化妆品原料28天~90天重复剂量吸入毒性试验研究技术指导原则.docx

附件3化妆品原料28天/90天重复剂量吸入毒性试验技术指导原则一、概述1二、基本原则1（一）一般原则2（二）具体问题具体分析2三、基本内容2（一）受试物2（二）实验动物3（三）暴露方法3（四）暴露条件的监测6（五）检测指标7四、结果分析与评价8（一）试验结果的分析8（二）动物毒性反应对于人体毒性评估的意义9（三）综合评价9五、参考文献10六、注释10（一）最大吸入浓度设计的考虑10（二）卫星组的设置11七、附录11一、概述化妆品以涂擦、喷洒或者其他类似方法施用于皮肤、毛发、指甲、口唇等人体表面，由于剂型、使用方法或者原料本身特性的影响，化妆品或者其中部分原料可能存在吸入暴露风险。根据化妆品安全评估技术导则，有吸入暴露可能时，需考虑吸入暴露引起的健康危害效应。为评估吸入暴露相关安全风险，需开展吸入毒性研究。吸入毒性试验是测试可能经呼吸道进入机体的化妆品原料对呼吸道及全身的损伤及其危害程度。评估受试物的重复剂量吸入毒性特征常是在取得急性吸入毒性的初步信息后才进行28天/90天重复剂量吸入毒性的试验，该项试验用于评估在一定期间内经呼吸道重复接触受试物所引起的健康危害。吸入受试物的危害常受到受试物固有毒性和物理因素（挥发性、粒度的大小等）的影响。28天重复剂量吸入毒性试验与90天重复剂量吸入毒性试验步骤相似，主要不同在于染毒期限、每组动物数和临床/病理检查范围。本指导原则参照OECD化学品测试指南第412号：28天（亚急性）吸入毒性研究OECD化学品测试指南第413号：90天（亚慢性）吸入毒性研究等相关内容，并结合化妆品原料安全评价的特点进行制定。本指导原则适用于可能存在吸入暴露风险的化妆品原料的重复吸入毒性试验研究和评价，旨在为化妆品原料的重复吸入毒性评价提供可供参考的试验设计及程序。二、基本原则（一）一般原则重复剂量吸入毒性试验的设计应遵循毒理学试验随机、对照、重复的基本原则，试验数据应真实、完整、准确、可追溯，试验结果统计分析应科学合理。（二）具体问题具体分析重复剂量吸入毒性试验的设计，应尽可能的收集及评估受试物的所有可用信息，以提高研究质量并最大限度地减少动物使用。应根据受试物的特性、化学结构和物理化学性质；任何体外或体内毒性试验的结果；预期用途和人类接触的可能性；结构相关物质的可用（Q）SAR数据和毒理学数据；以及来自急性吸入毒性测试数据信息等设计适宜的试验方法，并对试验结果进行全面的分析与评价。三、基本内容（一）受试物受试物应注明名称、来源、性状、批号、保存条件、有效期、纯度（杂质及含量）等信息。染毒时，应根据受试物的理化性质、预设染毒浓度及实际使用时的物理状态等因素将受试物制备成相应的可吸入物态（气体、蒸气、气溶胶），有吸湿性及易发生化学反应的受试物应在干燥空气条件下进行染毒，超声雾化时会产热的受试物，应注意选择合理的发生装置。受试物一般应在没有溶媒和赋形剂的情况下进行测试，必要时，可在受试物中加入适合的溶媒或赋形剂，以助受试物在空气中达到适当的浓度和粒度。溶媒首选水，使用其他溶媒或赋形剂时，应证明溶媒或赋形剂不影响受试物的稳定性，不与受试物反应，不影响受试物的吸收，也不产生毒性。试验过程中，应定期进行受试物暴露浓度分析，并提供分析报告。（二）实验动物通常选择正常、健康的啮齿类动物，首选大鼠，一般用7w9w（性成熟），同性别体重差异应在平均体重的20%之内。选用其他种属或品系动物进行吸入毒性试验，应说明理由。在28天重复剂量吸入毒性试验中，每个浓度组及阴性（溶媒）对照组动物数一般不少于20只，雌雄各半，其中用于主试验组（试验周期为28天）的动物数不少于10只，追踪观察组不少于10只。在90天重复剂量吸入毒性试验中，每个浓度组及阴性（溶媒）对照组动物数一般不少于30只，雌雄各半，其中用于主试验组（试验周期为90天）的动物数不少于20只，追踪观察组不少于10只。实验动物应符合国家对相应等级动物的质量规定要求，具有实验动物质量合格证明。染毒开始前至少要有5d时间使实验动物适应实验室饲养环境。如动物拟采用口鼻暴露方式染毒，动物可提前适应口鼻暴露时所用的固定器。实验动物房应符合国家相应规定。选用标准配合饲料，饮水不限制。试验期间，动物一般应按性别和染毒浓度分组分笼饲养，每笼动物的数量不应干扰对每只动物的行为观察。（三）暴露方法1 .暴露浓度：试验原则上至少应设低、中、高3个暴露浓度水平的受试物组，以及1个阴性对照组，阴性对照组动物可暴露于洁净空气，或暴露于溶媒和赋形剂，溶媒应尽可能采用水，采用其他溶媒或赋形剂进行试验时，如对所使用溶媒或赋形剂的吸入毒性不了解，可以选择同时设立阴性对照组和溶媒对照组。对照组的其他条件均与试验组相同。受试物最大吸入暴露水平的设计应在引起中毒效应的前提下又不致造成动物过多死亡，否则将会影响结果的评价。低暴露水平组应不出现任何毒性作用。若掌握人群的实际吸入暴露水平，则最低吸入暴露水平应不低于人群的实际吸入暴露水平。中间暴露水平组应引起较轻的可观察到的毒性作用。如有必要，也可设多个中间暴露水平组。在中、低暴露水平组和对照组中，应尽量不造成动物死亡，以保证得到有意义的评价结论。若没有足够的信息指导受试物暴露浓度设定，应采用预试验得到尽可能多的受试物毒性信息，为正式试验的受试物浓度设定提供依据。2 .吸入暴露方式：原则上应根据受试物的性质、可能的使用方式及测试目的选择适合的吸入暴露方式。对于液体、固体及蒸气冷凝形成的气溶胶一般采用口鼻暴露方式染毒。为满足特定的研究目的，也可采用其他暴露染毒方式（如全身暴露方式等），但需给出合理的解释。口鼻暴露：即仅头部、鼻部、鼻口部暴露的暴露模式，试验过程中将动物置于相应固定器内进行吸入暴露。所选用的固定器应不对动物产生额外的应激，应注意与动物体重大小匹配，并确保动物在暴露过程中无法避开吸入染毒气流。吸入装置应配备动态气流，其通风量至少应超过装置里动物总换气量的两倍。氧含量应不低于19%,二氧化碳含量低于1%,并保证每只动物暴露条件稳定均一。如果进入暴露系统的空气体积小于流出体积时，应防止空气经其他途径进入暴露系统使受试物气溶胶稀释。染毒过程中应使装置内保持轻度负压，防止受试物泄露到外部环境中。全身暴露：将动物置于封闭的染毒柜或腔体内进行吸入暴露。建议每个动物在全身暴露染毒期间应处在独立的空间，以防止动物聚集在一起，通过被毛吸附染毒气溶胶，从而改变气溶胶浓度。全身吸入暴露装置需配备动态气流，每小时换气约12次15次，应保证染毒柜内氧含量不低于19%,二氧化碳含量低于1%,并保证受试物气溶胶均匀分布于整个染毒柜。染毒柜内应密闭，以防止受试物泄露到外部环境中。保证受试物气溶胶均匀分散的原则，即试验动物所占的总体积应不超过染毒柜体积的5%。3 .吸入染毒周期及追踪观察期：28天重复剂量吸入毒性的试验染毒周期为4周，90天重复剂量吸入毒性的试验染毒周期为13周，并根据受试原料的自身特性，毒性作用的持续性、可逆性或迟发性来确定追踪观察期的时长。4 .吸入染毒频率：原则上动物每日吸入染毒1次，推荐每周吸入染毒7d,每周吸入染毒5d也可以接受。大鼠每次吸入染毒时间6h,采用口鼻暴露方式时，大鼠以外的啮齿类动物可调整最大接触时间以尽量减少特定物种的应激反应。如延长或缩短上述染毒时间，应给出合理的解释。当吸入染毒时间超过6h,则需在染毒期间以适合方式给动物喂食，如采用全身暴露方式时，应在暴露期提供饮水。（四）暴露条件的监测1 .浓度监测应定期检测气溶胶的实际浓度，以证明暴露条件的稳定性。一般气体或挥发性受试物浓度的波动范围不得超过平均浓度±10%;液体或固体受试物气溶胶浓度的波动范围不得超过平均浓度的±20%。试验过程中，也应计算理论浓度及其与实际浓度的比值，以证明仪器发生效率的稳定性。2 .粒径监测气溶胶颗粒的空气动力学粒径决定了在重力作用下颗粒在呼吸道中的沉降情况；气溶胶颗粒空气动力学直径的几何标准差（GSD）代表气溶胶粒度分布范围，其值越大代表粒子分布较广。为了使动物整个呼吸道充分暴露于受试物中，推荐的气溶胶颗粒空气动力学中值直径（MMAD）数值应不大于2m,GSD通常应介于13之间。建议定期对呼吸区或染毒柜中的气溶胶粒径进行测定，并计算GSD值。如MMAD和GSD不满足上述条件，应给出合理解释。3 .暴露装置内气流监测通过染毒柜或口鼻暴露系统的气流速率需严格控制，应在每次暴露期间尽可能连续监测并每小时记录1次。4 .暴露系统内环境监测暴露系统内温度维持在22OC±3C,口鼻暴露和全身暴露系统都需监测记录动物呼吸区的相对湿度，应在每次暴露期间尽可能连续监测并每小时记录1次。理想的相对湿度一般在30%70%,如不满足上述条件，应给出合理解释。为保证动物的正常呼吸，氧气的浓度应不低于19%,二氧化碳的浓度应不超过1%。可自动记录或定时手动记录以上暴露系统内环境参数。（五）检测指标28天/90天重复剂量吸入毒性试验检测指标详见附录。此外，还应结合受试物的特点及其他试验中已观察到的改变或背景信息（如受试物毒性的文献报道等），在不影响正常毒性观察和检测的前提下增加合理的指标。实验动物相关指标的历史背景数据在28天/90天重复剂量吸入毒性试验中具有重要的参考意义。在染毒结束动物安乐死时对对照组和所有受试物浓度组进行一次全面检测；当进行90天重复剂量吸入毒性试验时，也可根据研究需要选择合适的时间点进行阶段性检测；试验期间对濒死或死亡动物应及时采集标本进行检测，分析濒死或死亡的原因；追踪观察期结束时对受试物各浓度组和对照组剩余动物进行一次全面的检测。染毒结束，对各组动物进行系统的大体解剖，称重主要脏器并计算脏器系数；受试物高浓度组、对照组动物、非计划死亡动物及大体解剖异常动物应进行详细的组织病理学检查，如受试物高浓度组动物某一组织发生病理改变，需要对其他受试物浓度组动物的相同组织进行组织病理学检查，如发现有异常变化，应附有相应的组织病理学照片。四、结果分析与评价28天/90天重复剂量吸入毒性试验的最终目的在于预测人体吸入受试物的剂量安全范围及可能出现的毒性反应。只有通过对试验结果的科学分析和全面评价才能够清楚描述动物的毒性反应，并推断其安全吸入剂量以及与人体的相关性。（一）试验结果的分析分析28天/90天重复剂量吸入毒性试验结果，判断动物是否发生毒性反应及毒性靶器官，描述毒性反应的性质和程度（包括毒性反应的起始时间、程度、变化规律和消除时间），如果有动物死亡应分析死亡原因，确定安全范围，并探讨可能的毒性作用机制。1 .正确理解试验数据的意义在对重复剂量吸入毒性试验结果进行分析时，应正确理解均值数据和个体数据的意义。啮齿类动物重复剂量吸入毒性试验中各组均值的意义通常大于个体动物数据的意义，实验室历史背景数据和文献数据可以为结果的分析提供参考。在分析重复剂量吸入毒性试验结果时应综合考虑数据的统计学意义和生物学意义，正确利用统计学假设检验有助于确定试验结果的生物学意义，要考虑具有统计学意义并不一定代表具有生物学意义；在判断生物学意义时要考虑参数变化的剂量-反应关系、其他关联参数的改变、与历史背景数据的比较等因素；分析试验结果时，对出现的异常数据应判断是否由受试物毒性引起并给予科学解释。2 .正确判断毒性反应受试物组和对照组之间检测结果的差异可能来源于受试物有关的毒性、动物对受试物的适应性改变或正常的生理波动，也可能源于试验操作失误和动物应激。在分析试验结果时，应关注参数变化的剂量一反应关系、组内动物的参数变化幅度和性别差异，同时综合考虑多项毒理学指标的检测结果，分析其中的关联和受试物作用机制，以正确判断受试物的毒性反应。单个参数的变化往往并不足以判断化合物是否引起毒性反应，可能需要进一步进行相关的试验。（二）动物毒性反应对于人体毒性评估的意义将重复剂量吸入毒性试验结果外推至人体时，首先，不同物种、同物种不同种属或个体之间对于某一受试物的毒性反应可能存在差异；其次，难以预测一些在人体中发生率较低的毒性反应或仅在小部分人群中出现的特异质反应；另外，有些毒性反应目前在动物中难以观察，如头痛、头昏、头晕、皮肤搔痒、视物模糊等。鉴于以上原因，动物重复剂量吸入毒性试验的结果仅可在很有限的程度上外推到人，但它可为确定人群的允许接触水平提供有用的信息。（三）综合评价重复剂量吸入毒性试验结果应结合毒性效应指标、大体解剖及病理组织学检查结果进行综合评价。毒性评价应包括受试物吸入暴露剂量与是否出现毒性反应、毒性反应的发生率及其程度之间的关系Q这些反应包括行为或临床异常、肉眼可见的损伤、靶器官、体重变化情况、死亡效应以及其他一般或特殊的毒性作用。在综合分析的基础上得出28天或90天重复剂量吸入毒性的NoAEC或LOAEC,为人群吸入的定量风险评估提供依据。五、参考文献1 .OECD.GuidelinefortestingofchemicalsNo.412：28-day(subacute)inhalationtoxicitystudy.20182 .0ECD.GuidelinefortestingofchemicalsNo.413：90-day(subchronic)inhalationtoxicitystudy.20183 .国家标准GBT217652008化学品亚慢性吸入毒性试验方法.4 .国家标准GBT217542008化学品28天/14天重复剂量吸入毒性试验方法.5 .国家标准GB/T13277.1压缩空气：污染物净化等级.6 .国家标准GB/T18664-2002呼吸防护用品的选择、使用与维护.六、注释(一)最大吸入浓度设计的考虑最大吸入浓度设计应考虑：受试物可达到的最大浓度；人体可能的最大暴露水平；维持充足的氧气供应的需要；动物福利。在缺乏限值数据支持的情况下，可参考全球化学品统一分类和标签制度(GHS)第4类的上限值，即气溶胶最大浓度为5mgL,蒸气的最大浓度为20mgL,气体最大浓度为20000ppm。（二）卫星组的设置考虑到28天/90天重复剂量吸入毒性试验的重要性，如计划在试验过程中增加影响毒性试验结果的操作时（如毒代动力学、肺负荷测定、血氧分析等），应考虑适当增加每组动物数，设有代表性的卫星组。每个卫星组的动物数需达到能够有效评价相应指标的数量。七、附录检测指标项目类别指标1.临床观察试验期间每日观察动物外观、体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便性状、暴露部位局部反应、死亡情况等。2.眼科检查眼底、屈光介质、虹膜和结膜。3.体重每周2次称量动物体重“4.摄食量每周1次测定动物食物消耗量5.血液学检测红细胞计数、血红蛋白、红细胞容积、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度、网织红细胞计数、白细胞计数及其分类、血小板计数、凝血潜力（凝血酶原时间、凝血时间、活化部分凝血活酶时间，至少测定一项）。6.血液生化学检测天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、肌酸磷酸激酶、尿素氮（尿素）、肌酎、总蛋白、白蛋白、禁食血糖、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、钾、氯、钠、钙、磷离子浓度。7.尿液检查一般不需要进行，只有当怀疑存在或观察到相关毒性作用时方需进行尿液检查。常规检测指标：外观（颜色和浊度）、尿液量、比重或渗透压、酸碱度、尿糖、尿蛋白、潜血。8.支气管肺泡灌洗液检查一般用右肺进行支气管肺泡灌洗分析，测乳酸脱氢酶、总蛋白或白蛋白、肺泡巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的计数和分类。9.肺负荷测定、通常选用雄性动物，测定3个时间点（末次染毒后24h内及染毒结束后数周的另外2个时间点）肺组织中的受试物含量。10.组织病理学检查的脏器组织需称重并计算脏器系数的器官脑、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肾上腺、胸腺、脾脏、睾丸卵巢、子宫。需进行组织病理学检查的组织或器官脑（包括延髓/脑桥、小脑和大脑皮层）、嗅球、眼（视网膜、视神经）及眼睑、脊髓（包括颈椎、胸椎、腰椎）、鼻咽组织（至少4层，1层包括鼻咽管和鼻腔相关淋巴组织）、喉（包括会厌基底层在内的3层）、气管（至少2层，包括1个通过肺外支气管气管隆凸的纵切面和1个横切面）、甲状腺、胸腺、左肺（包括主支气管和胸膜）二心脏、肝、脾、肾、肾上腺、睾丸、精囊、卵巢、子宫、食管、胃、膀胱、骨髓（和/或新鲜抽取物）、肺门淋巴结（特别是对于难溶性固体受试物）.和淋巴结（给药部位远端）、所有大体观察到异常的组织、组织肿块。注:a测量2周（28天染毒）或4周（90天染毒）后，发现染毒对动物体重没有影响，则可在剩余的研究中每周1次测定动物体重。b对于难溶性固体气溶胶需测定。C也可使用右肺。d如需进行更深入的检查和/或以免疫学为重点的研究，可考虑使用其他淋巴结，如来自后纵隔、颈内淋巴结、窦旁淋巴结、后颈淋巴结、耳淋巴结和/或颈/下颌淋巴结。