牙膏中铜绿假单胞菌检验方法.docx
附件14牙膏中铜绿假单胞菌检验方法DetectionofPseudomonasAeruginosainToothpaste1范围本规范规定了牙膏中铜绿假单胞菌的检验方法。本规范适用于牙膏中铜绿假单胞菌的检验。2定义铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，大部分能产生绿脓菌素。3仪器3.1 恒温培养箱：36°C±l0C42oC±loCo3.2 三角瓶：250mL。3.3 试管：18mmxl50mm03.4 灭菌平皿：直径90mm。3.5 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、IomL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸头。3.6 显微镜。3.7 载玻片。3.8 接种针、接种环。3.9 电磁炉。3.10 高压灭菌器。3.11 恒温水浴箱。4培养基和试剂4.1 SCDLP液体培养基见总则3.1。4.2 十六烷基三甲基溪化镂培养基成分：牛肉膏3g蛋白陈10g氯化钠5g十六烷基三甲基澳化铉0.3g琼脂20g蒸储水100OmL制法：除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调PH为7.47.6,加入琼脂，115C高压灭菌20min后，制成平板备用。4.3 乙酰胺培养基成分：乙酰胺10.Og氯化钠5.0g无水磷酸氢二钾1.39g无水磷酸二氢钾0.73g硫酸镁(MgSo4.7H2)0.5g酚红0.012g琼脂20g蒸馆水IooOmL制法：脂、酚红，除琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸储水中，加热溶解，调PH为7.2,加入琼121C高压灭菌20min后，制成平板备用。4.4绿脓菌素测定用培养基成分：蛋白陈20g氯化镁14g硫酸钾10g琼脂18g甘油(化学纯)IOg蒸储水IOoomL制法：将蛋白陈、氯化镁和硫酸钾加到蒸储水中，加热使其溶解，调PH至7.4,加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，115C高压灭菌20min后，制成斜面备用。4.5 明胶培养基成分:牛肉膏3g蛋白陈5g明胶120g蒸储水IooOmL制法：取各成分加到蒸储水中浸泡20min,随时搅拌加热使之溶解，调PH至7.4,分装于试管内，经115C高压灭菌20min后，直立制成高层备用。4.6 硝酸盐蛋白陈水培养基成分：蛋白陈10g酵母浸膏3g硝酸钾2g亚硝酸钠05gIOOO mL蒸储水制法：将蛋白豚和酵母浸膏加到蒸储水中，加热使之溶解，调PH为7.2,煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，115高压灭菌20min后备用。4.7 普通琼脂斜面培养基成分：蛋白陈10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15g蒸储水1000mL制法：除琼脂外，将其余成分溶解于蒸谯水中，调PH为7.274,加入琼脂，加热溶解，分装试管，121高压灭菌20min后，制成斜面备用。5操作步骤5.1 增菌培养：取1:10检液IOmL加到90mLSCDLP液体培养基中，置36C±1°C培养18h24ho如有铜绿假单胞菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。5.2 分离培养：将增菌后的培养物，划线接种在十六烷三甲基澳化较琼脂平板上，置36C±C培养18h24k凡铜绿假单胞菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素。在缺乏十六烷三甲基滨化俊琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离,将增苗后的培养物划线接种于平板上，置36C±1°C培养24h±2h,铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基呈红色，其他菌不生长。5.3 纯化：挑取可疑菌落划线接种于营养琼脂平板上纯化，于36C±1°C培养18h24h.5.4 染色镜检:挑取可疑的菌落,涂片,革兰氏染色（见牙膏中耐热大肠菌群检验方法4.6.2）,镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。5.5 氯化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片置于灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一-滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在15s30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化能试验阳性；若培养物不变色，为氧化酶试验阴性。5.6 绿脓菌素试验：取可疑菌落2个3个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，置36C±1培养24h±2h,加入三氯甲烷3mL5mL,充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于三氯甲烷液内，待三氯甲烷提取液呈蓝色时，用吸管将三氯甲烷移到另一试管中并加入ImolzL的盐酸ImL左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。5.7 硝酸盐还原产气试验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在硝酸盐陈水培养基中，置36C±1°C培养24h±2h,观察结果。凡在硝酸盐陈水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。5.8 明胶液化试验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置36±1培养24h±2h,取出放置于4±2冰箱Iomin30min,如仍呈溶液状或表面液化时即为明胶液化试验阳性；如凝固不溶者为阴性。5.9 42C生长试验：挑取可疑的铜绿假单胞菌纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置于42C±1°C培养箱中，培养24h48h,铜绿假单胞菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。5.10 如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统，可从营养琼脂平板上挑取经纯化的可疑菌落，用无菌稀释液制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。6检验结果报告被检样品经增菌分离培养后，平板上有可疑菌落，并经证实为革兰氏阴性杆菌、氧化醐及绿脓菌素试验皆为阳性，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而明胶液化、硝酸盐还原产气和42C生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。
