菠萝蛋白酶的提取、分离纯化与活性测定.docx

菠萝蛋白酶的提取、初步别离纯化及活性测定15食安(1)班张凯摘要：本研究运用硫酸筱沉淀法和透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量，得到同一品种及成熟度的菠萝皮经两种不同的纯化方法处理，菠萝皮中的蛋白酶都能被有效纯化，但是蛋白酶活性会损失一局部。关键词：菠萝蛋白酶；透析法；别离纯化；酶活性；刖百菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称,主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同,分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。MarCanO于1891年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶。随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药和化工领域有很好的利用价值。1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解前,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。目前,菠萝蛋白酶的一些功能成分已得到成功别离,并应用于医药领域。随着提取纯化技术的不断进步,高活性的菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工和食品领域。利用菠萝皮别离纯化菠萝蛋白酶，不仅可充分利用资源，拓展菠萝蛋白酶的获取途径和应用空间，还可降低菠萝加工废料对环境的污染；随着市场对菠萝加工产品需求量的增大，对于菠萝皮的研究与利用就显得尤为重要，尤其对最主要的功能成分蛋白酶的别离、纯化与性质的研究更有意义。本文通过对菠萝皮蛋白酶的提取，初步别离纯化及活性测定进展了初步研究，探讨影响菠萝蛋白酶活性的影响因素，并解决实验存在的一些问题。1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝，透析袋截留相对分子质量800014000),0.1molLPH7.8磷酸缓冲液配制(PBS),0.0Imol/LpH7.8磷酸缓冲液配制(PBS),1%酪蛋白，激活剂含20mmol/L半胱氨酸-盐酸盐、Immol/LEDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠),10%三氯乙酸(TCA)。1.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表；AMPUT电子天平：深圳安普特科技；BSllOS分析天平北京赛多利斯天平；DS-I型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZST型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发。2实验方法2.1 菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料20g,将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，参加约60mL预冷的0.1molLpH7.8PBS,持续搅拌1015min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4oC3000rpm离心6min,弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。2.2 盐析研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸筱，边加边搅拌,使溶液最终硫酸铉饱和度为30%,放置于冰水混合物（4）30min后，酶蛋白沉淀析出，44000rpm离心IOmin,收集沉淀，参加0.1molLpH7.8PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。2.3 透析将溶解液装入2.5CmX8cm透析袋（预先将透析袋在蒸僧水中煮沸30min）中，于50OmL烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸储水透析，15min换水一次，换水34次后，检查S（2-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCb溶液放入一支试管，滴加23滴透析外液至试管中，假设出现白色沉淀，表示S（2-未除净，假设无沉淀出现，表示透析完全）。假设透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。2.4 酶活力测定方法取2支试管，设置一支为实验对照，三支为平行样品。取0.1mL酶液，参力口0.9mL激活齐J,参加37预热的1%酪蛋白溶液ImL,准确反响IOmin,参加10%三氯乙酸3mL反响终止酶反响。对照管先参加10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管一样。离心(3000rmin,5min)或过滤，清液于28Onm波长下测定光吸收值。酶活单位定义：在上述条件下，每IOmin增加0.001个光吸收值为1个酶单位U)。实验步骤按照表格中完成。表1酶活测定步骤试剂(ml)对照组平行样品I平行样品2平行样品3TCA3一酶液0.10.10.10.1激活剂0.90.90.90.9酪蛋白111137准确反响IOminTCA333粗提0.7910.8180.868A280nmOD盐析0.8230.9070.986值透析0.8940.8750.8482.5 蛋白质含量测定方法将酶液稀释至一定程度,采用考马斯亮兰G-250法测定溶液中可溶性蛋白的含量(参照附录1)。3实验结果与分析3.1 蛋白质含量计算3.1.1 标准曲线的绘制表XO-IooOUg/ml标准曲线的绘制管号123456IOoogmL牛血清白蛋白00.20.40.60.81.0蒸储水(mL)1.00.80.60.40.20蛋白质浓度(gmL)0200406008001000吸光值(A595)00.1570.2450.3910.5350.656得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、100OugZmL,准确吸取各管溶液0.1mL,参加5ml考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min,测定595nm吸光值，绘制O-100OUgmL标准曲线。图1蛋白吸光值标准曲线3.1.2 样品的测定准确吸取样品溶液SlmL放入具塞刻度试管中，与步骤(1)操作一样，测得样品的光吸收值A595nmo3.1.3 结果计算由标准曲线可查出相应的蛋白浓度(ugmL),可按如下公式计算出样品中蛋白含量。查出的蛋白提取液浓度(gmL)X定容体积(mL)样品蛋白含量(g/g鲜重)=样品重量(g)样品蛋白质含量(粗提纯)=(517.7X62)/20.00=1604.9(gg)样品蛋白质含量(盐析)=(706X16)/20.00=564.8(gg)样品蛋白质含量(透析)=(1017.7X13)/20.00=661.5(gg)3.2 酶活力计算最后酶活结果取3次重复实验的平均值。A280nm酶液活力(UmL)=X稀释倍-步骤空白0.001×0.1q亍2平行3平均值A280nmOD粗提0.7910.8180.8680.826值盐析0.8230.9070.9860.905透析0.8940.8750.8480.872,A280nm×稀释倍数0.856X1粗酶液活力UmL）=egXOi-=而0X0.1=8257U/mL,A280nmX稀释倍数0.905X1盐析酶液活力（U/mL）=-0.001X0.1=o,ooX0,1=9053u/mLA280nmX稀释倍数0.872×1透析酶液活力（U/mL）=OOOlXOi-=o,o0X（H=8723U/mL3.3 酶比活的计算酶比活（Umg蛋白）二酶活力/酶蛋白质含量酶活力8256粗酶比活（Umg蛋白）=,蛋后质含量=加旃=5141.8（Umg蛋白）酶活力9053盐析酶比活（Umg蛋白）二酶蛋白质含量=o.5648=16029.3（Umg蛋白）酶活力8723透析酶比活（Umg蛋白）二酶蛋白质含量=菽元=13183.2（Umg蛋白）3.4 酶纯化过程中回收率计算回收率（%）=（纯化酶总活力/粗筋液总活力）×100=（纯化酶活力X纯化酶液体积）/（粗酶活力X粗酶体积）X100盐析回收率(%)=(9053x16.0)/(8256×62.0)=28.30%透析回收率(%)=(8723x13.0)/(8256x62.0)=22.15%3.5 酶纯化倍数的计算纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力盐析纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力=16029.3/5141.8=3.12透析纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力=13183.2/5141.8=2.563.6 分析及讨论将测定的数据整理计算分别填入下表，并菠萝蛋白酶的别离纯化效果进展分析和讨论。表X菠萝蛋白酶别离纯化表4腕总体积总蛋白质含量总活力比活力（U/mg蛋白）回收率（%）纯化倍数ImL)(mg)(U/mL)粗提6232.128256.675141.78-盐析1611.309053.3316029.2728.303.12透析1313.238723.3313183.2122.152.56图X菠萝蛋白酶活比照图4实验结论与讨论本次实验菠萝蛋白酶经过了粗提纯、盐析及透析三个步骤的别离纯化，结果得到粗提纯的蛋白质浓度最高，透析后蛋白质浓度最高，盐析次之；理论上，粗酶蛋白浓度应该比偷袭盐析低。原因可是盐析和偷袭操作不当导致菠萝蛋白酶损失严重，或者盐析后的沉淀无法完全溶解也可能导致溶液中蛋白质含量降低。盐析以及透析后菠萝蛋白酶的活力比粗酶高，这可能是因为未盐析透析之前，菠萝蛋白酶受例如金属离子等因素影响，导致蹙眉的酶活力和酶比活比盐析和透析低。由菠萝蛋白酶别离纯化表可知，盐析和透析得到的酶回收率都不高。可能是实验中参加的硫酸筱并没有充分溶解，导致局部硫酸铁含量过高，使得蛋白酶变性失活，最终影响蛋白酶的回收率。在纯化倍数上，盐析的纯化倍数比透析的纯化倍数要高一些，这是与两个处理环节得到酶活力及蛋白质含量有关，盐析后酶的浓度比透析的高，所以盐析的纯化倍数会更高。【思考题】1 .若何防止酶在别离纯化过程中发生变性失活酶的变性失活主要与有机溶剂、金属离子、高温、高酸碱等因素有关。所以在别离纯化时注意：不能用自来水配制透析液；不使用不清洁的仪器设备；控制反响温度，防止高温。2 .常见的酶活性表示方法有那些如：U/ML酶液；U/MG蛋白质;U/G干重或鲜重;U/G酶粉等它们各有什么含义，适用哪些场合UZmL能液用来表示每单位体积酶液中的酶活力情况，适用于表示液体酶中的酶活力大小。U/mg蛋白质用来表示单位质量样品中的酶活力情况，适用于表示含一种或多种蛋白的样品中的酶活力大小。U/g干重或鲜重用来表示每克原始样品中的酶活力情况，适用于原始样品的酶活力表示。U/g酶粉表示每克酶粉中的酶活力情况，适用于酶制剂的酶活力测定或者酶制剂的相应浓度配制。3 .蛋白质的沉淀作用还有哪些方法哪些变性了哪些没有变性沉淀蛋白质常用的方法：单宁沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂法、重金属法、生物碱试剂法。其中有机溶剂法、单宁沉淀法、重金属法、生物碱法往往会使蛋白质变性，等电点沉淀法通常不会使蛋白质变性。4 .实验中硫酸核盐析为什么要选择0%30%饱和度在0-30%的饱和度范围内，菠萝蛋白酶的酶回收率随着饱和度的增大而增大，当超出这个范围时菠萝蛋白酶的回收率降低。因此，本次实验选择在盖饱和度范围内进展盐析处理。参考文献山吴茂玉,马超,乔旭光,宋炜,赵岩.菠萝蛋白酶的研究及应用进展臼.食品科技,2008(08):17-20.陈伟杰.菠萝皮蛋白酶的制备、特性及应用的研究D.锦州医科大学，2016.梁宏宇.菠萝蛋白酶提取方法的研究D.广西民族大学,2012.原始数据1 .测定体积步骤总体积(mL)粗提取61+1盐析15÷1透析132 .考马斯亮兰G-250法测定溶液中可溶性蛋白的含量步骤空白组平行1平行2平行3粗提0.3210.4810.487A595nmOD值盐析0.4340.4560.360透析0.6210.6780.4783.酶活测定步骤空白平行1平行2平行3粗提0.7910.8180.868A280nmOD值盐析0.8230.9070.986透析0.8940.8750.848