植物生理指标--最新实验原理与方法.docx

1、氮蓝四噗（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SoD）2、POD（过氧化物酶）活性的测定一一愈创木酚法3、CAT（过氧化氢酶）测定4、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定5、谷胧甘肽复原酶（GR）的活力测定：6、O3产生速率的测定7、过氧化氢（H2O2）含量的测定碘化钾分光光度法8、丙二醛（MDA）含量的测定9、复原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的测定10、谷胱甘肽复原酶测定11MDAR（单脱氢抗坏血酸复原酶）活性的测定12、可溶性总糖的测定13、考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量14、叶绿素含量的测定15、石蜡制片的制作16、激素IndoleBAceticAcid（IAA）AbscisicAcid（ABA）GA3和ZA的测定17、CDNA扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）18、3'/5'RACE扩增基因全长19、根系活力的测定（TTC法）-氮蓝四嘤(NBT)法测定超氧化物岐化酶(SOD)【实验原理】SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn-SoD和CuZn-Se)D,它们都催化以下反响：由于超氧自wd由基(02一)为不稳定自由基，寿命极(万I()2-1211-l'2°2I°?短，测定SoD活性一般为间接方法。并利1,2°2口2。I2O2用各种呈色反响来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子0/，当参加NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反响生成单甲月替鲍，继而复原生成二甲月替,它是一种蓝色物质，在56Onm波长下有最大吸收。当参加SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和02,从而抑制了NBT光复原的进行，使蓝色二甲月药生成速度减慢。通过在反响液中参加不同量的SoD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光复原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反响液蓝色愈深，说明酶活性愈低。【仪器、材料与试剂】(一)仪器1 .分光光度计2 .台式离心机(二)材料1 .磷酸氢二钠2 .磷酸二氢钠3 .甲硫氨酸4.EDTA-Na25.核黄素6.氮蓝四哩(NBT)7.陶瓷小研钵8.4-5ml离心管9.IOml玻璃试管(三)试剂1. 0.05molL磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):A母液：0.2molL磷酸氢二钠溶液：®Na2HPO412H2O(分子量358.14)71.7g；B母液：0.2molL磷酸二氢钠溶液：取NaHzPCU2比0(分子量156.01)31.2g。分别用蒸偌水定容到100Omlo0.05molLPBS(pH7.8)的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml,B母液(NaH2PO4)21.25ml,用蒸储水定容至100om1。2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取1.0818gMet用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至500ml。3. 3mMEDTA-Na2溶液：称取0.1117gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100mlo4. 60UM核黄素溶液：称取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至IOom1,避光保存。5. 2.25mM氮蓝四(NBT)溶液：称取0.092gNBT用PBS定容至50ml,避光保存。【实验步骤】1 .酶液提取称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中，分三次参加1.6ml0.6ml、0.5mk0.5ml)50mmolL预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12(X)Og下离心20min,上清夜即为SoD粗提液。2 .酶活性测定(1)反响混合液配制(以60个样为准)：分别取配好的Met溶液162ml,EDTA-Na2溶液6ml,NBT溶液6ml,核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀；(2)分别取3ml反响混合液和40l(可视情况调整)酶液于指形管中此即反响管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反响混合液和40UlPBS(不加酶液)作为最大光复原管，另1支加3ml反响混合液和401PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。(3)将试管置于光照培养箱中在4000Iux光照25下反响20min；(4)反响结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度(OD56o)3 .计算结果SOD活性单位以抑制NBT光化复原的50%为一个酶活单位(U),按下式计算活性n=(ODma-OD56)ODmax2SOD总活性=(Ack-AE)×V/(l2Ack×W×Vt)SOD比活力=SoD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/gFW)；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示;ACk为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积(ml)；Vt为测定时的酶液用量(ml)；W为样品鲜重(g)；蛋白质含量单位为mg/g。【考前须知】1 .酶液提取须在4C下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；2 .植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可参加聚乙烯毗咯烷酮(PVP)或PVPP等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。3 .NBT反响液配好后过滤除去不溶物立即使用，假设置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。4 .加反响液时最好在暗光下进行；5 .核黄素产生O*NBT复原为篮甲潜都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40moln2s”,同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）；6 .测定活性时参加的酶量，以能抑制反响的50%为佳。（一个酶单位相当于引起反响液到达半抑制时酶的用量，即以能抑制反响50%的酶量为一个SOD酶活性单位。）（反响液中加酶液与PBS调零差异不大，反响液调零与其它两个那么有一定差异。李合生方法：2支CK管均以缓冲液代替酶液。）【参考文献】BeauchampC,FridovichI.Superoxidedismutase.Improvedassaysandanassayapplicabletoacrylamidegel.AnalBiochem,1971,44:276-287.ZhouW,ZhaoD,LinX.Effectsofwaterloggingonnitrogenaccumulationandalleviationofwaterloggingdamagebyapplicationofnitrogenfertilizerandmixtalolinwinterrape（BrassicanapesL.）.J.PlantGrowthRegul,1997,16,47-53.二愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定.愈创木酚法【实验原理】在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。【仪器、材料与试剂】（一）仪器1 .分光光度计2 .台式离心机（二）材料1 .磷酸氢二钠2 .磷酸二氢钠3 .2-甲氧基酚4 .30%H225 .陶瓷小研钵6 .2ml离心管（三）试剂1. 0.2molL磷酸缓冲液（pH6.0）:A母液：0.2molL磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2molL磷酸二氢钠溶液：®NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馈水定容到IoOOm1。0.2molL磷酸缓冲液(pH6.0)的配制：分别取A母液(Na2HPO4)12.3ml和B母液(NaH2PO4)87.7ml混匀即为100mlPBS(0.2M,pH6.0);【实验步骤】1 .酶液提取称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中，分三次参加1.6ml(0.6ml、0.5mk0.5ml)50mmolL预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min,上清夜即为酶粗提液。2 .酶活性测定反响混合液的配制：取50mlPBS(pH6.0,0.2M)缓冲液于烧杯中,参加28反愈创木酚(2-甲氧基酚)于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解愈创木酚溶解，待溶液冷却后参加19l30%的H2O2,混匀后保存于冰箱中备用。(2)酶活性测定：取3ml反响液并参加40l酶液后测定OD470值在40秒的变化。以PBS代替酶液为对照调零，3 .计算结果以每minOD值变化(升高)0.01为1个酶活性单位(u)。，按下式计算活性POD活性=(A470×Vt)/(W×Vs×0.01×t)(ugFW)A470：为反响时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反响时间(min)；Vt为提取酶液总体积(ml)；VS为测定时取用酶液体积(ml)。【考前须知】1 .反响液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。参加H2O2前注意溶液冷却，防止H22的挥发。2 .由于该反响迅速，参加酶液要立即进行吸光值的测定。参考文献J.L.Munoz-Munoz,EGarcia-Molina,P.A.Garcia-Ruiz,E.Arribas,J.Tudela,F.Garcfa-Canovas,J.N.Rodriguez-Lopez,EnzymaticandchemicaloxidationoftrihydroxylatedPhenOIS,尸。OdChemistry,Volume113,Issue2,75March2009,Pages435-444EQuintaniIla-Guerrero,M.A.Duarte-Vazquez,B.E.Garcia-Almendarez,R.Tinoco,R.Vazquez-Duhalt,C.Regalado5Polyethyleneglycolimprovesphenolremovalbyimmobilizedturnipperoxidase,BioresourceTechnologyVolume99,Issue18,December2008,Pages8605-8611三CAT(过氧化氢酶)的测定【实验原理】过氧化氢酶(CatalaSe,CAT),是一种广泛存在于生物组织中的氧化复原酶，它能催化H2O2分解为水和氧气,去除组织中的过氧化氢。H2O2在24Onm处有一个吸收顶峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反响溶液吸光度(A240)随反响时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。【仪器、材料与试剂】(一)仪器1 .分光光度计2 .台式离心机(二)材料植物叶片等植物材料(三)试剂1 0.15molL磷酸缓冲液(pH7.0):取A母液(NazHPCU)228.75ml和B母液(NaHzPCh)146.25ml混合后用蒸储水定容至500ml。2 0.3%H2O2:吸取0.5ml30%的H2O2,用PBS(pH7.0)定容至50mL【实验步骤】1.酶液提取称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中，分三次参加1.6ml(0.6ml、0.5ml、0.5ml)50mmolL预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、1200Og下离心20min,上清夜即为CAT粗提液。2酶活性测定(1)反响混合液的配制：取100mlPBS(0.15M,pH7.0),参加0.1546ml30%的H2O2摇匀即可。取2.9ml反响液参加0.1ml酶液，以PBS为对照调零，测定OD240值在40s内的变化。3结果计算：酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位(u)。CAT=IA240×Vt/(W×Vs×0.01×t)(ugFW)A240：为反响时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反响时间(min)；Vt为提取酶液总体积(ml)；VS为测定时取用酶液体积(ml)。【考前须知】H22易分解，应现用现配。【参考文献】AebiH(1984)Catalaseinvitro.In:PackerL(ed)Methodsinenzymology.Orlando,FL:AcademicPress,pp121-126四抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定【实验原理】AsA-POD是叶绿体内专一的去除H2O2的酶,催化抗坏血酸(ASA)与H2O2反响,使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸(MDASA)。随着ASA被氧化，溶液的OD290值下降，根据单位时间内OD290的减少值，计算ASA-Pe)D活性。ASA氧化量按消光系数2.8(mmolL)cm(=2.8mM-l-1)计算，酶活性用molAsAgFWh表示。【仪器、材料与试剂】(一)仪器1 .分光光度计2 .台式离心机(二)材料1 .磷酸氢二钠2 .磷酸二氢钠3 .EDTA-Na24 .抗坏血酸5 .30%H2O26 .陶瓷小研钵7 .2ml离心管(三)试剂(按50个样计算)：1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)的配制：母液的配制方法同前取A母液NazHP0461.0ml,参加B母液NaH2PO439.0ml,用去离子水定容到400ml«2. 0.1mMEDTA-Na2:取0.0093gEDTA-Na2用PBS(PH7.0)缓冲液定容到250ml(372.24g/M×0.1mM×500ml=0.01861g)；3. 5mMAsA：取0.044g抗坏血酸用PBS(pH7.0)缓冲液缓冲液定容到50ml(现用现配)；4. 20mMH2O2:取0.2ml30%H2O2用去离子水稀释到100ml0【实验步骤】1 .酶液提取方法同SOD.2 .酶活性的测定(以2ml体系测定)(1)(以2ml体系测定)取0.1Oml酶液(可视情况调整)，参加1.7Oml含0.1mMEDTA-Na2的PBS(0.05mol/L,pH7.0)，再参加0.10ml5mM的AsA,最后参加0.10ml20mMH2O2,立即在20下测定OD290值在40s内的变化，计算单位时间内AsA减少量和酶活性室温下测定，以不加H2O2为空白对照调零)。(2)假设以3ml体系测定，那么取0.1Oml酶液(可视情况调整)，参加2.6Oml含O.lmMEDTA-Na2的PBS(0.05mol/L,pH7.0),再参加0.15ml5mM的AsA,最后参加0.15ml20mMH2O2,立即在20°C下测定OD290值在40s内的变化3 .酶活性计算以Imin内A290变0.01定义为一个酶活性单位u,酶活性以Wg（FW）表示APX活性（ug）=A290.Vt0.01Vs.LWA290表示在290nm处吸光值的变化Vt提取液总体积；Vs酶液的体积；W叶片的鲜重；t反响时间【考前须知】参加H2O2后应混匀反响液然后快速进行比色测定。【参考文献】NakanoY,AsadaK.198LHydrogenperoxidescavengedbyascorbate-specificperoxidaseinspinachchloroplasts.PlantCellPhysiol.22,867-880五GR（谷胱甘肽复原酶）的测定【实验原理】【仪器、材料与试剂】（一）仪器1 .分光光度计2 .台式离心机（二）材料1. 叶片或根系2. GSSG3. NADPH4. Hepes（三）试剂1.Hepes缓冲液（PH7.8）：称取HePeSI.9155g,用蒸储水定容至20Oml2. IOmMGSSG：称取18.3mgGSSG溶于3ml蒸偏水中3. 2.4mMNADPH：称取4mgNADPH溶于2ml蒸储水中【实验步骤】1 .酶液提取称取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次参加1.6ml（0.6ml、0.5mk0.5ml）50mmolL预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min,上清液即为GR粗提液。2 .GR测定取样品上清液0.1ml(3次重复)，放入试管中，参加HePeSI700ul,NADPHI(X)UI及其GSSG100uI在OD340下测定。【考前须知】1 .酶液提取须在4下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降；2 .植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可参加聚乙烯毗咯烷酮(PVP)或PVPP等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。【参考文献】HongZhu,ZhuoxiaoCao,LiZhang,MichaelA.Trush,YunboLi(2007)Glutathioneandglutathione-linkedenzymesinnormalhumanaorticsmoothmusclecells:chemicalinducibilityandprotectionagainstreactiveoxygenandnitrogenspecies-inducedinjury.MolCellBiochem301:47-59.WheelerCR,SalzmanJA,ElsayedNM,OmayeST,KorteDW(1990)Automatedassaysforsuperoxidedismutase,catalase,glutathioneperoxidase,andglutathionereductaseactivity.AnalBiochem184:193-199.六02产生速率的测定【实验原理】CK与羟胺反响产生No2,NCh一在对氨基苯磺酸和-蔡胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，该染料在53Onm处有最大光吸收，根据OD530可计算出样品中的。2-的含量。【仪器、材料与试剂】(一)仪器1 .分光光度计2 .台式离心机(二)材料1 .叶片或根系2 .磷酸氢二钠3 .磷酸二氢钠4 .盐酸羟胺5 .对氨基苯磺酸6 .a蔡胺7 .冰醋酸(三)试剂1. 0.05molL磷酸缓冲液(PBS,pH7.8):A母液：0.2molL磷酸氢二钠溶液：®Na2HPO4-12H2O(分子量358.14)71.7g；B母液：0.2molL磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO42H2O(分子量156.01)31.2g。分别用蒸储水定容到100Omlo0.05molLPBS(pH7.8)的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml,B母液(NaH2PO4)21.25ml,用蒸僧水定容至100Omlo2. IOmM盐酸羟胺：称取0.05g盐酸羟胺用蒸储水定容至IOom1。3. 17mM对氨基苯磺酸：称取0.2944g对氨基苯磺酸用冰醋酸溶液(冰醋酸：水=L3)定容至100ml4. 7mMa蔡胺：称取0.1002g蔡胺用冰醋酸溶液(冰醋酸：水=3：1)定容至Ioom1。【实验步骤】1 .酶液提取称取0.2g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中，分三次参加1.6ml(0.6ml、0.5ml、0.5ml)50mmolL预冷的磷酸缓冲液CpH7.8)在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min,上清液即为酶-粗提液。2 .OF产生速率测定(1)取0.5ml提取液中参力口0.5mlPBS(0.05M,pH7.8),ImlIOmM盐酸羟胺溶液后摇匀，同时做一对照管以PBS代替样品提取液；(2)在25C下保温1小时，假设测定叶片保温后需参加2ml乙醛萃取Chh(3)依次先参加Imll7mM对氨基苯磺酸，再参加Iml7mM-蔡胺，混合后涡旋；(4)在25°C下保温20min后在300Og离心3min；(5)以对照管调零,取粉红色水相液测定OD530。3 .计算结果根据测得的OD530,查NCh标准曲线得到NO2-,依照羟胺与。2.的反响式:NH2OH+2O2+FFNCh-+H2O2+H2O计算0力，即NO2-X2=Q°再根据样品与羟胺反响的时间和样品中的蛋白质含量，求得。2一产生速率(nmolmin"mg蛋白，也可用nmolmin"g"鲜重)。【考前须知】1.样品中假设含有大量叶绿素将干扰测定，可在样品与羟胺温浴后，参加等体积的乙醒萃取叶绿素，再参加对氨基苯磺酸和a蔡胺作NOw的显色反响；2.应用羟胺反响来检测生物材料的含量，必须严格控制反响系统的PH(<8.0,并尽可能降低反响液中的溶解氧和Fe的含量。因为羟胺自动氧化随反响系统的PH值升高而加强,同时随反响液的溶解氧和Fe含量的增加而加强。【参考文献】DesenKe,GuchouSun,ZhengxunWang(2007)EffectsofsuperoxideradicalsonACCsynthaseactivityinchilling-stressedetiolatedmungbeanseedlings.PlantGrowthRegul51:83-91.WangAG,LuoGH(1990)Quantitativerelationbetweenthereactionofhydroxylamineandsuperoxideanionradicalsinplants.PlantPhysiolCommun6:55-57.七碘化钾分光光度法测定过氧化氢田2。2)的含量【实验原理】过氧化氢(H22)既是一种较强氧化剂，又是一种较弱复原剂。它存在范围广，化学性质活泼，对生命体代谢、物质结构性能和环境保护等都有影响。过氧化氢可以与碘化钾发生反响：H2O2+2KIl2+2KOHI2通常以I3-的形式存在于水溶液中。利用L-在352nm有吸收峰这一原理，用分光光度法测定过氧化氢，方法快速简便，干扰少，仪器普及。【仪器、材料与试剂】(一)仪器1 .分光光度计2 .台式离心机3 .电子天平(二)材料1 .三氯乙酸2 .酒石酸3 .碘化钾4 .过氧化氢(30%)5 .Iml移液枪6 .陶瓷小研钵7 .2ml离心管8 .100ml容量瓶(三)试剂1.0.1%TCA：称取0.1g三氯乙酸，用蒸储水定容于IOoml容量瓶中。2. 2%酒石酸溶液：称取2g酒石酸，用蒸偏水定容于IOomI容量瓶中。3. 2.5%碘化钾溶液：称取2.5g碘化钾，用蒸谯水定容于100mI容量瓶中。4. 过氧化氢标准溶液：取含H2O2的30%标准品过氧化氢3ml,稀释至IO(X)ml,用高锌酸钾标定，再分别稀释成100、10、1及0.1mgl的过氧化氢标准溶液。【实验步骤】1 .取Ig植物样品，参加0.5mL的0.1%TCA,在液氮下研磨，研磨后所得匀浆以19000g离心20mino2 .取上清液0.5mL,加2mlIMKl溶液和0.5ml100mM硫酸钾的缓冲液，暗反响lh；3 .反响结束后，以0.1%的TCA为参比，测定在39Onm处的吸光值；4 .标准曲线绘制：分别取浓度为10.00mgl的H2O2使用液0.00,1.00,2.00,3.00,4.00,5.0Oml于100mI容量瓶中,分别参加2ml2%酒石酸溶液,2mlIM硫酸溶液，2ml2.5%碘化钾溶液，用蒸储水定容后，以试剂空白为参比于352nm处，用ICm比色皿测定吸光度A,作AH2O2浓度(mgl)曲线。5 .通过浓度的过氧化氢标准曲线，计算样品中过氧化氢的含量。【考前须知】PH值对吸光度有一定的影响，pH26时吸光度最大且稳定，故实验采用酸度条件为pH260【参考文献】ChakrabartyD.andDattaS.K.MicropropagationofgerberaJipidperoxidationandantioxidantenzymeactivitiesduringacclimatizationprocess.PhysiolPlant,2008,(30):325-331八丙二醛(MDA)含量的测定【实验原理】MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反响，形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物。【仪器、材料与试剂】(一)仪器1 .分光光度计2 .台式离心机(二)材料1 .磷酸氢二钠2 .磷酸二氢钠3 .三氯乙酸4 .硫代巴比妥酸5 .陶瓷小研钵6 .IOml离心管(三)试剂1. 5%的三氯乙酸(TCA)溶液：称取5g三氯乙酸用少量蒸储水溶解后定容于100ml容量瓶中；2. 0.67%(wv)硫代巴比妥酸(TBA)溶液：称取0.67g硫代巴比妥酸用10%三氯乙酸溶液溶解后定容于100mI容量瓶中。【实验步骤】1 .取0.5g样品(叶片或根系)剪碎放入研钵中，参加5ml5%TCA溶液研磨成匀浆后转入离心管中在3000rmin下离心20mi11;2 .取上清液2ml于离心管中，参加等体积的0.67%TBA(硫代巴比妥酸)混和后在100沸水浴中煮30min,用冷水迅速冷却后在3000r/min下离心Iomin；3 .取上清液在450nm、532nm>60Onm下测C)D值(用去离子水调零)；4 .计算组织中MDA含量：MDA浓度C(umolL)=6.45(OD532-OD6oo)-0.560D45MDA含量(Umol/gFW)=CXV/W式中V为提取液体积(L8ml),W为样品鲜重(0.5g)。【考前须知】煮沸后要再进行一次离心【参考文献】KumarGNM,KnowlesNR.Changesinlipidperoxidationandlipolyticandfree-radicalscavengingenzymeactivitiesduringagingandsproutingofpotato(Solanumtuberosum)seed-tubers.PlantPhysiol,1993,102:115124九复原型抗坏血酸(ASA)和脱氢抗坏血酸(DHA)的测定【实验原理】抗坏血酸又名维生素C,以两种形式存在于植物中，即复原型抗坏血酸(ASCorbiCaCid,AA)和脱氢型抗坏血熟(DehydroaSCorbiCaCid,DHA)<,这两种形式可通过氧化复原而互变,因而都具有生理活性。抗坏血酸可以将金属离子复原，使之产生稳定的有色溶液。最通用的是抗坏血酸将Fe?'复原成Fe?+,参加螯和剂后，Fe?+即显色，在络和物最大吸光处测定吸光度，其吸光值同抗坏血酸的浓度成正比。该法可以同时测定抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量，脱氢抗坏血酸用二硫苏糖醇复原成抗坏血酸，通过复原前后吸光值的差值对两种物质定量。【仪器、材料与试剂】(一)仪器1 .分光光度计2 .台式离心机3 .电子天平(二)材料1.偏磷酸4 .磷酸氢二钠5 .磷酸二氢钠6 .三氯乙酸7 .正磷酸8 .红菲罗咻9 .氯化铁10 Iml移液枪11 陶瓷小研钵12 .2ml离心管13 .5mk100mk100omI容量瓶(三)试剂14 5%的偏磷酸：称取5g偏磷酸(HPo3),定容于IoOmI容量瓶中。2. 15OmmOl/L磷酸缓冲液(PBS,pH7.4):：A母液：0.2molL磷酸氢二钠溶液：取Na汨PCh12H2O(分子量358.14)71.7g；B母液：0.2molL磷酸二氢钠溶液：取NaHzPCU2必0(分子量156.01)31.2g。3. 10%TCA：称取0.5g三氯乙酸，用蒸储水定容于5ml容量瓶中。4. 44%正磷酸：称取2.2g偏磷酸(H3PO4),用蒸偏水定容于5ml容量瓶中。5. 0.5%BP-乙醇：称取1.5g红菲罗咻(BP),用无水乙醇定容于5ml容量瓶中。6. 0.3%FeCh:98L称取0.3g氯化铁，用蒸储水定容于IoOmI容量瓶中。【实验步骤】1 .称取Ig植物材料置于研钵中，参加5mL的5%的偏磷酸，在4下下研磨，所得匀浆于22000g离心15min。2 .收集上清液用于测定(AsA+DHA)和ASA的含量。取0.3mL上清液，参加0.75mL含5mmol.L,EDTA的磷酸缓冲液(150mmmol.Ll,PH7.4)和0.15mL10mmoLL,的二硫苏糖醇溶液(DTT)O3 .室温下放置IOmin后，参加0.15mL0.5%N-乙基马来酰亚胺以消除多余的DTT。4 .参加0.6mL的10%三氯乙酸(TCA)、0.6mL的44%正磷酸溶液、0.6mL的0.5%BP-乙醇溶液和0.15mL的0.3%(WV)FeCl3溶液。混匀后40水浴40min,测525nm处的吸光值。5 .ASA的测定过程中以0.3mL水代替DTT和N-乙基马来酰亚胺淇余操作步骤如上所述。DHA为总抗坏血酸与AsA的差值。【参考文献】ZhangJ,KirkhamMB.Antioxidantresponsestodroughtinsunflowerandsorghumseedlings.NewPhytologist,1996,(132):361-373十谷胱百肽过氧化物酶(GPX)活性的测定【实验原理】谷胱廿肽过氧化物酶(GPX)可使过氧化物(如H2O2,ROOH等)复原为相应的氧化物：GPx的活力可用单位时间内催化GSH氧化的减少量表示。GSH可和二硫代对二硝基苯甲酸(DTNB)反响生成黄色的5-硫-22硝基苯甲酸阴离子,在412nm处有最大光吸收,测定该离子的浓度,即可计算出GSH减少的量。由于上述反响在非酶条件下仍能进行,故计算酶活力时,必须扣除非酶反响所引起的GSH减少量。【仪器、材料与试剂】(一)仪器1 .分光光度计2 .台式离心机3 .电子天平4 .水浴锅(二)材料1 .谷胱甘肽(GSH)2 .磷酸氢二钠3 .磷酸二氢钠4 .三氯乙酸5 .5,5-二硫代双硝基苯甲酸)DTNB)6 .过氧化氢(H2O2)7 .柠檬酸8 .移液枪9 .陶瓷小研钵10 .离心管11 .5ml、100mk100Oml容量瓶(三)试剂1. pH7.8磷酸缓冲液A母液：0.2molL磷酸氢二钠溶液：¢(Na2HPO412H2O(分子量358.14)71.7g；B母液：0.2molL磷酸二氢钠溶液：取NaHzPCh2比0(分子量156.01)31.2go0.05MpH7.8A母液228.75ml+B母液21.25mlf定容至100Oml2. 1.OmmolZLGSH（当日配制）3.07mgGSH用PBS溶解至IOmL3. 1.5mmol/LH2O2（当日配制）取30%H2zl5ul,以双蒸水定容至100mI4. 0.6ImmOI/L的三氯乙酸（TCA）5. 0.32molLNa2HPO46. 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）显色液：DTNB20mg力U1%柠檬酸三钠50mL溶解【实验步骤】参加酶提取液l6mL,冰浴研磨匀浆，400OrPm,离心IOmin,取上清液再1200OrPm,离心5min,上清液供酶活性测定用。取上述酶液0.4ml,分别注入酶管与非酶管，并将非酶管加热失活,分别参加1.0mmol/LGSH0.4mL和经37预热的H2O2O.2mL,立即记时3min,再在2支试管中参加0.6ImmOl/L的三氯乙酸（TCA）4mL,300OrPm,离心IOmin,保存上清液，另取2支试管分别参加上述上清液2.0mL；再取1支试管参加蒸储水ImL和TCA1.6mL作空白管，并在以上3支试管中分别参加0.32molL的Na2HPO42.5mL和5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）显色液0.5mL（显色液内含有0.04%DTNB和1%柠檬酸三钠），反响5min,在412nm处比色读取光密度值。活性单位为UmoHgFW。标准曲线制作：取ImmOI/LGSH溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml,以双蒸水稀释至IOmL即得到浓度为0、20、40、60、80、IoOUmO1/L的GSH标准液，取标准液各2.0OmL移入试管中，力口0.32mol/LNa2HPO4溶液2.5ml和DTNB显色液0.5mL反响5min于412nnl波长读取光密度（双蒸水调零）。以扣除非酶促反响后，在37反响每分钟每克蛋白使GSH降低IUmoI为一个酶活力单位，单位为UnK）Img蛋白质min。5.计算方法：A二标准GSH（um）/标准GSH（OD412）即标准曲线的斜率【参考文献】1.eopoldFlohe,WolfangAGAssayofglutathioneperoxidaseinmethodsofEnzymology.1984,105:104-121.HMDAR（单脱氢抗坏血酸复原酶）活性的测定（MUSIafaErkanandWen-ChiHOU,2008,1999）1. MDAR提取：一般取0.2g材料于预冷的研钵中，分三次参加0.05molL（PH7.3）的磷酸钾缓冲液（预冷）1.8ml（难磨的材料可以参加适量的石英砂），在冰浴上研磨至匀浆，然后移到2.0ml的离心管（冲洗），于4°C12000rmin下离心20min,上清液即为MDAR粗提液，将其放入冰箱中备用(-20°C或-80°C,在液氮中迅速冷却)。2. MDAR的测定：酶活性的测定的反响体系包括：2.7ml的预冷磷酸钾缓冲液(0.05molL,pH7.3)+0.1ml的NADH(0.2mmolL)+0.1ml的ASA(LOmmoVL)+0.00Iml的AAO(LOU)+0.Iml的酶提取液，以不加酶液的体系为对照，在340nm下测OD值的变化。参考文献：Wen-ChiHou,Hsien-JungChen,Yaw-HueiLin,Dioscorins,themortuberstorageproteinsofyam(DioscoreabatatasDecne),withdehydroascorbatereductaseandmonodehydroascorbatereductaseactivities,PlantScience,Volume149,Issue2,3December999,Pages151156MustafaErkan,ShiowY.Wang,ChienY.Wang,EffectofUVtreatmentonantioxidantcapacity,antioxidantenzymeactivityanddec