GB_T43163-2023苜蓿黄萎病菌溯源检测方法.docx

ICS 65.020.20CCS B 16OIBi中华人民共和家标底GB/T431632023苜蓿黄萎病菌溯源检测方法TraceabilitydetectionofVerticilliumalbo-atrumReinkeetBerthold2024-04-01 实施2023-09-07发布国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会本文件按照GB/TL1-2O2O标准化工作导则第1部分标准化文件的结构和起草规则的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口.本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院.本文件主要起草人：高瑞芳、章桂明、王颖、黄河清、向才玉.苜蓿黄萎病菌溯源检测方法1范围本文件描述了应用基因片段和生物信息学分析方法对苜蓿黄篓病菌进行溯源检源的方法。本文件适用于苜蓿黄萎病菌相关寄主植物材料中携带的苜蓿黄萎病菌的溯源检测.2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1邻接法neighbor-joining基于最小演化准则的迭代聚类方法.4方法原理苜稽黄萎病曲,拉丁名Verticilliumalbo-atrumReinkeetBerthOId,基本信息见附录A.溯源是利用对物种有进化和溯源价值的基因片段将核酸序列信息与来源地、寄主等来源信息进行相关性归类.检浏过程是应用生物信息学的分析手段缔选有效区分种内差异并且有效归类的基因片段或分子标记,荻得这些基因片段或分子标记的核酸序列，应用统计学手段完成核酸序列与来源地、寄主信息的主成分分析,完成不同来源地、寄主个体的群体分子系统进化关系和群体结构分析，基于基因序列的相似度和重梵率等，构建网络进化图.5仪器和试剂5.1 仪筋与试验用具仪器:恒温恒湿培养箱、超净工作台、-20匕低温冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸登白分析仪、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌钢.试验用具:解剖刀、离心管、黑子、移液器、冻存管、培养皿、酒精灯、接种针.5.2 试剂试剂：70%酒精、十六烷基三甲基浪化铁（CTAB）、PCRTaq豳、PCRTaq缓冲液、dNTP、DNA标记、无菊超纯水.马怜薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：200g去皮土豆切成小方块，加入1000mL无菌水，煮沸15min,四层纱布过渡得到漉液，浊液中加入18g葡萄糖、18g琼脂粉，加热溶解后将溶液定容至1000mL,分装至三角瓶中，121t高压蒸汽灭菌20min.6溯源检测方法6.1 D、A提取与鲤化对此菌进行液体培养或平板培养按附录B中CTAB法对正因组DNA进行提取，溶解于无菌超纯水中测定DNA浓度及纯度后，保存于一20T冰箱备用.内部转录间隔区（ITS片段）瞿结果利用通用序列编耕卷接编辑比对峰图舒坦了 PCR扩增（具体步骤见附录C3测序.涌序结果利用通用序列编辑分序列,/序结果是否有误，去掉两端引物部将拼接吁南 式或meg崎也对排婿的/沙妍用分子系统进化分析软件同时导入苜萧黄萎病N源NlJ排列文件mas格 备序列进行排列，排列结果见附录D.、H)¾¾ Btstra 检脸1 OOO 次折序列e 子列与已命 卜具有相同菌的分,:进行簪.1 拔物M乎列&已知溯源信源点的其他方向分支信 和寄主信息具有相关性关性则可判定待分VE图象出判定,在构的WF史.卜伟，同起源点不同如果同点无其他方向分支则无法判定待分析个寄主信息.6.2 基因片段或分子标记的扩增与测序样品与原始数据集8.1 样品保存分离得到的菌种转移至马铃薯葡萄储斜面培养基.置于4t黑暗条件下保存至少6个月.以备复验、谈判和仲裁.8.2 结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源，种类、时间实验的时间、地点、方法和结果等.并要有实验人员和审核人员签字.PCR凝皎电泳检测需有电泳结果照片序列需要保存电子文件.附镇A资料性）苜荷黄篓病菌相关信息A.1基本信息学名：VrerdCalbo-atrumReinke&Berthold分类地位：Fungi,PlectosphaerellaceBetGlomerellales*HypocreomyceticiaevSorciariomycetestAs-COmyCOta.A.2寄主范围揶威博AcerPseudoplatanus、中华狮猴桃ActinidiaChinensis、落花生rachishypogaea甜菜Betavugris、JK嘴豆Cicerri"Eum、西瓜CitrullusIanatusACucvmism。、罗马甜瓜Cucu-mi$melovx.Canatalupensis、黄瓜Cucumissatius、柠椽校EucalyptusCitriodora、段绿校Eucalyptusexserta、草莓Fragariaananaaa、大豆属Glycine、大豆Glycinemax、地中海岩黄黄Hedysarumcoro-narium、栽培向日葵Helianthusannuusvar.marcocarpus、律草属Hvm、啤酒花HumulusIUPUlUs、羽扇豆网Lupinus羽扇豆Lupinushirsutus,番茄Lycopersiconesculentum«苜蓿属MediCQg0、紫苜箱Medicagosaliva、草木扉属MelilOtUSJ草木属MeLilotuiSuaveolens、驴喜豆Onobry-chisViCiaebi0、菜豆属Phaseolus、豌豆属Pisum、豌豆Pisativum、石榴Punicagranatun、茄So-IanummeIongena¾WSolanumtuberosum、杂种车轴草Trifoliumhybridum、红车轴单Trifolium、白车轴草Trifoliumrepens、蚕豆ViCiQfaba.A.3地理分布北美洲：伯利兹、古巴、加拿大、美国、墨西哥、尼加拉瓜、萨尔瓦多、危地马拉.非洲：埃塞俄比亚、安哥拉、布隆迪、刚果、津巴布韦、马达加斯加、马拉维、摩洛舟、南非，尼日利亚、坦桑尼亚、突尼斯.南美洲：阿根廷、巴西、波多黎各、厄瓜多尔、哥伦比亚、圭亚那、秘鲁、委内瑞拉、乌拉圭、智利.欧洲：阿尔巴尼亚、爱尔兰、爱沙尼亚、安道尔、奥地利、白俄罗斯、保加利亚、比利时、冰岛、波兰、丹麦、德国、俄罗斯、法国、芬兰、荷兰、捷克、捷克斯洛伐克、克罗地亚、拉脱维亚、立陶宛、列支敦士登、卢森堡、罗马尼亚、马耳他、摩尔多瓦、摩洛哥、挪威、前萄牙、前南斯拉夫、瑞典、瑞士、塞尔维亚、塞尔维亚和黑山、圣马力诺、斯洛伐克、斯洛文尼史、苏格兰、乌克兰、西班牙、希船、闽牙利、意大利、英国.亚洲：土耳其、阿富汗、巴基斯坦、菲律宾、吉尔吉斯斯坦、柬埔寨、老挝、黎巴嫩、缅甸、日本、塞浦路斯、沙特阿拉伯、乌兹别克斯坦、叙利亚，伊朗、以色列、印度、中国.A.4症状病株初期上部叶片在温度较高时表现暂时性赛瑞，继而中下部叶片失绿变黄严重时变枯白色，表现整株萎悬症状，横切病株茎部，可见维管束变羯.发病后期，植株因生育停滞而严重矮化.小叶顶端出现V形黄变坏死斑块，严重时病叶卷缩扭曲；病株叶片枯萎,但茎部在较长时间内仍保持绿色；在潮湿条件下，枯死茎表现为病原凿轮枝状分生孜子梗覆盖，呈灰色.BICTAB法附录B（规范性）基因组DNA制备B.l.1试验器皿于121V.30min湿热灭菌或180t干热灭菌1hoB.1.2从培养E上刮取100mg左右CTAB抽提液.内.加入液弧充分研磨.加入4ml.预热的8.1.3 将禽心管放入勺伊丽楚g荡1次.8.1.4 加入等用移液器混匀1min,水浴）0minHC000,摩然后-20静置15min.0夕小心15min小心去除上清液用沉淀；加70%预冷酒地L15min,每隔3min5min振15min取上消液加等体枳舁B.1.54t燥；加入54L次放于通风处干纯度测纯度和1.I分析仪照公式（.,计算核酸的cone?ODgODjao计算结果保处吸光光度值.核酸的吸光度；飞光光度值,蛋门质的吸光度。扃Z（R级DNA溶液的Oil,/OD。附录C（资料性）溯源基因片段扩增流程CJPCR扩增C.1.1反应条件94t预变性4min,94IC变性30s.56t复性20s,72P延伸30s,40个循环；72I延伸7min.C.1.2引物序列前向引物：ITS】：5,-TCCGTAGGTGACCTGCGG-3,；后向引物JTS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'.C.1.3扩增体系及条件扩增反应的组成成分见表C.U三CJPCR扩增体系组分组分加祥疝IoXPCR较冲液5L2.5mmol/LdNTPs5L前向引物（IoMmWL）1L后向引物（10-molL）1L5ULTaq»0.3L模板DNA10ng补无水至50L反应用双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有苜蓿黄萎病幽的DNA作为模板，每个样品重究2次.C.2浏序与序列处理扩增产物经1%琼脂精凝胶电泳分离，使用DNA标记参照，羟DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，采用核酸蛋白分析仪对DNA进行定量检测.测序引物与PCR扩增引物相同,进行测序.附录D（资料性）已鉴定苜茴黄蓼病菌溯源序列排列结果>AB353342.1Japan-Potato/SolanumtuberosumccctttgtgacctattgttgcttgggctcgttcgcccggtActcagtctctttATTCAtaccaacgatacttctgagtgttcttacgaactattaaaattttaacaggatctcttgcTctagcatcgatgaagaacgcagcgaaagtoattgtagtgtgaattgcagaattcagtgaAtcatcgaatctttgaacgcacatggcgccttcagtatcctgggaggcatgcctgtccgagCgtcgtttcaaccctcgagccccagtggccggtgttgggatctacgtctgtaggcccttaaagcagtggcggacccgcgtggcccttcttgtagtaattAcagctcgcatcggagtcccGcagcacttgcctctaaacccctcaagcccgcctcgtgcgcaac2>DQ266223.1England-Hop/HumuluslupulusCcctttgtgaccatattgttgcttgggctcgttcgccgccggtActcagtctctttattcAtaccaacgatacttctgagtgttcttacgaactattaaaattttaacaggatctcttgcTCTAGCATCGATGAGACGCAGCGAAAGATTGTGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAAtcattoaatctttgaacgcacatggcgccttcagtatcctgggaggcatgcctgtccgagCgtcgtttcaaccctcgagccccagtggccggtgttgggatctacgtctgtaggcccttaaAagcagtggcggacccgcgtggcccttcttgcgtagtaattacagctcgcatcggagtcccGcagcacttgcctctaaacccctcaagcctocctcgtgcgcaac>GQ495790.1Canada-AlfalfaZMedicagosativaCcctttgtgaccatattgttgcttgggctcgttcgcgccgccggtactcagtctctttatttAtaccaacgatacttctgagtgttcttacgaactattaaaattttaacaggatctcttgcTctagcatcgatgaagaacgcagcgaaagcgattgtagtgtgaattgcagaattcagtgaAtcatcgaatctttgaatocacatggcgccttcagtatcctgggaggcatgcctgtccgagCgtcgtttcaaccctcgagccccagtggccggtgttgggatctacgtctgtaggcccttaaaAgcagtggcggacccgcgtggcccttcttgcgtagtaattacagctcgcatcggagtcccgcagcacttgcctctaaacccctcaagcccgccttgcgcac>F108476.1Canada-AlfalfaZMedicagosativaCcctttgtgaccatattgttgcttgggctcgttcgcgccgccggtactcagtctctttattTataccaacgatacttctgagtgttcttaaactAttaaaattttaacaggatctcttgCtctagcatcgatgaagaacgcagcgaaagcgattgtagtgtgaattgcagaattcagtgAatcatcgaatctttgaacgcacatggcgccttcagtatcctgggaggcatgcctgtccgaGcgtcgtttcaaccctcgagccccagtggccggtgttgggatctacgtctgtaggcccttaAaagcagtggcggacccgcgtggcccttcttgcgtagtaattacagctcgcatcggagtccCgcagcacttgcctctaaacccctcaagcccgcctcgtgcgcaac>¾rAB458830.1XinjiangfChina-Alfalfa/MedicagosativaCcctttgtgaccatattgttgcttgggctcgttcgcgccgccggtactcagtctctttattCataccaacgatacttctgagtgttcttacgaactattaaaattttaacaggatctcttgCtctagcatcgatgaagaacgcagcgaaagcgattgtagtgtgaattgcagaattcagtgAatcatcgaatctttgaacgcacatggcgccttcagtatcctgggaggcatgcctgtccgaGcgtcgtttcaaccctcgagccccagtggccggtgttgggatctacgtctgtaggcccttaAaagcagtggcggacccgcgtggcccttcttgcgtagtaattacagctcgcatcggagtccCgcagcacttgcctctaaacccctcaagcccgcctcgtgcgcaac>JQ629956.1Slovenia-Hop/HunuluslupulusCcctttgtgaccatattgttgcttgggctcgttcgcgccgccggtactcagtctctttattCataccaacgatacttctgagtgttcttacgaactattaaaattttaacaggatctcttgCtctagcatcgatgaagaacgcagcgaaagcgattgtagtgtgaattgcagaattcagtgAatcatcgaatctttgaacgcacatggcgccttcagtatcctgggaggcatgcctgtccgaGcgtcgtttcaaccctcgagccccagtggccggtgttgggatctacgtctgtaggcccttaAaagcagtggcggacccgcgtggcccttcttgcgtagtaattacagctcgcatcggagtccCgcagcacttgcctctaaacccctcaagcccgcctcgtgcgcaac>DQ825977.1USA-ApiutngraveolensCcctttgtgaccatattgttgcttgggctcgttcgcgccgccggtactcagtctctttattcAtaccaacgatacttctgagtgttcttacgaactattaaaattttaacaggatctcttgcTctagcatcgatgaagaacgcagcgaaagcgattgtagtgtgaattgcagaattcagtgaAtcatcgaatctttgaacgcacatggcgccttcagtatcctgggaggcatgcctgtccgagCgtcgtttcaaccctcgagccccagtggccggtgttgggatctacgtctgtaggcccttaaaAgcagtggcggacccgcgtggcccttcttgcgtagtaattacagctcgcatcggagtcccgcAGCACTTGCCTCTAAACCCCTCAAGCCCGCCTTGCGCAAC>AF364O15.1Belgium-HopZHumuIuslupulusCcctttgtgaccatattgttgcttgggctcgttcgcgccgccggtactcagtctctttattcAtaccaacgatacttctgagtgttcttacgaactattaaaattttaacaggatctcttgcTctagcatcgatgaagaacgcagcgaaagcgattgtagtgtgaattgcagaattcagtgaAtcatcgaatctttgaacgcacatggcgccttcagtatcctgggaggcatgcctgtccgagCgtcgtttcaaccctcgagccccagtggccggtgttgggatctacgtctgtaggcccttaaaAgcagtggcggacccgcgtggcccttcttgcgtagtaattacagctcgcatcggagtcccgcAgcacttgcctctaaacccctcaagcccgcctcgtgcgcaac>AY555954.1MiddleAsia-Cotton/Gossypiumspp.CcctttgtgaccatattgttgcttgggctcgttcgcgccgccggtactcagtctctttattcataccaatActtctgagtgttcttacgaactAttaaaattttaacaggatctcttgcTctagcatcgatgaagaacgcagcgaaagcgattgtagtgtgaattgcagaattcagtgaAtcatcgaatctttgaacgcacatggcgccttcagtatcctgggaggcatgcctgtccgagCgtcgtttcaaccctcgagccccagtggccggtgttgggatctacgtctgtaggcccttaaaAgcagtggcggacccgcgtggcccttcttgcgtagtaattacagctcgcatcagtcccAgcacttgcctctaaacccctcaagcccgcctcgtgcgcaac>AF364O14.1Netherlands-Tomato/LycopersiconesculentumccctttgtgacctattgttgcttgggctcgttcgcgccgcgtActcagtctctttattcAtaccaacgatacttctgagtgttcttatoaactattaaaattttaacaggatctcttgcTctagcatcgatgaagaatocagcgaaagcgattgtagtgtgaattgcagaattcagtgaATCATAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTTCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGGCgtcgtttcaaccctcgagccccagtggccggtgt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