JJF2089-2023全自动酶联免疫分析仪校准规范.docx

中华人民共和国国家计量技术规范JJF20892023全自动酶联免疫分析仪校准规范CalibrationSpecificationforFullyAutomatedELISAAnalyzers2024-04-12实施2023-10-12发布国家市场监督管理总局发布N帝JJF208920232全自动酶联免疫分析仪校准规范CalibrationSpecificationforFullyAutomatedELISAAnalyzers归口单位：全国生物计量技术委员会主要起草单位：中国计量科学研究院参加起草单位：中检（河南）计量检测有限公司河南省计量科学研究院黑龙江省计量检定测试研究院本规范委托全国生物计量技术委员会负责解释本规范主要起草人：盛灵慧（中国计量科学研究院）武利庆（中国计量科学研究院）参加起草人：丁峰元中检（河南）计量检测有限公司赵迎晨中检（河南）计量检测有限公司贾会（河南省计量科学研究院）丁海铭（黑龙江省计量检定测试研究院）周彤（黑龙江省计量检定测试研究院）目录引言(11)1范围(D2引用文件(D3术语和计量单位(D4概述(D5计量特性(2)6校准条件(2)6.1 环境条件(2)6.2 测量标准及其他设备(2)7校准项目和校准方法(2)7.1 加液体积示值误差和加液重复性(3)7.2 孵育温度示值误差(3)7.3 洗涤残留(4)7.4 吸光度示值稳定性(4)7.5 吸光度示值误差(4)7.6 吸光度重复性(5)7.7 吸光度通道差异(5)7.8 吸光度线性(5)8校准结果表达(6)8.1 校准结果处理(6)8.2 校准结果的测量不确定度(6)9复校时间间隔(6)附录A1990年国际温标纯水密度表(7)附录B校准原始记录格式(8)附录C校准证书内页格式(12)附录D吸光度示值误差测量结果的不确定度评定示例(13)引言JJF1071国家计量校准规范编写规则、JJFlOol通用计量术语及定义和JJF1059.1测量不确定度评定与表示共同构成支撑本规范制定工作的基础性系列规范。本规范中全自动酶联免疫分析仪检测器部分的计量特性和校准方法主要参考了JJG861-2007酶标分析仪。本规范为首次发布。全自动酶联免疫分析仪校准规范1范围本规范适用于吸光度测定原理的全自动酶联免疫分析仪的校准。2引用文件本规范引用了下列文件：JJG8612007酶标分析仪JJF1059.12012测量不确定度评定与表示JJF10712010国家计量校准规范编写规则YY/T15292017酶联免疫分析仪凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本规范。3术语和计量单位JJG8612007.YY/T15292017中界定的及以下术语和定义适用于本规范。3.1 酶联免疫分析enzymeIinkedimmunosorbentassay,ELISA将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，通过酶标记抗原或抗体与固相载体表面的抗体或抗原进行免疫反应，实现对目标物进行定性或定量检测的方法。注：酶联免疫分析通常将抗原或抗体吸附在固相载体上（包被），受检样本（含待测抗原或抗体）和酶标记抗体或抗原，按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原和抗体的复合物，固相载体上被结合的酶标记物的量与样本中待测物的量成一定比例。加入醐反应底物后，底物被酶催化生成有色产物，通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应。颜色反应的深浅与样本中相应抗体或抗原的量成比例O3.2 全自动酶联免疫分析仪fullyautomatedELISAanalyzer采用SS联免疫分析原理对样本进行定性和定量分析的仪器，其所有分析过程包括样品和试剂的加注、孵育洗板、数据测量、结果计算和输出等都实现了自动化。4概述全自动酶联免疫分析仪（以下简称“分析仪”）通常由液体分配单元、孵育单元、洗板单元、检测单元及计算机系统等核心模块组成。测定时仪器首先通过液体分配单元将受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤加到包被有抗体或抗原的固相载体（如96孔酶标板）的表面；接着将固相载体转移到孵育单元恒温孵育一定时间；孵育结束后将固相载体转移至洗板单元进行洗涤，将未结合的抗原或抗体洗去；然后加入显色底物并孵育显色，最后采用检测单元测定特定波长下反应液的吸光度，根据吸光度与标本中受检物质的量成一定的比例的原理进行定性或定量分析。5计量特性分析仪各项计量特性指标见表1。表1分析仪的主要计量特性指标序号计量特性计量特性指标1加液体积示值误差20pL：不超过±4%200L:不超过±1.5%2加液体积重复性20L:不超过2%200L不超过1%3孵育温度示值误差不超过±1.5。C4洗涤残留不超过5L5吸光度示值稳定性不超过±0.0056吸光度示值误差不超过±0.037吸光度重复性不超过1.0%8吸光度通道差异不超过0.039吸光度线性r0.996校准条件6.1 环境条件6.1.1 环境温度：Q530)°C;6.1.2 相对湿度：85%o注：上述条件与制造商的产品规定不一致时，以产品规定为准。6.2 测量标准及其他设备6.2.1 电子天平：分度值为0.0Img和0.1mg,级；6.2.2 温度计及温度测量仪：最大允许误差不超过±0.1。(：°6.2.3 计量标准器或标准物质：应使用计量标准器或经国家计量行政部门批准颁布的光谱中性滤光片标准物质，吸光度标称值分别为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0。标准物质或经计量校准后的光谱中中性滤光片吸光度0.01(k=2)6.2.4 纯水：电阻率达到18.2“。01%7校准项目和校准方法分析仪在正常工作条件下先进行仪器自检和清洗，校准前分析仪应提前开机预热30min以上。纯水在使用前平衡至室温并超声脱气处理，用温度计测量纯水温度并从附录A中查找到对应的密度。7.1加液体积示值误差和加液重复性将可密封容器（如500L带盖离心管）在分度值为0.0Img的电子天平上称量质量，去盖后放到分析仪板架的合适位置，控制样品针往该容器中加入20L平衡至室温的脱气纯水，立即盖上容器在电子天平上称量质量。根据公式（1）计算加液体积，重复测量6次，根据公式（2）计算加液体积重复性。取后3次测量结果根据公式（3）计算20L校准点的加液体积示值误差。重复上述过程，加液体积改为200L,计算200L校准点的加液体积示值误差。每一根加液针都按上述方法进行校准，并分别报告结果。(1)m-mO式中：V一加液体积，L;m容器和纯水的总质量，mg;m0容器质量，mg;p一室温下水的密度，g/mLoB（Vi-VH1Rv=-1×-×100%（n1¾V式中：RV一加液体积重复性，；Vi第i次加液体积测量结果，L;V6次加液体积测量结果平均值，L;n测量次数，n=6OV0-4->>iEv-×100%式中：VO-体积设定值，L;Vi后3次加液体积测量值，L;Ev加液体积示值误差，%。7.2 孵育温度示值误差将分析仪孵育温度设置为37.0°C,把温度测量仪的传感器放置在酶标板架上并关闭酶标仪仓门，平衡30min待读数稳定后，读取酶标板上有代表性的至少6孔（如B4、B8、Bl2、G4、G8、G12）的实际温度，每孔重复测量3次，根据公式（4）分别计算并报告上述代表性孔位的孵育温度示值误差。E,j=To-iJ（4）式中:j酶标板上有代表性的至少6孔；To孵育温度设定值，；Ti,jj孔第i次温度测量值，°C;Etjj孔孵育温度示值误差JC。7.3 洗涤残留取一块96孔酶标板，在分度值为0.Img的电子天平上称量其质量。设定洗涤程序为全板洗涤，用平衡至室温的脱气纯水逐行或逐列清洗，每孔清洗用量300L,无浸泡时间，重复清洗5次。清洗完成后，在分度值为0.1mg的电子天平上再次称量96孔酶标板的质量，根据公式（5）计算洗涤残留：式中：w一洗涤残留，L;r11一洗涤后酶标板质量，mg;m0洗涤前酶标板质量，mg;p纯水密度，g/mL7.4 吸光度示值稳定性选用492nm波长或仪器特有的专一波长，将吸光度标称值为LO的光谱中性滤光片平放在96孔酶标板的空板架上，以空气为参比，测量并记录仪器的初始吸光度示值,5min后记录吸收度示值一次，记录初始值Iomin后再次记录仪器示值。取后两次吸光度示值与初始值之差绝对值较大者按照公式（6）计算吸光度示值稳定性r:r=A-Ao（6）式中：r吸光度示值稳定性，无量纲；AO-初始时的吸光度，无量纲；A-5min和IOmin两次吸光度示值与初始值之差绝对值较大者，无量纲。7.5 吸光度示值误差依次选用405nm、450nm×492nm、62Onm波长或仪器特有的专一波长，将吸光度标称值分别为0.2,0.5,1.0,1.5,2.0的5块光谱中性滤光片同时平放在96孔酶标板的空板架上，以空气为参比，连续测量3次，依次记录仪器吸光度示值，并计算平均值。吸光度示值误差AA按公式（7）计算：13-A=j-jAi-AS=A-AS（7）,A三l式中：AA-吸光度示值误差，无量纲；Aj第i次测量的吸光度值，无量纲；A3次吸光度测量结果的平均值，无量纲；As吸光度标准值，无量纲。逐一报告405nm、450nm.492nm.62Onm或仪器特有专一波长下，不同吸光度水平的吸光度示值误差。7.6吸光度重复性选用45Onm波长或仪器特有的专一波长，将吸光度标称值为0.5或1.0的光谱中性滤光片平放在96孔酶标板的空板架上，以空气为参比，于固定的某一孔位重复测量6次，记录仪器吸光度示值，并计算平均值，按公式(8)计算RA表征吸光度重复性。(Ai-AERa=-1××100%(8)-(n1)式中：Ra一相对标准偏差，%；Ai第i次吸光度测量值，无量纲；A6次吸光度测量结果的平均值，无量纲；n测量次数，n=6O7.7 吸光度通道差异选用45Onm波长或仪器特有的专一波长，将吸光度标称值为1.0的光谱中性滤光片平放在96孔酶标板的空板架上，先后置于多个通道的相应位置，以空气为参比，测量并记录每一通道的至少6次吸光度值(例如A通道可测量A1-A6或A2A7),多个通道的差异结果报告用全部测量数据的极差值表示，按公式(9)计算吸光度通道差异6a:5a=AmaX-Amin(9)式中：AmaX一多个通道中测量结果的吸光度最大值，无量纲；Amm多个通道中测量结果的吸光度最小值，无量纲；6a一吸光度通道差异，无量纲。7.8 吸光度线性选用45Onm波长或仪器特有的专一波长，将吸光度标称值分别为0.2、0.5、1.0、1.5和2.0的光谱中性滤光片平放在96孔酶标板的空板架上，以空气为参比，每个滤光片重复测量3次取算术平均值。将测得的吸光度与相应滤光片的标准值按照公式(10)进行最小二乘线性回归并计算线性相关系数r作为吸光度线性的表征。(xi-×)(Yi-y)r=;(10)(Xj-口2xyj-y)2i三1i=1式中：r线性相关系数；Xi各个吸光度水平光谱中性滤光片吸光度的标准值，无量纲；x各个吸光度水平光谱中性滤光片吸光度标准值的平均值，无量纲；Vi各个吸光度水平光谱中性滤光片吸光度的测量值，无量纲；y各个吸光度水平光谱中性滤光片吸光度测量值的平均值，无量纲。8校准结果表达8.1 校准结果处理经校准后的分析仪应核发校准证书，校准证书应符合JJFlO712010中5.12的要求，并给出各校准项目名称和测量结果以及扩展不确定度。校准原始记录格式（推荐性表格）见附录B,校准证书内页格式（推荐性表格）见附录Ce8.2 校准结果的测量不确定度分析仪校准结果的测量不确定度按JJFIO59.1-2012的要求评定，校准结果测量不确定度评定示例见附录Do9复校时间间隔由于复校时间间隔的长短是由分析仪的使用情况、使用者、分析仪本身质量等诸因素所决定的，因此送校单位可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔，复校时间间隔建议不超过1年。附录A1990年国际温标纯水密度表g/mLt90oc0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9150.9990990.9990840.9990690.9990530.9990380.9990220.9990060.9989910.9989750.998959160.9989430.9989260.9989100.9988930.9988760.9988600.9988430.9988260.9988090.998792170.9987740.9987570.9987390.9987220.9987040.9986860.9986680.9986500.9986320.998613180.9985950.9985760.9985570.9985390.9985200.9985010.9984820.9984630.9984430.998424190.9984040.9983850.9983650.9983450.9983250.9983050.9982850.9982650.9982440.998224200.9982030.9981820.9981620.9981410.9981200.9980990.9980770.9980560.9980350.998013210.9979910.9979700.9979480.9979260.9979040.9978820.9978590.9978370.9978150.997792220.9977690.9977470.9977240.9977010.9976780.9976550.9976310.9976080.9975840.997561230.9975370.9975130.9974900.9974660.9974420.9974170.9973930.9973960.9973440.997320240.9972950.9972700.9972460.9972210.9971950.9971700.9971450.9971200.9970940.997069250.9970430.9970180.9969920.9969660.9969400.9969140.9968880.9968610.9968350.996809260.9967820.9967550.9967290.9967020.9966750.9966480.9966210.9965940.9965660.996539270.9965110.9964840.9964560.9964280.9964010.9963730.9963440.9963160.9962880.996260280.9962310.9962030.9961740.9961460.9961170.9960880.9960590.9960300.9960010.996972290.9959430.9959130.9958840.9958540.9958250.9957950.9957650.9957530.9957050.995675300.9956450.9956150.9955840.9955540.9955230.9954930.9954620.9954310.9954010.995370310.9953390.9953070.9952760.9952450.9952140.9951820.9951510.9951190.9950870.995055320.9950240.9949920.9949600.9949270.9948950.9948630.9948310.9947980.9947660.994733330.9947000.9946670.9946350.9946020.9945690.9945350.9945020.9944690.9944360.994402340.9943690.9943350.9943010.9942670.9942340.9942000.9941660.9941320.9940980.994063350.9940290.9939940.9939600.9939250.9938910.9938560.9938210.9937860.9937510.993716附录B校准原始记录格式仪器名称环境温度仪器型号环境湿度制造厂商校准日期出厂编号证书编号校准地点原始记录号送检单位名称校准依据送检单位地址送检单位联系电话校准人员核验人员计量标准器信息B.1外观检查8.2 加液体积示值误差和重复性(t=,p=gmL)12345620L纯水质量/mg体积L平均体积L加液体积示值误差/%加液体积重复性/%200L纯水质量mg体积L平均体积L加液体积示值误差/%加液体积重复性/%8.3 孵育温度示值误差温度设定值/测量点测量值1/测量值2/测量值3/平均值/示值误差/37.08.4 洗涤残留romgrmgp/g.mL1wL8.5 吸光度示值稳定性A起始AsminAlOminr8.6 吸光度示值误差和吸光度线性波长nm标称吸光度标准吸光度AiAA1234050.20.51.01.52.0（续）波长nm标称吸光度标准吸光度AiAA1234500.20.51.01.52.04920.20.51.01.52.06200.20.51.01.52.0450nm处吸光度线性：8.7 吸光度重复性n123456ARaA8.8 吸光度通道差异123456789101112ABCDE（续）附录C校准证书内页格式校准结果校准项目校准结果及不确定度加液体积示值误差加液体积重复性孵育温度示值误差洗涤残留吸光度示值稳定性吸光度示值误差吸光度重复性吸光度通道差异吸光度线性备注:附录D吸光度示值误差测量结果的不确定度评定示例D.1测量方法采用分析仪测量光谱中性滤光片标准物质，并与标准物质的标准值进行比较。D.2测量模型吸光度示值误差可由公式（D.1）给出：A=jAi-As=A-As（D.1）式中：AA-吸光度示值误差，无量纲；Ai第i次测量的吸光度值，无量纲；A3次吸光度测量结果的平均值，无量纲；AS吸光度标准值，无量纲。D.3合成标准不确定度计算公式依据u?=c2（×i）u2（×i）,则由公式（D.1）得:c（八）1(D.2)JAc(As)=-rr=-l(D.3)故输出量合成标准不确定度的完整奉i式应为：u?=u（八）2+u(As)2(D.4)Uc=u（八）2+u(As)2(D.5)D.4不确定度来源不确定度来源包括：a）吸光度测量重复性引入的不确定度U】；b）示值稳定性引入的不确定度U2；c）吸光度通道差异引入的不确定度Ih；d）吸光度测量分辨力引入的不确定度U/e）标准物质引入的不确定度U4；下面以一次分析仪检定为例具体分析其测量不确定度。在检定中吸光度标称值为0.2的光谱中性滤光片3次测量结果的分别为0.271、0.270、0.269;该标准物质的标准值为O271±UU10（A=2）。D5标准不确定母“WD.5.1测量结果平均值引入的不确定度uD.5.1.1吸光度测量重复性引入的不确定度U1选定一台分析仪，对光谱中性滤光片标准物质连续测量10次，得到一组测量值：0.271、0.269、0.269、0.270、0.271、0.269、0.271、0.270、0.271、0.269。则单次测量结果的标准差s(Ai):hX)2s(Al)=l,'10.00094(D.6)实际检定时在重复性条件下连续测量3次，以3次测量的算术平均值作为结果，则由测量重复性引入的标准不确定度为：Ui=s(Ai)/n=0.00094/30.00054(D.7)D.5.1.2示值稳定性引入的不确定度U2由于元器件的老化、零部件的磨损等导致分析仪计量特性随时间的变化，根据JJG8612007的要求，仪器示值稳定性要求±0.005,按均匀分布，则标准不确定度：U2=2=0.0029(D.8)D.5.1.3吸光度通道差异引入的不确定度U3分析仪的吸光度通道差异为0.004,则由吸光度通道差异引入的标准不确定度为：U3D _ 0.0042 3 = 2后=0.0012(D.9)D.5.1.4吸光度测量分辨力引入的不确定度U4仪器的分辨力为0.0OL认为是均匀分布，则由分辨力引入的标准不确定度为：0.001小U4=-=0.00029(D10)2JD测量结果平均值引入的不确定度UK为上述不确定度分量的合成，即：u=ui+ui+ui+ui=0.000542+0.00292+0.00122+0.000292=0.0032D.5.2标准物质引入的标准不确定度Ua5由标准物质引入的不确定度UAS可以根据标准物质证书提供的扩展不确定度Ua,和包含因子kA，根据公式(D.11)计算：UAS二兽(D.11)K式中：IJAS-光谱中性滤光片标准物质引入的标准不确定度，无量纲；UAs-光谱中性滤光片标准物质的扩展不确定度，无量纲；l<As-标准物质证书提供的包含因子，kA1=2o在检定过程使用的标准物质的标准值为0.271±0.010(k=2),则由标准物质引入的标准不确定度为：Uas=-=0.005(D.12)<.D.6标准不确定度一览表标准不确定度一览表见表D.lo表D.1标准不确定度一览表标准不确定度符号不确定度来源标准不确定度数值U1吸光度测量重复性引入的不确定度0.00054u2示值稳定性引入的不确定度0.0029u3吸光度通道差异引入的不确定度0.0012U4吸光度测量分辨力引入的不确定度0.00029Ua8标准物质引入的不确定度0.005D.7合成标准不确定度uc由公式(D.5)可得：uc=u(aT2+u(As)2=0.00322+0.0052=0.0060(D.13)D.8扩展不确定度U取k=2,则U=k×Uc=0.012