2.80H72810.38±351.702.33±0.15166.52±8.66D11649.78±138.392.21±0.3273.44±1.172O22206.89±311.597.01±2.1353.56±3.131600图2纤维素酶活性和温度之间的关系