(分析方法开发)影响关键色谱峰对分离度的重要因素.docx

,.Z-1-刖三色谱分离是建立HPLC方法的首要考虑因素,深刻理解实验色谱参数如何影响分离效果，可以很好的帮助我们建立分析方法，运用HPLC技术解决研发过程中遇到的分析问题。反相色谱方法（RPC）开发的一个重要开始起点，是选择合适的色谱条件，为一个给定的样品提供一个可靠的分离结果。两个色谱峰的分离度通常采用它们的保留时间和峰宽计算得到：Rs=2tR（j）-tR（i）（Wi+Wj）,Wi和Wj代表色谱峰i和j的峰宽。色谱峰保留因子与保留时间的关系：k=（tR-tO）tO色谱峰宽、理论塔板数、保留因子的关系：W=4N-0.5t0（l+k）由上面公式，可以导出色谱峰间分离度与保留因子、选择因子和理论塔板数之间的简单关系：分离度可以划分为三项：a项（第一个峰的保留因子），b项（分离因子）和c项（柱效或塔板数）。从这个公式中可以看出两个色谱峰之间的分离度，与峰保留因子、选择因子和理论塔板数密切相关。通过改变这三项中的任意一项的值，都可以改善峰之间的分离度，其中提高分离选择性（Q）,是最有力的方法。图1是等度条件下的分离度公式，下图2是梯度条件的分离度公式。图2：分离度公式（梯度）当需要分离多个色谱峰时，对于分离程度最差的一对色谱峰来说，分离度的要求是R2.0o这一对色谱峰通常被称为关键色谱峰对。它们的分离度是方法优化关注的焦点。方法建金器开发时，第一步关键是选择一根柱效足够、选择性较好的色谱柱,色谱柱固定相是影响选择性最大的因素；依次是改变溶剂的强度，使色谱峰保留因子k值落在合适的区域范围，优化选择性,最后是调整柱子的柱效塔板数，得到最优的分离度和分析时间。图3：色谱参数对分离度的影响1 .保留因子k的优化样品的保留因子k可以通过样品的保留时间和方法的死时间计算得到，k=（tR-tO）tO死时间t可以通过色谱柱柱长近似计算，tO=O.OlL,L为色谱柱长度（单位mm）o当选定色谱柱后，t是一个常数，因此k值的大小可以通过改变有机相的组成（B%）来控制。通常k值控制在IWkWIO范围比较合适，如图3。图3相对分离度与k值的关系k=10时，当其它影响因素不变时，k值的增加几乎不再改善分离度，只会延长样品的保留时间。当分析方法用于制剂分析时，k2时，目标峰可以很好的与一些没有保留的辅料干扰峰分离。RPC的保留会随着有机相比例B的改变而变化，表达为：Iogk=Iogkw-SG中是B溶剂的体积（为0.01*%B）,kw是当为。时的保留因子，S为常数,对于分子量100-500Da的化合物来讲，S4o因此中每增加0.1个单位（+10%B）,k值相应的减少到原来的1/10,或下降2.5倍。反之，每减少0.1个单位（-10%B）,k值相应的增加2.5倍。如例1：80%的流动相B作为初始条件，0.3k0.8o当流动相B为70%时;峰1的k=2.5*0.3Q0.8,最后一个峰为0.8*2.5=2;依次降低有机相B的比例，找到合适的k值，如c,1.8k66上述计算中的“2.5倍法测”只是一个粗略的方法，能够给出一个近似值参考。vM(分仲)l.8A<6)A,4so*耶解 (OJcicas)1.IJU3.A,尺246时H(分*)50%甲卸(4C&CI9)例1：分离效果和k随流动相中B的变化而变化2 .选择性Q的优化选择性与保留因子间的关系如：Q=k2kl,色谱峰的选择性可以通过调节它的相对保留来改变。色谱条件有机相B%比例、B溶剂类别、柱温、柱子类型、流动相PH值、缓冲液离子浓度、离子对试剂浓度等对色谱的相对保留有影响。表1：不同分离条件对保留因子、选择性和塔板数的影响。条件kaNB.R常制（乙M,甲R7等）-M度色谎柱的美*“：÷三茶禁,氟从等）渔动相的pr40冲港修度.A财试剧的浓度÷色谓杵的长度00陀大小00流速00IK力-一.心如例2：B%的改变可以使得k值落在合适的范围内，但需要进一步优化条件。因此通过调整B%比例和柱温，使得六个色谱峰都达到了分离的要求，如d。这个例子是改变选择性的一个简单且典型的示例，通过两因素两水平的改变，设计四个实验，可以达到优化方法的最终要求。3O%B.3OT (b) 4C&CI2O 2468 IO(分仲)(d) 20%B.47T 4<<20 R =4.045%BJOT,2<C4i ILjc24IHM (分伸):4KN3例2：同时改变B%比例及柱温来优化分离度目前市场上有一些方法开发的软件，如DryIab,ACDlab,可以进行方法开发的实验设计，两个或三个因素，两个或三个水平的变化，得到的分析数据通过专业软件，建立分离度与因素和水平之间的模型，预测分离度在哪个范围条件下可以达到最优的结果。3 .色谱柱柱效优化根据上图1分离度公式，色谱柱塔板数的提高可以改善色谱峰间的分离度。通过改变色谱柱的长度、粒径和流速，可以改善塔板数N。理论塔板数公式：N=16(tRW)2,N=(lH)Lo一般情况柱子塔板数的提高，意味着保留时间的延长。延长色谱柱、减小粒径和降低流速都可以增加理论塔板数。延长色谱柱和减小粒径的条件改变，会提高系统的压力，这个需要分析工作者注意。在以前的很长一段时间，由于色谱柱填料是5Um,分析实验室喜欢使用长度为25Omm的色谱柱，来提高柱效和分离。随着色谱柱和分析技术的提高，实验室很少有通过延长色谱柱来提高分离效果，现在是通过使用较小粒径(2.7m,3.0m,3.5m)色谱柱，优化保留因子和选择性来获取较短实验时间及满意的分离。4 .小结分析方法的开发包括分析目标的选择和样品组成，样品的处理，色谱模式的选择，检测器的选择，分离条件的选择，以及潜在问题的评估和解决。分离度的提高可以通过优化保留因子、选择性和柱效三个因素，其中选择性的改变是最重要的因素，影响选择性的第一要素是色谱柱固定相。优化有机相B%的比例和柱温两个影响因素，一般不复杂的规则样品可以找到满足目标的分离条件。对于复杂不规则样品，需要通过更多的因素和水平的优化，评估样品的疏水性(LOgP,LogD)和pKa,选择合适的流动相PH值，通过实验设计和统计学知识，评估多因素和多水平的参数，建立模型，最终选择最优的分析条件，达到分析的目标。参考文献：1 .现代液相色谱技术导论，陈小明等2 .HPLC方法开发的top3Tips,爱色谱分离度的计算及其影响因素1分离度定义在HPLC或者GC色谱中，分离度用以衡量相邻洗脱组分的分离情况，是将色谱柱分离效率与流动相效率综合在一起的一个参数，分离度越大，相邻两组分分离地越好。一般地，分离度小于1时，两色谱峰重叠较严重；分离度等于l(4)时，两组分被彻底分离部分占98%,对每个色谱峰来说，其峰纯度亦为98%；分离度为L5(6)时，两组分被彻底分离部分占99.7%,通常以R=1.5作为相邻两组分完全分离的标志。对于色谱峰积分面积比为1：1的两组分的分离情况与分离度的关系，如下图IA与IB所示。1.1.分离度的计算对于分离度的计算有以下几种方法：利用保留时间以及基线峰宽，按照下式1进行计算;RaoIUtiOn=2(T>Ty(Wz+Wj)(式1)利用保留时间以及半峰宽，按照下式2进行计算；Resolution=1.18×(Tj-Ty(Wfcl+Wu)(式2)各参数意义详见下图2所示。(3)利用色谱柱柱效(N),分离因子()以及保留时间较长的组分的容量因子(K),按照下式2进行计算；RttohUiOnT(U)(含)(式3)上述三个公式，理论上都可以对分离度进行计算，但公式3需要得到色谱柱的柱效，而对色谱柱而言，针对不同的化合物其柱效是不一样的，尽管仪器操作条件完全相同。因此，该式更多应用于理论推导。上述公式1与公式2则更多应用于实际色谱图中相邻洗脱组分色谱峰分离度的计算。对于公式1,其应用范围是两色谱峰基本基线分离及其以上的情况，因为该式需要测定明确的基线峰宽；当基线峰宽不能明确测量时(如两相邻组分色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值小于50%时，如图3所示)，则比较适宜选择公式2计算分离度，因为该式测量的是半峰高处的峰宽。12峰高比法预测分离度公式1以及公式2可解决基线分离以及色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值小于50%时，对于两相邻色谱峰分离度的计算需求。当两相邻组分色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值大于50%时（如图4所示），由于无法精确测量基线峰宽以及半峰高峰宽，使用公式1以及公式2计算分离度受到很大程度的限制。如图4所示，关键色谱峰对A,B,C色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度之间比值超过50%,无法精确测量基线峰宽以及半峰高处峰宽，这也是一些计算机数据处理系统无法给出一些关键峰对分离度的原因。从理论上讲，组分经色谱柱分离之后被检测器检测到的信号强度分布在时间轴是高斯分布（正态分布）的，经由计算机结合色谱分离塔板理论对相邻组分的分离色谱图进行模拟（如下图5A及5B所示）。将分离度大小（经由公式1或公式2计算得到）与两色谱峰峰高以及色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度之间比值进行关联，得到分离度与峰高比关系表（表1）,用于对重叠色谱峰分离度进行预测。VW”HightPeak-heightratio:1：11.33:12：14:110:1100:1凡1,4m27%1.310%13%19%43%1211%13%16%21%31%64%1.118¼20%25%33%47%87%1.027%31%38%50%68%0.940%45%54%71%91%0.855¾63%75%93%0.774%&4%96%0.691%当然上述表格中预测方法也存在局限性，当两色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度之间比值大于90%时，由于两色谱峰严重重叠，两重叠色谱峰各自峰高均大于单独峰高（图5B,A）,此外当两重叠色谱峰高度比大于100时，峰高大的色谱峰几乎将小的色谱峰完全覆盖（图5B,C）,此时使用该方法得到的分离度显然是不符合实际情况的。2影响分离度因素多种因素可影响分离度的大小，其中为大家所熟知的是色谱柱的柱效，流动相的选择以及温度，流速等。此外，色谱峰的峰形，峰宽以及检测器相关参数的设置亦会影响分离度的大小。2.1. 色谱峰峰形与峰宽对分离度的影响由检测器实际检测到的经由色谱柱流出组分的浓度响应信号强度，大多数情况下不是标准的高斯分布轮廓，可以色谱峰不对称因子以及色谱峰拖尾因子对色谱峰的峰形进行评价。不对称因子可按照As=BZA计算得到，其中B为10%峰高处后半部分色谱峰的峰宽，A为前半部分峰宽（如图6A所示）；拖尾因子可按照Tf=C2D计算得到，其中C为5%峰高处峰宽，D为色谱峰前半部分峰宽（如图6B所示）。一般地，不对称因子要N拖尾因子，二者相对大小如下表2所述。Peak Tailing Factor (at 5%)1.01.21.41.61.82.0PeakAsymmetryFactor(at10%)1.0131.61.92.22.5拖尾因子对于分离度的影响如下图7所示，随第一个色谱峰拖尾因子的增加，两色谱峰之间的分离度减小。对于两个拖尾因子均为1.0的色谱峰来说，在不超载的情况下色谱峰的高度与色谱峰的宽度是相互独立的，而对于拖尾比较严重的色谱峰来说，色谱峰越高,其拖尾越严重，其色谱峰宽度越大，进而导致两色谱峰之间分离度降低(如图8所示)。此外，无论是采取公式1,公式2计算还是采用色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值进行预测分离度，均无法避免拖尾因子对于分离度的影响。值得注意的是，拖尾因子较大导致分离度减小，一般只发生在前一色谱峰拖尾的情况，后一色谱峰拖尾对于分离度几乎无影响或影响很小(如图9所示)。(a)(b)(c)in因此在对含有可游离基团化合物的分析时，通过调整PH改变色谱峰的出峰顺序，对于改善分离度是有裨益的。2.2. DAD检测器采样频率对分离度的影响用于精确定量的色谱分析方法，每个色谱峰需要20-25个点，采样频率的大小不仅影响色谱方法定量的准确性，也影响色谱峰之间的表观分离度，如下图10所示。l.V,a10Hz如上图所示，当由于采样频率引起色谱峰分离度较差，可适当增大采样频率来改善这种状况（如果色谱柱本身无法做到对待分离组分有效分离，该方法并无裨益）。分离度可以按照保留时间，峰宽以及半峰宽计算，亦可以色谱柱柱效以及容量因子计算。此外也可以根据重叠两色谱峰的峰高比以及重叠处峰谷与较低色谱峰峰高比来预测分离度。无论采取哪种方式，均具有局限性，在实际情况下，需要根据相邻色谱峰的分离情况做出选择。此外，色谱峰拖尾因子以及检测器相关设置对于分离度的影响亦不容忽视。