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2023细胞外囊泡与肠道菌群相互作用在炎症性肠病中的研究进展摘要：炎症性肠病(IBD)是一种肠道慢性炎症性疾病，确切的病因和发病机制尚不明确，目前认为肠道菌群在疾病进程中发挥重要作用。细胞外囊泡(EV)是由多种细胞释放的具有脂质双分子层的纳米级囊泡，作为细胞间通讯的重要介质，参与机体的各种生理病理过程。近年来许多研究发现，EV与肠道菌群相互作用参与IBD的发生、发展，并在诊断、治疗和预后中显示出了巨大的临床应用潜力。本文将以EV与肠道菌群-宿主之间的相互作用为切入点，探讨不同来源的EV在IBD中的作用机制，以期为IBD的诊断与治疗提供新思路。炎症性肠病(inflammatoryboweldisease,IBD)是一种慢性且无法治愈的终身性疾病,包括溃疡性结肠炎(UICeratiVecolitis,Ue)和克罗恩病，病因和发病机制尚不明确，普遍认为是遗传易感性、环境、微生物和免疫因素相互作用的结果口。越来越多的证据表明，肠道菌群在IBD的发生、发展过程中发挥重要作用。IBD患者普遍存在肠道菌群失调，虽然已经开展了多种治疗肠道菌群失调的方案，如通过饮食、益生菌、益生元、合生元、粪菌移植(fecalmicrobiotatransplantation,FMT)等方法恢复IBD患者的肠道微生态，并显示出一定效果2,但IBD的诊断、治疗和预后仍面临巨大挑战。细胞外囊泡(extracellularvesicle,EV)是由细胞分泌的具有脂质双分子层的封闭球体，其可将小分子物质转移到其他细胞。研究发现,EV具有将小分子物质递送至宿主细胞，进而参与宿主与肠道菌群相互作用的功能引。在IBD患者中，EV可以发挥调节肠道免疫稳态，恢复肠黏膜屏障完整性，以及重建肠道微生态的作用，显示出巨大的潜在临床价值4o本文将对EV在IBD中的作用机制进行综述，着重探讨EV与肠道菌群-宿主之间的相互作用。一、肠道菌群在IBD中的作用人类肠道中存在着数以亿万计的微生物，主要由细菌组成，也包括真菌、病毒、古生菌和原生动物，与人体保持共生关系。肠道微生物群作为一个”隐藏的器官”，广泛参与机体各种生理病理过程，如消化吸收、能量代谢、免疫反应等。肠上皮细胞通过分泌黏液层充当宿主的物理防御层，保护底层组织免受共生菌或致病菌的侵害，并为细菌提供结合位点和能量来源5。由于肠道屏障的存在，肠道菌群主要通过其分泌的代谢产物、EV等间接作用与宿主交流6。目前研究已经证实肠道菌群参与IBD的疾病进程，针对IBD微生态病因学研究主要集中在以下3个方向：持续病原体理论、细菌过度移位理论和生态失调理论。持续性病原体理论认为IBD可能是由肠道病原体如鸟分枝杆菌副结核亚种、艰难梭菌和黏附侵袭性大肠埃希菌(Escherichiacoli,E.Coli)持续感染引起的;细菌过度移位理论认为肠道菌群在肠道屏障上的过度移位是引发IBD的原因；生态失调理论认为有益菌与致病菌之间的平衡失调会导致IBD7°这3种理论并不冲突。研究发现，IBD患者具有特殊的微生物特征，主要表现为肠道菌群多样性降低，变形菌门、放线菌门等致病菌丰度增高，厚壁菌门、拟杆菌门等有益菌丰度降低，产短链脂肪酸(ShOrt-ChainfattyacidzSCFA)的细菌如普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)x人罗氏菌(ROSebUriahominis)等减少8o在IBD中除了肠道菌群的组成和功能发生改变外，相关代谢产物也发生广泛改变，肠道菌群及其产生的SCFA、胆汁酸、色氨酸等代谢产物通过调节肠道免疫反应、屏障功能、黏膜愈合、能量代谢等参与IBD进程9。因此，治疗肠道菌群失调、重建肠道微生态对于改善IBD至关重要。二、EV的分类、成分与功能1983年，Pan和JOhnStOne10的研究首次发现转铁蛋白受体存在于网织红细胞释放的囊泡上，后来该囊泡被命名为EV。EV在动物、植物、微生物中广泛存在，作为细胞间通讯的一种新模式参与机体的病理生理过程,近年来引起广泛关注。EV根据大小、形成过程或功能主要分为外泌体(直径为30150nm)、微囊泡值径为1001000nm)和凋亡小体值径为5005000nm)3类,外泌体是由多泡体膜与细胞质膜融合释放的尺寸均匀的囊泡彳散囊泡直接来源于质膜,而凋亡小体是凋亡细胞分解的产物11。同一细胞产生的EV包含重叠的物质，很难对EV进行绝对准确的分类与分离，因此，本综述将其统称为EVo随着多组学技术的进步，EV的成分逐渐被揭示，EV中含有蛋白质、脂质、核酸、糖类和代谢产物等多种物质12。但EV的成分并非一成不变，在不同的病理生理条件下，如暴露于缺氧、酸性或炎症环境中，EV的组成可以发生改变4。虽然目前EV的作用机制尚未完全明确，但已有研究证明，EV除了参与机体正常生理和病理过程，也可以作为诊断及预后标志物、治疗靶点、治疗药物、药物递送平台在IBD等疾病中发挥临床价值13o三、EV介导肠道菌群-宿主相互作用对IBD的影响在肠道中微生物群与宿主间的相互交流并非直接接触，因此，微生物群和宿主来源的EV成为两者相互作用的关键因素。既往证据表明，EV可以与免疫细胞、肠上皮细胞、内皮细胞相互作用，通过调节免疫反应、维持肠黏膜屏障参与IBD的疾病进程14,15,而近年来随着对肠道菌群的深入研究，逐渐发现EV与肠道菌群相互作用在IBD中发挥重要作用。加拿大的一项研究对儿童IBD患者行结肠镜检查时，对从黏膜与肠腔交界处抽吸物中分离的EV进行了蛋白质组学检测，结果其在显示IBD患者与健康对照者之间存在显著差异，IBD患者EV中宿主防御蛋白(如产生活性氧化剂的酶等)升高，可加剧肠道氧化应激反应，导致肠道菌群失调，进而加剧肠黏膜炎症的发展16。因此，IBD中EV的变化与宿主-肠道菌群异常的相互作用有关，EV可以调节肠道菌群多样性，间接维持肠道稳态；相反，肠道菌群也可以通过分泌EV参与调节肠道免疫、屏障功能3。1 .EV调控肠道菌群参与IBD的发生、发展：研究发现，人类和小鼠粪便中肠上皮细胞和同源域特有蛋白X(homeodomainonlyproteinX)阳性细胞来源的EV中的微RNA可以进入细菌,如具核梭杆菌(FUSObaCteriUmnucleatumzFn)和E.coli,特异性调节细菌基因转录，进而影响细菌生长17,该研究说明宿主来源的EV可以发挥调节肠道菌群的作用。随着对EV研究的不断深入，人们发现不同来源的EV可以与肠道菌群相互作用参与IBD的发生、发展。Gu等口8研究发现，给予人骨髓来源的间充质干细胞EV可以显著增加乳杆菌(LaCtObaeillUS)等有益菌群，调节葡聚糖硫酸钠(dextransodiumsulfate,DSS)诱导的小鼠肠道菌群紊乱,改善结肠炎症。OCanSey等19研究表明，人脐带血来源的间充质干细胞EV可以重塑小鼠肠道菌群多样性，上调双歧杆菌(BifidObaCteriUm)、瘤胃菌科(RUminoeOCCaCeae)未分类(unclassifiedgroup)-014、嗜黏蛋白阿克曼菌(AkkermanSiamuciniphila,Akk)等有益菌的丰度,进一步行非靶向代谢组学发现,该类型EV通过改变代谢产物水平，上调与胆汁酸代谢相关的法尼醇X受体(farnesoidXreceptor),改善DSS诱导的小鼠结肠炎。新近研究显示，围产期组织脐带与胎盘来源的EV通过维持辅助性T细胞(Thelpercell,Th)17与调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)比例平衡，恢复肠道免疫微环境稳态，减轻DSS诱导的小鼠肠道炎症；同时，该研究也发现EV治疗后小鼠的肠道菌群多样性构成发生改变，E.c。Ii等条件致病菌丰度显著降低，有助于重塑肠道微生态20,该研究提示EV可能通过与免疫反应与肠道菌群之间相互串扰参与IBD的疾病进程。目前人体来源的EV与肠道菌群的相关研究主要集中在间充质干细胞来源的EV,两者相互作用的具体机制尚未完全明确,其他细胞(如肠道免疫细胞等)来源的EV主要通过调节先天性与适应性免疫反应来维持肠道稳态21,而其是否可以调节肠道菌群参与IBD疾病进程，未来需要继续探究。除了人体来源的EV可以调控肠道菌群参与IBD的疾病进程，其他来源如动物、植物等的EV也可以作为信使参与菌群-宿主相互作用。给予DSS诱导的结肠炎小鼠口服牛奶来源的EV能够显著下调促炎因子肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)-o口白细胞介素(interleukin,IL)-6水平，恢复Th17与Treg比例平衡，纠正菌群失调，增加杜氏乳杆菌(DubosieIIa)x双歧杆菌等有益菌丰度，同时通过抗炎代谢产物丁酸和乙酸水平来修复结肠炎22,23。姜黄是一种药食同源的中药，研究发现姜黄来源的EV可以降氐促炎因子的表达，促进巨噬细胞Ml型向M2型的转化，显著提高了Akkx乳杆菌、梭状芽泡杆菌属(CIoStridia)未分类-014和双歧杆菌的相对丰度，通过恢复肠上皮屏障，调节肠道微生物群的组成和相对丰度，以及重塑免疫微环境来缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症24。从发酵食品中分离出来的植物乳杆菌(LaCtObaCiIlUSplantarum)Q7来源的EV缓解了DSS诱导的小鼠结肠炎症,显著降低了促炎细胞因子IL-6、IL-邛、IL-2和TNF-CX水平J6S核糖体RNA测序显示植物学闲菌Q7来源的EV改善了肠道菌群失调,增加了菌群多样性,使变形杆菌丰度降低、双歧杆菌丰度增加25。因此，不同来源的EV对肠道菌群的调控作用不同，明确EV间的物质差异并鉴定发挥调控作用的特定物质，可能是未来EV相关研究的方向和目标。2 .肠道菌群来源的EV影响IBD疾病进程：作为近年来的研究热点，肠道菌群来源的EV主要发挥两种功能，参与细菌-细菌相互作用和介导细菌-宿主之间的通讯。越来越多的证据表明，肠道菌群来源的EV通过递送调节宿主信号通路的效应分子进入宿主细胞来介导微生物群的功能6。菌群来源的EV可以穿过肠上皮屏障进入肠黏膜固有层，并通过脉管系统进入其他器官和组织发挥作用，参与IBD患者的病理生理过程。研究发现，IBD患者与健康对照者粪便来源的EV组成存在显著差异26。动物实验证实，慢性结肠炎大鼠在急性期与缓解期粪便来源的EV中微RNA的组成存在显著差异,给予正常粪便来源的EV可以有效逆转DSS诱导的结肠炎小鼠肠道菌群失调，恢复肠黏膜屏障功能，减轻肠道炎症27。由此可知，肠道菌群来源的EV可以与肠道菌群-宿主相互作用，参与IBD的疾病进程。此外，根据靶细胞类型、宿主健康状况、细菌种类和EV的数量不同，EV发挥的作用也不尽相同。致病菌来源的EV通常携带毒力因子、毒素和免疫调节效应器，帮助细菌攻击宿主细胞，调节宿主免疫反应来逃避宿主防御系统28。Fn通常定植于人体口腔，很少存在于健康人的肠道中,而IBD患者肠道中存在Fno研究发现，Fn来源的EV通过微RNA-574-5p/半胱天冬酶激活及募集结合域轴调节自噬，上调促炎细胞因子水平，下调抑炎因子水平，破坏肠上皮屏障功能,加剧小鼠的实验性结肠炎29。而Liu等30则通过构建DSS诱导的小鼠结肠炎模型和巨噬细胞/Caco2细胞共培养等体内外实验发现,Fn来源的EV通过激活Fas相关死亡域(Fas-associateddeathdomain)-受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interactingproteinkinase1)-胱天蛋白酶3信号通路促进促炎巨噬细胞的分化并加速肠上皮细胞坏死性凋亡,加重肠道屏障损伤。从产肠毒素脆弱拟杆菌(enterotoxigenicBacteroidesfragiliszETBF)感染的HCT116细胞的上清液分离出的EV可以促进从人外周血单个核细胞分离出的CD4÷T细胞向Th17分化；动物实验表明，ETBF感染HCT116细胞产生的外泌体通过下调微RNA-149-3p促进Thl7分化，加重实验性结肠炎小鼠的体重减轻、结肠缩短和肠道损伤31。由此可知，致病菌来源的EV与宿主细胞相互作用，主要通过调控免疫反应和屏障功能加重肠道炎症，发挥致病作用。与致病菌相反,益生菌来源的EV通常可以抑制肠道炎症,发挥保护作用。研究发现，肠道共生菌多形拟杆菌(BaCteroideSthetaiotaomicronxBt)来源的EV通过上调IL-IO水平减轻实验性结肠炎小鼠的肠道炎症，体外实验用Bt来源的EV对小鼠骨髓单核细胞进行处理，与单用脂多糖刺激相比，抗炎因子IL-IO水平升高，促炎因子TNF-a水平降低，有利于维持宿主肠道稳态32。而Durant等33则发现Bt来源的EV可增加健康人结肠树突状细胞(dendriticcellDC)IL-IO的表达，但无法增加IBD患者结肠DC的IL-10表达,可能与IBD患者结肠中CD103+DC数量减少有关。新近研究通过单细胞测序数据和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析发现,在健康人与UC患者之间，Bt来源的EV作用的靶细胞存在差异，证实不同免疫细胞类型及机体健康状况都会影响EV与宿主的相互作用34。以上研究说明，EV对靶细胞的作用具有特异性，对不同细胞和机体发挥的作用也不相同。副干酪乳杆菌(LaCtObaCiilUSParaCaSei)来源的EV通过减少体重下降、保持结肠长度和降低疾病活动指数来减轻DSS诱导的结肠炎35丁酸梭菌(ClC)StridiUmbutyricum)来源的EV可以逆转肠道菌群失调，恢复菌群多样性，增加瘤胃梭菌属(RUminiClostridium)、瘤胃菌科未分类-01等产SCFA的有益菌水平，修复肠道黏液屏障与机械屏障,缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症36。Liang等37进一步研究表明，丁酸梭菌来源的EV以肠道菌群依赖的方式调节M2巨噬细胞极化，从而改善实验性结肠炎。鼠李糖孚Lff菌GG(LactobacillusrhamnosusGG)来源的EV通过抑制TolI样受体4-核因子-核甘酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3轴活化，降低促炎细胞因子TNF-IL-I区IL-6、IL-2水平，增加Akk、双歧杆菌等有益菌水平，重塑肠道微生态，改善实验性结肠炎小鼠肠组织损伤和结肠缩短38。Akk作为新一代菌引起广泛关注最新研究发现Akk来源的EV可以通过选择性融合直接促进有益菌如产酸拟杆菌(Bacteroidesacidifaciens)、Bt等的增殖，同时Akk来源的EV可以转移至派尔集合淋巴结(Peyer'sPatChe)并激活B细胞和DC诱发黏膜免疫球蛋白A(mucosalimmunoglobulinAzIgA)反应zEV治疗后IgA+粪便细菌计数显著增加，IgA可以发挥中和及排出致病菌的作用，降低致病菌丰度，有助于逆转结肠炎小鼠肠道菌群紊乱；此外，Akk来源的EV也可以增加紧密连接蛋白的表达并使黏液分泌增多，进而维持肠道屏障的完整性,从而改善DSS诱导的小鼠结肠炎症39。四、小结综上所述，EV介导的肠道菌群-宿主相互作用参与IBD的疾病进程并发挥重要作用。目前动物实验和临床研究表明，EV在IBD中显示出潜在的临床应用价值，但由于EV的多样性和复杂性，其在IBD中的作用尚未完全明确，鉴定EV发挥作用的有效成分及其与肠道菌群相互作用的具体机制需要进一步探究。虽然与EV介导的免疫应答和维持肠黏膜屏障相比，关于EV调节肠道菌群的研究较少，但作为参与调节肠道微生态的新兴研究领域，在未来可能成为IBD诊断、治疗、预后和预测疾病反应生物标志物的手段。