核酸提取常见试剂的作用原理.docx

异硫鼠酸胭强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸别离。脏盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂，在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫鼠酸服，它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。在复原剂存在的情况下，异硫氟酸脏可以断裂氢键，而去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。盐酸服、尿素盐酸服是一个核酸酶的强抑制剂,它并不是一种足够强的变性剂,可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来。可断裂氢键，有两种可能机制：1变性蛋白和盐酸胭、尿素优先结合，形成变性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起NT）反响平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的蛋白不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；2盐酸胭、尿素对氨基酸的增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，结果盐酸脏、尿素就称为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胭、尿素引起的变性往往是不可逆的。高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性十二烷基肌氨酸钠使蛋白质解体变性疏基试剂1防止蛋白质或酶等（如辅酶A）分子中SH基团氧化成二硫键，2在某些酶反响过程中维持体系的复原环境。DTT,DDTE.疏基乙醇应用最广，谷胱甘肽也常应用，由于他是生物体内的复原剂，同时氯化后能被谷胱甘肽复原酶原位释放。DNA提取中，常使用疏基乙醇，维持缓冲液的复原环境，防止多酚类氧化，由于具有一定的毒性，浓度不应高于2%。臻基乙醉B-疏基乙醇的主要作用是破坏RNaSe蛋白质中的二硫键（肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键）。1复原蛋白质二硫键，使Rna酶变性2抑制酚类氧化，假设氧化，核酸会变成灰黑色，苯酚的氧化产物紫酸等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联3保护蛋白质的疏基蛋白质提取中需要臻基乙醇复原二硫键，使RNA酶失活化学变性剂SDS、尿素、盐酸胭能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不影响肽键和二硫键，不能使蛋白质彻底变性加上复原剂臻基乙醇或DTT,能复原二硫键，使RNA彻底变性DTT二硫苏糖醇刺激性气味要小很多，毒性也比疏基乙静低很多。而且DTT比磕基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近，但DTT价格略高一些。由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差；但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低，随着PH值的降低，DTT的有效复原性也随之降低；DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。抑制Rnase活性TCEP三（2-甲酰乙基）麟盐酸盐半胱氨酸Trizol苯酚、异硫鼠酸胭、8羟基瞳咻、B-臻基乙醇等。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还参加了8羟基唾咻、异硫银酸胭、-疏基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8羟基噗咻可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫鼠酸胭属于解偶剂，是类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸别离。B-疏基乙醇的主要作用是破坏RNaSe蛋白质中的二硫键。液氮组织破碎，裂解细胞SDS十二烷基硫酸钠阴离子去垢剂，高温(55-65C)裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，形成SDS/蛋白质/多糖复合物,释放核酸，提高盐(KAC或NaAC)浓度并降低温度(冰浴)，使SDS/蛋白质/复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式，使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的DNA操作简单，温和，可提取到高分子量的DNA,但产物多糖类杂质较多阳离子强外表活性剂，通常与蛋白酶K和抗氧化剂、螯合剂一起使用可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA别离溶解膜类蛋白SDS能裂解细胞。使细胞中的蛋白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，使染色体离析，蛋白变性，释放核酸。(I)SDS是一种阴离子外表活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键翻开，并结合到蛋白质的疏水部位;(2)SDS可引起蛋白质构象改变(3)SDS是种良好的解离剂，可使蛋白质溶解，变性(4)形成SDS-蛋白质复合物，并使复合物带负电质粒方面：在1%的SDS溶液中慢慢参加5N的NaCL你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你参加的不是NaCl而是KCL你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassiumdodecylsulfate,PDS),而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液Hl参加后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大局部蛋白质沉淀了，让人快乐的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。基因组DNA一旦发生断裂，只要是5010Okb大小的片断，就没有方法再被PDS共沉淀了CTABCTAB：十六烷基三甲基滨乙胺，低温时易沉淀阳离子去污剂一种在高盐下能和核酸结合形成可溶、稳定的复合物，低盐浓度下可沉淀的外表活性剂是一-种阳离子去污剂，低离子强度(0.1-0.5MNaCH,沉淀核酸与酸性多聚糖，而蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液中。在高离子强度的溶液中(>07mol/LNaCI),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后参加乙醉沉淀即可使核酸别离出来。CTAB可从大量产生黏多糖的植物及某些革兰氏阴性菌制备纯化的DNA,这种去污剂参加调节至高离子强度的细菌和细胞裂解液中(>0.7MNaCI),经过连续的酚/氯仿抽提，去除CTAB/黏多糖/蛋白质复合体，异丙静/无水乙静沉淀上清即可将DNA别离出来CTAB还有提高DNA互补链复性速率及稳定已形成的DNA双螺旋的作用CTAB法的主要特点是用用较广CTAB溶液在低于15度会形成沉淀析出，因此在将其参加冰冷的植物材料时，必须预热，且离心温度不低于15度EDTA酶抑制剂，螯合二价金属，抑制金属依赖性的酶螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制细胞中DNase的活性，该酶可降解DNAEDTA是去垢剂，结合离子用，而它结合的局部离子是能够诱发或者促进RNA酶活性的，比方Ca2+oEDTA是一种二价离子熬合剂,能熬合Mg2+和Ca2+等二价阳离子,而多种RNA酶的活性是需要依赖二价阳离子的,所以EDTA能通过熬合二价阳离子来抑制RNA酶的活性碱性条件下才能够溶解，要和NaOH粉末混合后，再加水，然后用NaOH水溶液调节pH。0.01M,DNaSe酶根本失活。BSA酶抑制剂，使一些降解酶的活性的外表变性精胺或其他多胺酶抑制剂，降低核酸酶的影响氟化物酶抑制剂，降低重金属氧化酶的影响PVP减少酚类、醒类、单宁类物质的影响，抗氧化作用，络合多酚和稻类物质，防止多酚类褐变而氧化，去除多糖和色素，色素是PCR强抑制剂，必须去除样品液氮研磨及提取缓冲液中参加PVP或PvPP等能络合多酚和砧类物质，离心或氯仿抽提出去，有效防止多酚氧化成醍类，防止溶液变褐色而具有抗氧化能力提取液中参加适量的PVP或PVPP能提高DNA的纯度，用量根据杂质而定(1-6%),PVP同时能去除多糖，因此将PVP和臻基乙醇配合使用并调整用量，能有效防止多酚污染PVP(聚乙烯I此咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。Triton-XlOOTritonXlOO之类的去垢剂有苯环结构，所以在280nm有很强的吸收。蛋白酶K蛋白酶K：切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的瘦基端肽键，将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地别离出来。蛋白酶K在较广的PH范围内均有活性(PH4-12.5)温度范围37-60度盐浓度3MGuHCl或4M尿素中均有活性在一些去污剂：TWeen20(5%)、TritonX-100(1%)和SDS(1%)条件下也有活性。蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局局部泌物、尿，粪便等.蛋白酶K的一般工作浓度是50100g/ml蛋白酶(蛋白酶K或链酶蛋白酶)可以降解蛋白质，灭活核酸酶(DNaSe和RNaSe),DNase和RNaSe也用于去除不需要的核酸，有人使用蛋白酶替代DEPC处理水的，但有些人说效果不好。蛋白酶K,威力巨大的广谱蛋白酶，95C加热10分钟，那么完全失活。数年前首次使用它替代DEPC处理RNA抽提用的离心管和枪头，效果不错；后来又用于处理RNaSe-Free的水，效果也是一级棒。从此就再也不用DEPC了。配制RNA裂解试剂时，直接用灭菌的双蒸水配制，最后，参加蛋白酶K至终浓度lug/ml。轻轻混匀，室温放置15分钟后即可。枪头及离心管去除RNase：先将枪头及离心管清洗干净后，移入预先混好的含lugl蛋白酶K的双蒸水，彻底浸入。室温放置30分钟后，连水一起高压灭菌。弃水后，烘干即可。RNase-Free水的获得：直接在灭菌的双蒸储水中参加蛋白酶K至终浓度lug/nd。轻轻混匀，室温放置15分钟后，灭菌处理即可。该蛋白质的残留对后续实验没有可见的影响。无蛋白质残留的RNaSe-Free水的获得：这比拟麻烦。直接在灭菌的双蒸储水中参加蛋白酶K至终浓度lugmlo轻轻混匀后，倒入专用的蒸储器中。放置15分钟后，加热蒸储，流出的就是无蛋白质残留的RNase-Free水。要提醒的是，该专用蒸微器头几次流出来的水，只能当普通蒸储水用，因为通道中难确保RNaSe-Free的环境；另外，一定要主要密闭性，否那么，流出的水又被污染了。DNA裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA别离，抑制细胞中DnaSe的活性，而蛋白酶k的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地别离出来！溶菌酶溶壁酶DnaseRnase多糖水解酶：水解多糖饱和酚酚是种有机溶剂,预先要用STE缓冲液饱和，因未饱和的酚会吸收水相而带走一局部核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联：故在制备酚饱和液时要参加82羟基嗟咛，以防止酚氧化。苯酚非极性分子水为极性分子使蛋白质变性，同时抑制了DNaSe的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子外表又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了DNaSe的降解作用。能有效使蛋白质变性而出去，酚形成的有机相破坏蛋白质的胶体稳定性，从而蛋白质不会分布在水相中，防止核酸污染缺点：1.能溶解IO-15%的水，从而溶解一局部poly（八）RNAC2.不能完全抑制RNaSe的活性。酚变性大，但与水相有一定程度的互溶，大约IO-15%的水溶在酚相中，使核酸损失酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比方4M的异硫氟酸胭），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但参加氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反响（比方限制性酶切反响），应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚那么少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担忧酶切等反响不能正常进行。至于异戊醉的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。氯仿非极性分子水为极性分子去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）氯仿变性不如酚好，但与水不混溶，不会带走DNA因此混合使用最正确，经酚第一次抽提的水相有残留的酚，由于酚和氯仿互溶，可用氯仿第二次带走酚，也可在第二次抽提中混合使用，比例为1：1苯酚/氯仿苯酚、氯仿抽提去除蛋白质非极性分子水为极性分子，当蛋白水溶液与他们混合时，蛋白质分子见的水分子被挤去，使蛋白失去水合状态而变性，经离心，变性蛋白密度比对大，而与水相别离，苯酚/氯仿比重大，保存在最下层苯酚氯仿使蛋白质变性量要足够，因为苯酚去除蛋白是有一定的饱和度的，超过饱和度，裂解体系中蛋白质不能被一次性去除，必须屡次抽提。离心后分三层，下层有机层中有一些脂溶性的杂质，中间层白色絮状沉淀是蛋白，上清液中即含有核酸；变性后的蛋白质从水相中析出，位于苯酚中或苯酚与水相之间。异戊醉抽提DNA,为混合均匀，容易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用，参加异戊静降低分子外表张力，一般采用氯仿：异戊醇=24：1或酚：氯仿：异戊醇=25：24：1（不必先配置，临用前参加即可）减少操作过程中产生的气泡。减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低外表张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解于液相沉淀DNA时总会参加高浓度的盐,加盐的目的是破坏能使蛋白质保持稳定的两个因素,使蛋白和DNA别离并沉淀下来.而此时盐的阳离子会与DNA结合形成DNA-阳离子盐溶于溶液中,再用无水乙醇可以将DNA-阳离子盐沉淀下来提取DNA时光力口0.14molL氯化钠，因为在这种浓度的氯化钠溶液中，DNA的溶解度最低，而蛋白质的溶解度增加，这样通过过漉能将DNA别离开，以除去蛋白质。再参加95%的酒精能使DNA沉淀，因为在这个浓度下DNA溶解度最低。如果直接加酒精不先加氯化钠，DNA和蛋白质都能被酒精所沉淀，就无法将DNA和蛋白质别离开。所以必须先加氯化钠后加酒精，顺序不能颠倒。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当参加乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。这样可以是DNA沉淀出来在PH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAC或NaCI,使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当参加的盐溶液浓度太低时，只有局部DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当参加的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反响，必须要进行洗涤或重沉淀。柠檬酸钠它可以控制反响体系的离子强度，同时还有一定的缓冲作用，保证体系PH的相对稳定状态，总之柠檬酸钠在这里的作用类似于食物中的防腐剂。DEPC焦碳酸二乙酯，它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪噗环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。与肝素何用效果增强。在TriS中不稳定，很快会分解为二氧化碳和乙醇。强烈但不彻底的RNA酶抑制剂0.1%浓度Tris-HCI缓冲体系，使PH变化不会太大异丙静参加异丙醇之后立即出现絮状沉淀，我一直以为这是正确的，看了帖子才知道是蛋白质污染，异丙醉的沉淀效果要比无水乙醇的沉淀效果要好，但是异丙醇沉淀有一个弊端就是会沉淀下来好多的盐和蛋白质这样会影响下一步的操作，一般我加异丙静是等体积的效果还可以。70%乙醉70%乙醇洗涤DNA沉淀（因为在70%乙醇里DNA是不溶的,而盐离子却可溶）,用无水乙静那么达不到这个目的!乙醇对于蛋白质、核酸的沉淀效应随分子量加大而增大，小分子的核酸和蛋白质碎片是可以溶于75%乙醉的。漂洗DNA,是为了去除剩余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙静中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,防止对以后PCR反响的影响。DEPC（焦碳酸二乙酯）：常用RNA酶抑制剂，与RNA酶的活性基团组氨酸的咪嘎环结合使蛋白质变性,强烈但不彻底的RNA酶抑制剂甲酰胺用高浓度甲酰胺替代苯酚从细胞裂解物的蛋白酶K消化物中别离抽提DNA,甲酰胺是种离子化溶剂，能别离蛋白质-DNA复合物并使蛋白变性和释放，因其不影响蛋白酶K的活性，特别适于别离高分子质量的DNA,其别离物籍火棉胶袋的透析，去除变性蛋白进而纯化DNA。聚乙二醇PEG有机聚合物，无毒，亲水性强，相对分子量6-20k,沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时受离子强度、溶液PH值和温度等因素的影响，采用该方法可将病毒浓缩10倍以上。为一种非离子多聚物，多离子多聚物是六十年代开展起来的一类重要沉淀剂。基于多聚物的沉淀作用主要依赖于多聚物的浓度和被沉淀物的分子量大小，LaUrent等（1967）提出PEG的沉淀机理主要是通过空间位置排斥，使液体中的微粒(包括生物大分子、病毒和细菌等)被迫集聚在一起而引起沉淀的发生。PEG最早应用于提纯免疫球蛋白(IgG)和沉淀一些细菌病毒，今年来逐渐应用于核酸和酶的别离纯化，特别是用PEG别离质粒DNA,已相当普遍。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA,可以在500UlDNA液中参加200ul20%PEG8000(含1.2mol/LNaCl),冰浴20min(Lietal.,1994)。该操作的优点在于：操作条件温和，不易引起生物大分子的变性。同时具有极高的沉淀效能，少量的PEG可以沉淀相当多的生物大分子。乙基黄原酸钾乙基黄原酸钾能够与多糖结合，形成可溶性复合物，使细胞壁破裂，释放出核酸。此复合物在镂离子存在的情况下可转变为水不溶性，并可通过简单的离心除去，不需要茶酚或氯仿抽提。另外，乙基黄原酸钾能够结合金属离子，抑制DNaSe的活性。Tiuett等(2000)利用该方法从蓝细菌、微生物、环境样品中提取到高质量的核酸，DNA可以用于酶切、克隆、PCR,RNA可以用于RT-PCR,SOUthern杂交等反响，并且样品中不含核酸酶，温育16h没有发生降解。