输血科红细胞意外抗体筛查和鉴定标准操作规程.docx

输血科红细胞意外抗体筛查和鉴定标准操作规程1、目的：规范实验室工作人员的操作程序，确保实验过程及结果的准确性与可靠性。2、范围：本规程适用于本实验室红细胞意外抗体筛查与鉴定试验操作。3、职责3.1工作人员进行红细胞意外抗体筛查和鉴定试验技术操作应熟练掌握。4、红细胞以外抗体筛查试验4.1基本原理受血者有输血史、妊娠史或短期内需要大量输血时应该按照有关规定进行抗体的筛查和鉴定。如条件允许抗体筛选试验最好在交叉配血之前进行，以便对患者抗体的早期确认及鉴定临床上有意义的抗体,避免一些可能的异常情况而造成病情的延误。4.1.1红细胞意外抗体概念意外抗体是指抗-A、抗-B以外的红细胞血型抗体。意外抗体有两种，包括同种抗体和自身抗体。自身抗体是指受血者体内产生的抗体，针对自己本身的红细胞抗原。这类抗体不仅仅与自身红细胞凝集，通常也与多数别人的红细胞发生凝集反应。如果抗体不是针对自身抗原，而是与同种异基因的红细胞发生反应，即与某些献血者的红细胞出现凝集反应，为同种抗体。ABO系统中的亚型，变异型的抗-A1和抗B抗体，也称为意外抗体。4.1.2红细胞意外抗体筛查方法所用检测方法必须能证实那些具有临床意义的不规则抗体。某种抗体是否具有临床意义取决于特殊临床状况和病人情况。如果某种特异性抗体能引起新生儿溶血病、明显的溶血性输血反应或使输入的红细胞存活时间缩短，即认为这种抗体有临床意义。在37或在抗球蛋白试验中反应的抗体比仅在室温或室温以下反应的抗体可能更有意义。抗体筛选所针对的抗体可以是IgM类，也可以是IgG类。IgG类抗体主要是经输血或妊娠等免疫刺激产生，在盐水介质中不能凝集而只能致敏相应抗原的红细胞，必须通过特殊介质才能使致敏红细胞出现凝集反应。因此检测的方法必须包括盐水介质检测法和特殊介质检测法如：白蛋白介质法、低离子强度介质法(LISS),酶技术、抗球蛋白试验、聚凝胺(polbrene)促凝技术和凝胶实验(Geltest)等。除盐水介质以外，可按抗体的血清学特点和实验室的具体条件选择其中一种方法。4.2盐水介质法4.2.1方法原理IgM类意外抗体可在室温盐水介质中与具有对应抗原的红细胞发生凝集反应，使用盐水介质法可以检测出受检者血清中是否存在IgM类意外抗体。4. 2.2仪器、试剂与耗材1）仪器：台式低速离心机、血型血清学专用离心机、阅片灯箱、显微镜、试管架；2）试剂：2%-5%意外抗体筛查试剂红细胞（2或3组）、生理盐水；3.耗材：硬试管、一次性塑料滴管、记号笔等；5. 2.3标本要求1）推荐使用EDTA抗凝静脉血，也可以使用不抗凝静脉血，静脉血管条件不好或紧急情况下也可以使用动脉血，标本采集量23mL；2）标本标识清晰、准确；3）标本质量符合要求，无血液稀释、细菌污染，离心后无溶血及明显乳糜；4）标本原则上在检测前不保存，收到标本后应及时进行相关检测。4.2.4操作步骤以使用3组抗体筛查试剂红细胞为例：1）取4支洁净试管，分别做好I、II、In和自身对照标记;2）每支试管中分别加入2滴患者血浆（或血清），再分别加入1滴相应2%-5%筛查红细胞和自身红细胞，混匀；3）使用血型血清学专用离心机100Og,离心15s；4）观察有无凝集或溶血，必要时显微镜下观察，并记录结果。4.2.5结果判定与解释1）结果判定标准阳性结果：红细胞形成凝集或发生溶血；阴性结果：红细胞无溶血，肉眼及镜下均未见凝集。表1玻片法红细胞凝集强度评分标准凝集强度评分结果描述4+12红细胞凝集成一大块，血清清晰透明3+10红细胞凝集成数大块，血清尚清晰2+8红细胞凝块分散成许多小块，周围可见到游离红细胞1+5肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞士3镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离红细胞00镜下未见凝集，红细胞均匀分布1）结果解释自身对照管及I、n、In管均无凝集或溶血，表明未检出IgM意外抗体；自身对照管无凝集或溶血，I、II、III管中至少有1管出现凝集或溶血，表明受检者血清（或血浆）含有IgM同种意外抗体;自身对照管及I、II、III管均凝集，表明受检者血清（或血浆）含有自身抗体或同时伴有IgM同种意外抗体；盐水介质试验阴性结果，不除外IgG类意外抗体存在。4.2.6注意事项盐水介质法通常只能检出IgM类抗体，所以不能常规单独采用盐水介质法检测红细胞意外抗体；2.抗体筛查为阴性，并不意味着受检血清中一定没有意外抗体，一些低频抗体或有剂量效应的弱抗体可能会因实验条件和所选谱细胞不足而漏检。4.3凝聚胺法4.3.1方法原理红细胞表面带有大量的负电荷，使红细胞间相互排斥，不易凝集。当红细胞悬浮在电解质中时，阳离子会被红细胞上的负电荷所吸引，红细胞被扩散的双层离子云围绕形成Zeta电位，Zeta电位决定红细胞之间的排斥作用。凝聚胺技术首先利用低离子溶液降低反应介质的离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，促进抗原和抗体结合。然后加入凝聚胺溶液，它是一种高价阳离子季核盐多聚物，液相中产生的正电荷能中和红细胞膜表面唾液酸带有的负电荷，使红细胞Zeta电位降低，红细胞间距离缩短，在离心力作用下，红细胞发生可逆性、非特异性聚集。通过加入带有负电荷的柠檬酸盐重悬液，其负电荷具有能中和凝聚胺阳离子的作用，使红细胞非特异性聚集散开，结果为阴性；当红细胞上有IgG抗体结合时，其特异性凝聚是不可逆的，加入重悬液后仍呈现肉眼可见的凝集现象，即为阳性结果。4.3.2仪器、试剂与耗材1）仪器：台式低速离心机、血型血清学专用离心机、显微镜、阅片灯箱、试管架；2）试剂：225%意外抗体筛查试剂红细胞（2或3组）、低离子介质溶液（LIM）、凝聚胺试剂溶液（PolybreneReagent）、重悬液、生理盐水；3. 耗材：硬试管、一次性塑料滴管、玻片、记号笔等。4. 3.3标本要求同本节盐水介质法。5. 3.4操作步骤1）取4支洁净试管，分别做好I、II、III和自身对照标记；2）每支试管中分别加入2滴患者血浆（或血清），再分别加入1滴相应2%-5%筛查红细胞和自身红细胞，混匀；3）每管加入低离子介质溶液（LlM）0.65mL,混匀（加入量以及是否需要室温孵育，请参照试剂使用说明书），室温孵育Imin；4）每管再加入凝聚胺溶液2滴，混匀，10OOg离心15s,弃上清液，不要沥干，让管底残留约0.1mL液体，轻摇试管，肉眼观察有无凝集，有凝集可进行下一步试验，如无凝集可能试剂失效或离心条件不符合要求，需要查找原因后重做试验；5）每管中加入2滴重悬液；6）轻轻混匀，Imin内观察凝集是否消失，有无溶血现象；7）疑为弱凝集反应时，取洁净玻片1张，用一次性塑料滴管从疑似弱凝集反应管内吸取1滴红细胞混悬液，滴放在玻片上，涂成薄层，在显微镜下观察，记录结果。4.3.5室内质控1）基本原则：每次质控试验应至少选择一个阳性对照质控品，一个阴性对照质控品。阳性质控品最好选择2+的反应强度；2）频次要求：推荐每批次试验进行室内质控；至少在每天试验开始前、试验中途更换试剂批号后应重做质控实验；3）操作要求：受检标本与质控品标本应采用完全相同试验操作步骤；4）可以选择商品化质控品，也可以利用实验室标本资源自制质控品；5）质控结果分析：质控结果与预期靶值相符，结果在控，受检标本检测结果可用；质控结果与预期靶值不相符，结果失控，受检标本检测结果不可用，需查找原因、纠正影响因素后，重复检测。4.3.6室间质评按照要求参加国家级或省级输血相容性检测室间质量评价活动意外抗体筛查项目，成绩至少达到合格以上。出现成绩不合格时，实验室应停止该检测项目，认真分析、查找原因，制定并实施整改、预防措施，并在得出满意评估结果后，方可重新开展本检测项目。4.3.7结果判断与解释D结果判定标准：同本节盐水介质法。2）结果解释：自身对照管及I、II、In管均无凝集或溶血，表明未检出IgG意外抗体；自身对照管无凝集或溶血，I、II、III管中至少有1管出现凝集或溶血，表明受检者血清（或血浆）含有同种意外抗体；自身对照管及I、II、In管均凝集者表明受检者血清（或血浆）含有自身抗体或同时伴有同种意外抗体。4.3.8注意事项此方法较之盐水法在灵敏度上有了很大提高，但其根本还是一种非特异性促凝手段，仍不能使灵敏度达到最理想的临床应用水平。在使用该试验方法时应注意以下几点：1）凝聚胺法对Kell血型系统的抗体检测效果不理想，对抗-K敏感性低，容易发生漏检;2） IgM类意外抗体也可以在凝聚胺法试验中出现阳性结果，需要加做盐水介质试验，以区分阳性结果是由于单独IgG意外抗体所致,还是由于IgM联合IgG意外抗体所致；3）注意本方法存在的非特异性因素：试验过程中加样不准、反应时间不够、离心力不够及观察结果时振摇过重或观察时间超过Imin都会造成假阴性结果；部分试验结果需在显微镜下观察，增加了结果判断的不确定性;对弱反应容易漏检，但假阳性相对较少。某些治疗过程、药物可影响本法抗体筛查试验结果：透析、介入、体外循环等治疗后患者血清（浆）中含大量肝素；消化道出血患者使用的酚磺乙胺（止血敏）：酚磺乙胺在水溶液中带负电荷，能使红细胞Zeta电位上升，致可逆凝集反应受到抑制，多加入凝聚胺溶液也无法完全排除干扰，遇到此类患者应在使用酚磺乙胺4-6h后重新抽取血液标本进行检测或更换其他试验方法；患者输入大量低分子右旋糖酎时出现缗钱状凝集。采用等量生理盐水置换法,此种凝集即会消失。4.4抗人球蛋白法4.4.1方法原理在盐水介质中多数IgG血型抗体与红细胞膜上相应血型抗原结合后，只能发生致敏反应而不能出现肉眼可见的凝集反应。当加入抗人球蛋白试剂后，该抗体（二抗）可与多个包被在红细胞膜上的IgG类抗体（一抗）的FC段结合，通过抗人球蛋白的桥联作用，使致敏红细胞发生肉眼可见的凝集反应。目前许多商品化血型血清试剂为IgG型，需要在抗人球蛋白介质中鉴定对应血型抗原。4.4.2仪器、试剂与耗材1）仪器：台式低速离心机、血型血清学专用离心机、水浴箱、显微镜、阅片灯箱、试管架；2）试剂：2%-5%意外抗体筛查试剂红细胞（2或3组）、抗人球蛋白试剂、生理盐水；3）耗材：硬试管、一次性塑料滴管、玻片及记号笔等。4.4.3标本要求同本节盐水介质法。4.4.4操作步骤1）取小试管4只，标记并分别加入待检血浆或血清2滴。2）以上4管中分别加入抗体筛选细胞I、11、In以及自身红细胞悬液各1滴，混匀。3）立即以IOoOg离心15秒，肉眼观察结果。如果阴性则继续试验，如果阳性，则分析原因排除干扰后继续后续试验。4）置37水浴箱孵育30分钟，或者各管加LIM（lowionicStrengthmediUnl低离子强度介质）各2滴，置37°C水浴箱孵育IOT5分钟，或者各管加LIM各10滴，置37水浴箱孵育1-3分钟。5）将各管中红细胞用生理盐水洗涤三次（红细胞洗涤程序见附件红细胞洗涤方法）6）各管加多特异性抗球蛋白试剂各1滴，混匀，以100Og离心15秒，肉眼判断红细胞凝集情况。7）如果红细胞均不凝集，则在任一试管中加入直抗阳性红细胞悬液1滴，立即以IOoOg离心15秒，肉眼判断红细胞凝集，如果红细胞不凝集则该试验无效。（直抗阳性红细胞的制备：见附件致敏红细胞的制备方法）4. 4.5室内质控同本节凝聚胺法。5. 4.6室间质评同本节凝聚胺法。6. 4.7结果判断与解释1）结果判定标准：同本节盐水介质法。2）结果解释：自身对照管及I、II、In管均无凝集或溶血，表明未检出IgG意外抗体；自身对照管无凝集或溶血，I、II、III管中至少有1管出现凝集或溶血，表明受检者血清（或血浆）含有IgG意外抗体；自身对照管及I、II、In管均凝集者，表明受检者血清（或血浆）含有自身抗体或同时伴有IgG意外抗体;直接离心，自身对照管及I、n、In管均凝集或溶血者，表明受检者血清（或血浆）含有自身抗体或同时伴有IgM类意外抗体的存在或其它因素干扰试验结果。表2意外抗体筛查结果解释筛选细胞自身细胞结果解释阳性阴性意外抗体阴性阳性自身抗体意外抗体阴性+DAT阳性阳性阳性自身抗体意外抗体+自身抗体意外抗体+DAT阳性4.4.8注意事项1）红细胞的洗涤过程需要注意:红细胞的洗涤应充分。抗人球蛋白试剂能与结合在红细胞表面的IgG抗体反应，同时也能与血清（或血浆）中游离的IgG抗体反应。如果洗涤不充分，残留的游离球蛋白能中和抗人球蛋白，使试验出现假阴性结果；在洗涤红细胞过程中，每次移除上清液后，都要将压积在试管底部的红细胞扣充分摇离管壁后再加入生理盐水，并使其充分混匀，以尽量去除残存血浆蛋白；如果洗涤红细胞过程中断或推迟，抗体会从红细胞上逐渐脱离下来成为游离抗体，产生假阴性结果;最后一次洗涤一定要将剩余的生理盐水吸尽，否则会稀释抗人球蛋白试剂，使较弱抗体不易被检出。2）观察结果时，如果振摇的力度过大会造成结果误判，因此应以轻摇结果为准。对于弱阳性结果可通过观察红细胞扣是否出现缺口或通过显微镜镜下观察来判读；3）离心后应立即判读结果，如果结果被放置一段时间或重复判读，阳性结果可能减弱甚至变成阴性；4）注意试验过程中温度、离心力与离心时间、红细胞浓度与抗原抗体比例、试管摇动力度等因素都会对试验结果产生影响；5）抗人球蛋白试剂应按说明书的要求使用最适稀释度，否则会因产生前带或后带效应（钩状效应）而误判试验结果；6）当血液标本中含有冷凝集素、脐血标本含有WhartOn胶、脐血中有较多网织红细胞、抗人球蛋白试剂中含有抗转铁蛋白抗体时,都可能使红细胞发生凝集，出现假阳性结果；7）操作步骤3发现红细胞凝集或溶血，提示可能有IgM类意外抗体的存在。4.5微柱凝集抗人球蛋白法4.5.1方法原理应用微柱凝集孔代替普通试管，微柱孔内注入颗粒介质，并在反应介质中预先添加抗人球蛋白抗体。由于颗粒介质具有分子筛作用，红细胞抗原与对应IgG抗体结合后，在抗人球蛋白抗体搭桥作用下形成细胞凝集团块。通过离心作用，未结合抗体的红细胞穿过介质，到达底部，即为阴性反应；而发生抗原抗体反应出现凝集的红细胞被阻滞在介质上层或游离于介质中，即为阳性反应。4. 5.2仪器、试剂与耗材D仪器：台式低速离心机、微柱凝集卡离心机、微柱凝集卡孵育器、阅片灯箱、移液器、全自动检测系统（条件具备时）；2）试剂：0.8%T%意外抗体筛查试剂红细胞（2或3组）、微柱凝集抗人球蛋白卡、LlSS液、稀释液（自动化检测时）；3）耗材：硬试管、移液器吸头、一次性塑料滴管、记号笔等。5. 5.3标本要求：同本节盐水介质法。6. 5.4操作程序1）手工操作：严格按照微柱凝集卡使用说明书的要求进行操作。2）全自动检测：严格按照全自动检测设备使用说明书的要求进行操作。4.5.5室内质控：同本节凝聚胺法。4.5.6室间质评：同本节凝聚胺法。4.5.7结果判定与解释1）结果判定标准（如下图所示）：柱凝胶法集强度判金表纯细胞在凝胶柱内的反应情况反应强度分级评分红细胞乂介物（凝集）济荒的集中在凝胶软体IS部1÷“全ST9凝块绝大部分柒中在凝胶娥体顶部,同时在上1/3也有少量:散在凝块3.5*4或3"8大部分红细胞亚合物位于“股表面.敢在凝块魅浮丁顶部与中部之间版块大部分位于源胶中部，少部分位我胶中上部2.5*3,或2*6凝块大部分集中在凝胶软体胶中部.同时Ox9在上1/2也有少Iit散在凝块4年凝块大部分集中在凝胶我体中部，同时在9,9+*4凝集层匕F也有少肽散在凝块4r*凝块大部分集中在凝收我体中部，同时在L5*件，X凝胶下1/2也有少后散在凝块1÷1÷2±B1混合松M（Dcp）完全溶血不完全溶血 O & O凝块大部分集中在凝胶践体底濡M时在凝胶卜l2Tiltt在凝块凝块绝大部分集中在凝胶瓶体底部，但凝集不平整,在凝胶N1/3有少货散在凝块胶表面和管尖底滞的红细胞同时存在发胶和液体无般集或未凝集的红细胞，液体出现透明清澈红色残留红细胞作股表面、胶中或胶底部液体出现透明清澈红色红细胞完全沉积在做柱林胶管尖底部2）结果解释自身对照孔及I、孔均阴性,表明未检出IgG意外抗体；自身对照孔阴性，I、II、In孔中至少有1孔阳性，表明受检者血清（或血浆）含有意外抗体；自身对照孔及I、II、In孔均阳性，表明受检者血清（或血浆）含有自身抗体或同时伴有意外抗体；阳性结果一般需要加做盐水介质法，以确定是否存在IgM意外抗体。在排除IgM意外抗体的情况下，方可确定存在IgG意外抗体。4. 5.8注意事项1）如果应用不抗凝血标本，红细胞要充分洗涤，不能有凝块，血清析出充分，排除纤维蛋白干扰；2）离心过程中要防止孔间污染，干扰结果的判断;3） 一些IgM意外抗体也可以在微柱凝集抗人球蛋白试验中表现为阳性结果，若要确认或区分抗体类型，还需增加盐水介质试验，或使用筑基试剂处理受检血浆(或血清)重复试验；4)抗体筛查为阴性，并不意味着受检血清中一定没有抗体，一些低频抗体或有剂量效应的抗体可能会因实验条件和所选谱细胞不足而漏检。5、红细胞意外抗体鉴定方法红细胞意外抗体筛查结果为阳性，应进行抗体鉴定试验，以确定其特异性，便于找到对应抗原阴性的献血者血液，确保输血疗效与安全。意外抗体鉴定试验原理是让待检血清与一组红细胞反应，该组红细胞上的血型抗原均经过了详细的检测，通常称为“谱细胞”(PanalCell)o通过分析待检血清与谱细胞反应的格局情况，就可以判断待检血清中存在的意外抗体具有怎样的特异性。主要介绍常用的盐水介质法、凝聚胺法、盐水抗人球蛋白法和微柱凝集抗人球蛋白法。抗体鉴定试验试剂谱细胞一般是由8-20单人份的己知血型表型的0型红细胞配套组成，具有各种不同的红细胞抗原成分，根据谱细胞的反应格局可以鉴定常见抗体特异性。采用一组谱细胞进行抗体鉴定有一定的局限性，有可能漏检低频抗体或无法确定联合抗体的特异性。临床上很难找到完全覆盖所有抗原的谱细胞，试剂选择时应结合本地区意外抗体分布的特点并尽量满足以下要求：1）由8-20人份0型红细胞组成一套谱细胞，应包含D、C、C、E、e、M、N、S、s、Mia、Mur>Jka、Jkb、Dia、K、k、Pl、Fya、Fyb、Lea和Leb等抗原，能鉴定Rh、MNSPlPk.Lewis、KelkKidd、Duffy.Diego等血型系统的常见抗体;4） Rh、MNS>DUffy和Kidd系统的多数抗体均表现有剂量效应，试剂红细胞上相应的抗原应尽量为纯合子；3）能鉴定大多数单一抗体和多种混合抗体，能区分复合抗体和混合抗体；4）应标明Rh基因型如RIR1、R1R2等；5）注明一些重要的低频率抗原及高频率抗原是阴性还是阳性；6）选择意外抗体鉴定技术应力求：尽可能多地检测出有临床意义的抗体；尽可能少地检测出无临床意义的抗体；尽可能快速地完成抗体检测。当一份待检血清需要做抗体鉴定试验时，首先需要确定应用怎样的介质进行试验，这通常需要参考抗体筛选试验的结果。如果在抗体筛选试验中只有盐水介质出现阳性，则需要用盐水介质进行抗体鉴定。同样，如果在抗球蛋白介质和聚凝胺试验中抗体筛选试验均出现阳性,则可以选择一种结果较明确的方法进行抗体鉴定试验。5. 1盐水介质法5. 1.1原理IgM类意外抗体可在室温盐水介质中与具有对应抗原的红细胞发生凝集反应，使用一组由8-20单人份的己知血型表型的0型红细胞可以在盐水介质条件下鉴别出受检者血液中IgM类意外抗体特异性。5.1.2仪器、试剂与耗材1）仪器：台式低速离心机、血型血清学专用离心机、阅片灯箱、显微镜、试管架；2）试剂：2%-5%抗体鉴定细胞（谱细胞）、生理盐水；3.耗材:硬试管、一次性塑料滴管、记号笔等。5.1.3标本要求1）推荐使用EDTA抗凝静脉血，可以使用不抗凝静脉血，静脉血管条件不好或紧急情况下也可以使用动脉血，标本采集量23mL；2）标本标识清晰、准确；3）标本质量符合要求，无血液稀释、细菌污染、离心后无溶血及明显乳糜；4）标本原则上在检测前不保存，收到标本后应及时进行相关检测。5.1.4操作步骤1）依据谱细胞的数量（n）取相应数目的洁净试管，分别标记序号1、2、3、n,另取一支洁净试管标记为自身对照;2）每管各加入被检血清（或血浆）2滴;3）再分别于1-n号试管内对应加入225%抗体鉴定细胞各1滴，自身对照管加入1滴2%-5%自身红细胞悬液；4）混匀，经IOoOg离心15s,观察有无凝集和溶血，必要时显微镜下观察并记录结果。5.1.5室内质控：不适用。5.1.6室间质评：不适用。5.1.7注意事项1）盐水介质法通常只能检出IgM类抗体，所以不能常规单独采用盐水介质法鉴定红细胞意外抗体特异性，需要与能够鉴定出IgG类抗体的方法组合使用；2）盐水介质法抗体鉴定为阴性，并不意味着受检血清中一定没有IgM抗体，一些低频抗体可能会因所选谱细胞不足而漏检，必要时可增加谱细胞数量；3）盐水介质法出现弱阳性结果或无相符反应格局时，可以通过室温（或4）孵育一定时间后，离心观察结果，提高有剂量效应的弱抗体的检出效率。5.2凝聚胺法5.2.1原理：同本节红细胞意外抗体筛查试验凝聚胺法。5.2.2仪器、试剂与耗材:1）仪器：台式低速离心机、血型血清学专用离心机、阅片灯箱、显微镜、试管架；2）试剂：2%-5%抗体鉴定细胞（谱细胞）、低离子介质溶液（LlM）、凝聚胺试剂溶液（PolybreneReagent）重悬液、生理盐水；3.耗材：硬试管、滴管、玻片、记号笔等。5.2.3标本要求：同本节盐水介质法。5.2.4操作步骤1）依据谱细胞数量（n）的多少取相应数目的洁净试管，分别标记序号1、2、3、n,另取一支洁净试管标记为自身对照；2）每管各加入2滴被检血清（或血浆）；3）再分别于Ln号加入1滴2%-5%抗体鉴定谱细胞，自身对照管加入1滴2%-5%自身红细胞悬液；4）混匀，各加LlM溶液0.65mL（或参照试剂说明书操作），再次混匀；5）各加2滴凝聚胺溶液（参照试剂说明书操作）；6）用血型血清学专用离心机，以Iooog离心15s,弃去上清液，不要沥干，让管底残留约0.ImL液体；7）轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，则必须重做试验；8）加入2滴重悬液，轻轻摇动试管混匀并同时观察结果;9）记录观察到的凝集强度或溶血程度。1.1.1 2.5室内质控：同本节红细胞意外抗体筛查试验凝聚胺法。5.2.6 室间质评：不适用。5.2.7 注意事项：同本章第四节红细胞意外抗体筛查试验凝聚胺法。5.3盐水抗人球蛋白法5. 3.1原理：同本节红细胞意外抗体筛查试验盐水抗人球蛋白法。6. 3.2仪器、试剂与耗材1）仪器：台式低速离心机、血型血清学专用离心机、水浴箱、显微镜、阅片灯箱、试管架；2）试剂：2%-5%抗体鉴定细胞（谱细胞）、抗球蛋白试剂、生理盐水；3）耗材：硬试管、一次性塑料滴管、载玻片、记号笔等。7. 3.3标本要求：同本节盐水介质法。5. 3.4操作步骤D依据谱细胞的数量（n）取相应数目的洁净试管，标记并分别加入待检血浆或血清2滴。2）以上各管中分别加入ln号2%-5%谱细胞试剂以及自身红细胞悬液各1滴，混匀。3）立即以100og离心15秒，肉眼观察结果。如果阴性则继续试验，如果阳性，则分析原因排除干扰后继续后续试验。4）置37水浴箱孵育30分钟，或者各管加LIM（lowionicstrengthmedium低离子强度介质）各4滴，置37水浴箱孵育10-15分钟，或者各管加LlM各10滴，置37°C水浴箱孵育1-3分钟。5）将各管中红细胞用生理盐水洗涤三次（红细胞洗涤程序见附件红细胞洗涤方法）。6）各管加多特异性抗球蛋白试剂各1滴，混匀，以100Og离心15秒，肉眼判断红细胞凝集情况。7）如果红细胞均不凝集，则在任一试管中加入直抗阳性红细胞悬液1滴，立即以IOoOg离心15秒，肉眼判断红细胞凝集，如果红细胞不凝集则该试验无效。（直抗阳性红细胞的制备：见附件致敏红细胞的制备方法）5.3.5室内质控：同本节红细胞意外抗体筛查试验凝聚胺法。5.3.6室间质评：不适用。5. 3.7注意事项：同本节红细胞意外抗体筛查试验盐水抗人球蛋白法。5.4 微柱凝集抗人球蛋白法5. 4.1原理：同本节红细胞意外抗体筛查试验柱凝集抗人球蛋白6. 4.2仪器、试剂与耗材D仪器：台式低速离心机、微柱凝集卡离心机、微柱凝集卡孵育器、移液器、全自动检测系统（条件具备时）、稀释液（自动化检测时）；2）试剂：O.8%-1%抗体鉴定细胞（谱细胞）、微柱凝集抗人球蛋白卡、LlSS液;3）耗材N硬试管、移液器吸头、一次性塑料滴管、记号笔等。7. 4.3标本要求：同本节盐水介质法。8. 4.4操作步骤D手工操作：严格按照微柱凝集抗人球蛋白卡使用说明书的要求进行操作。2）全自动检测：严格按照全自动检测设备使用说明书的要求进行操作。9. 4.5室内质控：同本节凝聚胺法。10. 4.6室间质评：不适用。11. .7注意事项：同本节红细胞意外抗体筛查试验柱凝集抗人球蛋白法5.5 抗体鉴定试验结果的解释及处理：1）与谱细胞反应有明确结果，并从反应格局可确定为单一抗体。2）与谱细胞反应有明确结果，反应有强弱格局，但无法确定为单一抗体。可能存在混合抗体、联合抗体或类特异性抗体，可用排除法限定抗体特异性范围，并用吸收放散方法分离各种特异性抗体。混合抗体是指存在多种不同特异性抗体，联合抗体是指存在一种具有多特异性的抗体。如果通过吸收放散试验可以分离出不同特异性的抗体,则证明存在混合抗体。如果通过吸收放散试验无法使抗体的特异性出现分离，则可能存在联合抗体或类特异性抗体。通常可使用与血清反应较弱的红细胞可能只和其中一种抗体反应，通过吸收和放散，有可能得到单一特异性的抗体。3）与谱细胞呈弱反应，结果不明确。I、分析结果：是否符合剂量效应：许多血型抗原，如Rh抗原（除D抗原外），纯合子的抗原强度明显高于杂合子的抗原强度,如CCDEE上E抗原的强度明显高于CCDEe。在抗体较弱时可能只与纯合子细胞反应，与杂合子细胞不反应。是否可能为某些具有个体差异抗原的抗体：某些抗原如：I、P、Lea、Sda等在不同成人红细胞上，所表现的强度不同。这一类弱抗体与谱细胞反应结果可能难于分析，如：弱的抗-Pl可能与某些PI型谱细胞反应,与另一些Pl型谱细胞不反应。谱细胞是否新鲜，浓度是否一致:有些抗原在储存期的退化比另一些抗原快，且抗原在不同献血者红细胞上的退化速率也不同，故弱抗体与陈旧谱细胞反应的格局难以分析。另外不同的谱细胞浓度可以影响结果凝集强度的判断。因此应尽量使用浓度一致的新鲜谱细胞。II、改变试验方法：使用更灵敏的方法重复试验：手工POIybrene方法，凝胶方法，酶增强的抗球蛋白方法都是灵敏度很高的试验，使用这些方法重复试验可能会得到明确的结果。适当增加血清与红细胞比例，适当增加孵育时间：在IgG不规则抗体的检测中，将血清、红细胞比例增加到4：1；37孵育时间增加到1小时会增强反应结果。加添加剂后重复试验：有许多增效剂可明显提高反应灵敏度，如一些LiSS添加剂、PEG等。其中PEG可显著增强抗球蛋白试验的反应，其灵敏度可高于手工polybrene方法。待抗体增强后重复试验：有时，病人体内的抗体会逐渐增强，如孕妇、刚刚接受不配合型输血的病人，可以过一段时间后重复试验。4）与所有谱细胞反应，自身对照阴性I、与谱细胞反应强度不一致:可能存在混合抗体：可观察在不同试验方法中是否表现出明显不同的反应格局。如在酶方法中增强则可能存在Rh抗体或补体结合抗体(抗Lea、Jka等)；在酶方法中减弱可能是M、N、S、FyaFyb以及高频抗体Ch、Rg、或JMH等；在POIybrene试验中减弱则可能是KeII系统抗体。可以用吸收放散方法分离混合抗体，用与血清反应较弱的红细胞吸收试验，测放散液中抗体特异性。可能存在联合抗体:抗体联合常见于Rh系统中，如抗-G(CD),-f(ce),-Ce,-CDE,-Ec等。联合抗体本质上是一种抗体，但其特异性很像是同时存在着两种或多种抗体。如果怀疑存在2种或多种具有明确特异性的抗体，但不能用吸收放散方法使其分开，则证明存在联合抗体。II、与谱细胞反应强度一致：抗体可能为专与。细胞反应的抗体，如抗T、-H.-HI这些抗体一般都是所谓的高效价、低亲和力抗体，可通过测定效价，观察凝集强度和效价的关系查知。这类患者如需输血，可检查与患者有血缘关系的个体的红细胞，常能发现有阴性反应者，这些个体如果ABO血型与患者相合，可以作为供血者。可能是针对高频抗原的抗体；可能是针对谱细胞的抗体。由于市售谱细胞均贮存于保存液中，保存液中的氯霉素、硫酸新霉素、四环素、氢化可的松、乳糖及EDTA均可吸附于谱细胞，如果患者体内有上述药物的抗体，可能特异性的造成谱细胞凝集。可在实验前用盐水洗涤红细胞加以解决。5）与所有谱细胞反应，自身对照阳性I、存在自身抗体谱细胞与血清的反应强度一致，可在自身细胞上放散出同样的抗体。这种情况较少见，因为一般自身抗体会全部吸附到自身红细胞上。为了证明血清中确实还存在未被吸收的自身抗体，必须将患者红细胞放散至直抗阴性，然后与自身血清反应，其结果才是可靠的自身对照。II、同种和自身抗体同时存在同种抗体和自身抗体可以同时存在。同种抗体的存在一般可使谱细胞反应出强弱不一的格局，可借以判断同种抗体的特异性。有时自身抗体会掩盖了同种抗体的存在，由于同种抗体引起输血反应的强度往往远高于自身抗体，所以排除可能存在的同种抗体很重要。通常可用自身细胞进行反复吸收放散的方法除去自身抗体来查知是否存在同种抗体。IIL冷凝集一般冷凝集素在室温（25。C）下即失去活性，但有些冷凝集素可在32时凝集红细胞，更有些极高效价的冷凝集素引起的红细胞凝集在37孵育仍不散开。这时可在37和4分别作抗体效价，以确认冷凝集素的存在。可用自身或兔红细胞反复吸收放散的方法除去血清中的冷凝集素，用45温盐水反复洗涤红细胞来去除红细胞上的冷抗体。或使用2-me处理血清或红细胞以排除IgM性质冷凝集素的干扰。IV、假凝集某些高分子物质、血清蛋白异常、低离子强度及酸性环境等均可造成红细胞假凝集。V、酶引起的多凝集约有K左右个体的血清中，存在和酶处理红细胞反应的抗体，这些抗体和未经酶处理的红细胞不反应，在盐水、抗球蛋白试验及其他方法的试验中均不能凝集。可用未经酶处理过的红细胞在37吸收该血清，然后用酶方法检测放散液中的抗体。由于酶多凝集抗体不能被普通红细胞吸收，因此放散液在酶介质中不能凝集红细胞。VI、补体的影响在极少见的情况下，患者血清和谱细胞或献血者细胞混合孵育的过程中，可将少量补体致敏到红细胞上，造成抗球蛋白试验的弱阳性结果。特别在配血过程中出现这种情况，常令人十分困惑。只要在患者血清的抗体鉴定中，确认这种抗补体阳性不是由补体依赖性抗体造成的（与一组谱细胞呈一致性的弱反应，没有特异性抗体特有的反应格局）。则可以用抗TgG代替多特异性抗球蛋白试剂加以解决。另外试验前将被检血清56孵育3分钟可灭活补体。VD、类抗体某些抗体具有相对的抗体特异性，如某些Rh抗体。相对特异性抗-E可与含E抗原的红细胞呈强反应，与不含E抗原的细胞呈弱反应。这时用不含E抗原的红细胞吸收血清抗体，会发现抗-E同时被吸收而减弱。这类抗体也出现于直抗阳性红细胞的放散液中。6)与谱细胞不反应，自身对照呈阳性：I、自身抗体：存在自身抗体的病人，血清中常没有可检出的自身抗体，几乎所有抗体都吸收到了自身红细胞上，造成自身红细胞直抗阳性。II、输血反应：血型不合造成的输血反应，病人的抗体可能被完全吸收到输入的红细胞上，造成血清中没有可检出的抗体，而“自身细胞”表现出直抗阳性。其实真正的直抗阳性的细胞是输入的红细胞。IIL多凝集红细胞：病人红细胞可能是多凝集红细胞。多凝集有细菌污染和遗传性两种。IV、C3阳性：病人的红细胞可能在体内或体外被C3致敏，这种致敏常由IgM性质的冷抗体造成，因此在血清中没有可检出的抗体。6、抗体筛查和鉴定的影响因素6. 1抗原抗体反应的影响因素抗原与相应抗体的特异性结合反应称为抗原抗体反应(antigen-antibodyreaction)o在实际操作过程中，抗原抗体的反应会受到很多因素的影响。6.4 1离子强度反应液中存在的电解质减弱了抗原抗体间的静电作用。降低离子强度可以显著地增加抗原抗体结合速率。离子强度由O.17M（生理状态）降低到0.03M时，抗-D与D阳性红细胞的开始结合速率增加1000倍。6.1.2结合水层Steane和Gerrnwalt提出了水合作用理论。由于红细胞与免疫抗体表面都带有大量的亲水基团，水分子紧紧与红细胞及抗体表面结合，形成一层水化膜，就像水泡一样使红细胞表面与抗体彼此隔离。抗体要结合在红细胞表面抗原上，必须挤走抗原与抗体结合位点之间的水分。PEG（聚乙二醇）固定了大量的水分，相对减少了红细胞与抗体周围的水分，有效的促进了抗原抗体反应。6.1.3红细胞表面位阻有人认为红细胞表面大量的糖链在空间位置上阻碍了抗原抗体的接近。因此用酶处理红细胞有利于某些抗原抗体的反应。6.1.4PHHughesJonesd等证实抗-D的平衡常数在PH6.5-7.0之间为最高,在5.5-8.5之间平衡常数略有改变。少数红细胞同种抗体，只当PH下降时才可测到，例如抗T和抗-M。6.1.5温度大多数血型抗体只在限定的温度范围之内显示反应性。通常IgM抗体在4-27°C反应性较强，IgG抗体在37反应较佳。低于37才有反应的抗体，一般没有临床意义，临床上有意义的抗体都是活体内具有活性的抗体，这种抗体活性常由体外37的反应性体现。6.1.6作用时间达到平衡状态所需时间受到免疫球蛋白的类别以及抗体亲和力等因素的影响。已证明Rh抗体在37°C致敏，在开始的15分钟的吸收量为总量的25%,1小时达到75%o抗A抗B的吸收时间可以延长至1小时。6. 1.7抗原抗体比例抗原抗体结合的速率可受介质内分子与红细胞上相应抗原数目的影响，增多抗体的量能增强试验的敏感性。在试验中增加血清与红细胞悬液的比例，有时能显著改善反应结果。6.2抗体筛查和鉴定细胞的质量用于抗体筛查的试剂红细胞称筛查细胞。筛查细胞大多不包括低频率抗原，不能检出低频率抗原抗体。用于抗体鉴定的试剂红细胞称谱细胞，能鉴定大多数单一抗体和多种混合抗体