2024常规体外受精中国专家共识（完整版）.docx

2024常规体外受精中国专家共识(完整版)摘要常规体外受精(conventionalinvitrofertilization,c-IVF)是利用优化后的精子与卵母细胞自然结合完成IVF的一类辅助生殖技术，主要应用于女性因素不孕、部分男性因素不育及不明原因不孕不育患者的助孕治疗。但目前尚缺乏C-IVF相关的操作标准或共识，尤其对于如何选择最佳授精方式以避免受精率低下或完全受精失败的发生，始终是困扰辅助生殖临床医生与胚胎实验室人员的难题。因此，由中国医师协会生殖医学专业委员会发起，并联合全国多家生殖医学中心共同编撰了本共识，旨在规范C-IVF的选择标准、精液优化处理及授精操作流程，为辅助生殖临床医生和胚胎实验室人员提供实用性参考，以期获得稳定且满意的辅助生殖助孕结局。【关犍词】生殖技术，辅助；常规体外受精；精液参数；精液优化方式；授精方式；共识常规体外受精(conventionalinvitrofertilization,c-IVF)是人类辅助生殖技术(assistedreproductivetechnology,ART)中被广泛应用的授精方式之一，其主要是针对女性因素(如输卵管性不孕、子宫内膜异位症、排卵异常及宫颈因素等)、部分男性因素(如轻、中度少弱畸形精子症)及不明原因不孕不育(卵巢功能评估、输卵管通畅度评估及男性精液分析均正常)患者所采取的治疗方案。相较于卵胞质内单精子注射(intraCytoPIaSmiCSPerminjection,ICSI)技术而言，C-IVF的精卵结合方式更接近人类生理状态，实验室操作也相对简单。然而在精液参数正常的情况下，C-IVF仍然有20%左右的取卵周期发生受精率低下(lowfertilizationrate,LFR,<25%)及5%15%的取卵周期发生完全受精失败(totalfertilizationfailure,TFF)1o目前尚缺乏C-IVF的操作标准或共识，尤其对于精液参数处于临界值的病例，授精方式的选择多根据临床医生和胚胎实验室人员的经验并结合患者病史决定，虽然做到了个性化处理，但由于缺乏有力数据的支持,无法避免发生LFR和TFF的风险。部分中心为了避免受精失败的发生，则会选择对全部或部分卵母细胞行ICSI技术授精，无形中导致了ICSl技术的过度应用。本共识根据国内外发表的文献，并结合长期实践经验，经过专家讨论制定而成。通过对C-IVF选择标准、精液的优化处理、授精操作、授精时机的选择、短时受精及早期受精判断、受精失败的补救措施、受精观察、其在胚胎植入前遗传学检测(preimplantationgenetictesting,PGT)与无创胚胎染色体筛查(non-invasivechromosomescreening,NICS)的应用、质量控制及胚胎实验室新员工培训与考核等多方面进行详细阐述，并提出相应推荐意见，以期为辅助生殖临床医生和胚胎实验室人员提供实际可行的建议和指导。一、C-IVF的精液标准世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册(第六版)XWHO手册第六版)提出的正常男性精液质量下限参考标准(第五百分位值)：精子总量为39x106、精子浓度为16x106/mL、前向运动精子率为30%、正常形态精子率为4%2,但该下限标准对ART治疗中是否可以选择C-IVF缺乏指导意义。因此，仍需制定一个可以选择C-IVF授精方式的精液质量下限标准。对于少、弱精子症患者（精子浓度20×10mL和/或精子活动率40%,WHO手册第四版3）授精方式选择的一项随机对照试验研究中，将106个取卵周期的1518枚卵母细胞进行随机分配，行C-IVF（669枚）或ICSI（849枚）,结果表明ICSl组受精率（50%）高于C-IVF组（41%）,且C-IVF组发生TFF的风险要明显高于ICSI组4；另一项随机对照试验研究分别对少精子症组精子浓度（5-20）×106mL,WHO手册第四版与少弱精子症组精子浓度（5-20）106mL且前向运动精子10%32%,WHo手册第四版的卵母细胞行C-IVF或ICSIz结果表明两组不同授精方式间的受精率差异没有统计学意义5。但目前尚缺乏基于最新版WHO手册少弱精子症诊断标准的相关研究。鉴于ART治疗所使用的精子通常是经密度梯度离心或上游后所获得的活力较高的精子，因此将处理后的精子参数作为受精结果的预测指标更为合适。一项回顾性研究显示，当处理后前向运动精子总数（totalprogressivelymotilespermcellcount,TPMC）1.1×106时发生TFF的风险25%6o另一项对112个同时行C-IVF和ICSI周期的回顾性研究显示,ICSI受精而C-IVF未受精周期的处理后活动精子总数（1.06±0.9）×10显著低于C-IVF与ICSI均受精周期的处理后活动精子总数（4.4±3.4）x106,表明优化处理后的活动精子总数为较好的预测受精失败的指标；该研究将处理后活动精子总数<1.5X106作为临界指标，结果显示其对C-IVF受精失败的预测灵敏度为80%7。聂玉林等8的一项回顾性研究表明，上游后前向运动精子回收率45%和TPMC<1.0×10,是影响受精率的高危因素。针对畸形精子症的最佳授精方式选择同样存在争议。一项荟萃分析表明：虽然单纯畸形精子症行C-IVF可能影响受精率，但与其行ICSI或与正常精子形态行C-IVF的妊娠结局相比差异均无统计学意义9o近期的一项回顾性研究对畸形精子症做了进一步区分，结果表明，当96%<精子畸形率98%时，C-IVF组与ICSI组的受精率、卵裂率、人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)阳性率、临床妊娠率和活产率差异均无统计学意义；当精子畸形率>98%时，c-IVF组卵裂率、hCG阳性率、临床妊娠率和活产率显著低于ICSl组10。但对于特殊类型的畸形精子症，如圆头精子症、无头精子症、大头精子症、精子鞭毛多发形态异常等，采用C-IVF不能实现正常受精。该类精子畸形可能具有遗传性，需根据精子缺陷类型选择个体化的ART助孕11。推荐意见1:(1)对于精子浓度、活力均正常的样本可以采用短时或过夜C-IVF授精方式。(2)对于精子浓度、活力处于临界值的样本，尤其精液优化处理后TPMC<1.5x106,建议采用短时受精结合早期脱颗粒的C-IVF方式。(3)当精液优化处理后TPMC<1.0X106,尤其获卵数较多时，可在签署知情同意的情况下对部分或全部卵母细胞行ICSI技术以保障正常受精。(4)目前尚无有力证据表明单纯畸形精子症对C-IVF的受精率及妊娠结局产生不利影响，但对于特殊类型的畸形精子症患者(如圆头精子症、无头精子症、大头精子症、精子鞭毛多发形态异常等)，则需要根据精子缺陷的种类及其致病基因，选择ICSI或供精治疗11。精液质量参数与推荐授精方式详见表1。表1精液质量参数与推荐授精方式推荐授精方式精子浓度(×106mL)前向运动精子率()TPMC短时/过夜受精>162301.5×106短时受精结合早期脱颗粒51610-30i.o×io6tpmc<1.5×106部分ICSl或ICSl<5<10<1,0×106注：ICSl示卵胞质内单精子注射;TMPC示前向运动精子总数;精子浓度、前向运动精子率为优化处理前参数,TPMC为优化处理后参数二、精液优化处理ART治疗中精液优化处理的主要目的是最大限度地提高优质精子浓度，减少非前向运动精子、不动精子、形态异常精子、未成熟的生精细胞和白细胞，以及去除精浆中抑制精子获能的因子、细胞碎片和其他可能产生负面影响的有害物质(如活性氧、微生物或导致子宫收缩的化合物等)12,但目前尚无一种方法可以满足上述所有要求，因此可以根据不同精液质量，选择合适的精液优化处理方法。临床上常用的精子制备技术有上游法(swim-up,SU)和密度梯度离心法(densitygradientcentrifugation,DGC)关于两种方法进行精液优化处理的效果比较，多数是通过处理后的精子浓度、前向运动、正常形态、精子DNA碎片比例、线粒体膜电位及活性氧水平等方面进行对比，但两种处理方法的优劣尚无一致的结论13。多项研究表明,DGC法较SU法具有更高的精子回收率(分别为20%和20%),而SU法可以获得更高的前向运动精子比例2l14-15一项回顾性研究分析了719个经DGC处理和719个经SU处理的c-IVF/ICSI周期治疗结局，结果显示累计活产率、每移植周期活产率以及其他临床和胚胎实验室结果差异均无统计学意义16。也有学者认为,DGC联合SU应用效果较优，与单独SU相比，联合应用可提高正常形态精子获得率；与单独DGC相比，联合应用可有效减少超微结构异常精子比例、降低精子DNA碎片率和核不成熟比例17另外，值得注意的是DGC相对SU更容易做到标准化2,相对便于胚胎实验室精液处理的质量控制。近些年，微流控技术也开始应用于ART的精液优化处理，其模拟精子在女性生殖道中经过生理性筛选的过程，具有分选高效、操作简便快捷、对精子DNA损伤少等优势18-20o与传统精液优化处理方法相比较，微流控技术是否能改善生殖结局，仍需更多的临床数据证实。推荐意见2:(1)鉴于目前尚无充分证据证实DGC和SU对C-IVF治疗结局有差异，因此单独使用或者两种方法联合使用均可作为C-IVF精液优化处理的常用技术。(2)对于精液参数正常的样本，可优先使用SU法。(3)而对精子浓度较低的样本，或精子浓度较高但活力较低、供精、精液内伴有大量圆形细胞、精子凝集程度较高的样本，或男方存在感染因素的样本，建议使用DGC法或DGC联合SU法进行精液的优化处理2,21-22三、授精操作及调整授精浓度每个ART胚胎实验室均有符合本实验室操作规范的授精操作方式及授精器皿，目前尚无统一的要求或规范。常用受精皿包括：圆形皿（微滴法）、中央孔皿（双井皿）、四孔板等。不同受精皿对应的受精液体积也有所不同，中央孔皿或四孔板通常为0.51.0mL,微滴法通常为30-100Lo加精的方式常见以下3种：将精子调整至合适浓度，通过计算吸取合适体积的精子悬液，加入含有卵丘-卵母细胞复合物（cumulus-oocytecomplexes,COCs）的培养液中,此法适用于使用中央孔皿或四孔板受精；根据受精液体积，加入适当浓度精子，然后再加入COCs,此法多用于微滴法受精；用预平衡的受精液将精子稀释至合适浓度，然后制成微滴或加入中央孔皿或四孔板中，再加入COCse为防止培养液PH值和温度发生改变，建议平衡时间至少1ho尽管受精过程中精子的浓度范围较宽，但所获得的总受精率却相近23而有研究显示，随着精子浓度的增加，多精受精的比例逐渐上升，临床妊娠率逐渐下降24。因此，在保障稳定受精率的前提下，精子浓度应尽量控制在较低的范围。推荐意见3:（1）目前尚无有力证据表明不同的受精皿、受精液体积及加精方式对C-IVF结局有影响，因此各中心可根据操作习惯和工作流程进行选择。（2）本共识建议授精浓度为3050L的液滴内加前向运动精子500010000条，或1mL的培养液内加前向运动精子10万30万条。（3）是否对COCs卵丘细胞进行切割目前尚无统一规范，但建议尽量将血块切割去除，避免将红细胞带入卵母细胞孵育液或受精液中。（4）胚胎实验室宜结合自身条件与特点进行具体方法改良，比如可进一步根据精子在镜下的活力情况、卵母细胞数量、卵丘成熟度、过夜受精或短时受精方式，灵活调整精子添加浓度，形成符合自身条件的标准操作流程。四.授精时机促排卵周期中卵母细胞会存在细胞核与细胞质发育不同步的情况，因此理论上对卵母细胞进行短时间的体外孵育有利于细胞质的进一步成熟，从而提高受精率和临床妊娠率25。几十年来关于卵母细胞授精前孵育时间的相关研究较多，但最佳孵育时间却较为宽泛且观点并不一致26-40,详见表2。表2授希前聊母/«£生隹财斤时间的相关研克伟挎（发衣年份）MiMft及Wu式“H的加育时何不利的M育时网主饕影也指标TnMIitMMiAO,rtmI.(I9S290ClVF5-5JIi受桃率HurriM)nKL.rtnl.<I9WI”716rIVF3-16h<2h>20b修床好改冬Fm4R.rU(19部产I2%<-IVF0.5-91/IKiciuiI.H>1.(1998),*95i<l>3bOh受精中,优质胚肪率Jar<>h.M.rial.(2001)l*I313LIVF/ICSl1-7MNh/无法“H<,JY.Hal.(2003)”"240-IVFCS123-53h(rIVF)Csil或>5.SMcIVFh<2.5(ZVF)受Wl率（TVF.成熟“储Me比例（ICsnImMmrlal.<2OM)gI260ICSI27卜Oli受精率.哪我率.优MiHJlft卡Fak<HM-P.cla!.<200)”135ICSIXli>7h受M卡.卵裂率.修床桩修率BArVEiIP.Cltd.(2016)"39K6ICSIIh25min-17b13ain/ljd.rtal.(20l)nl146KICSII-I15b*68育时IH延K.h：GRlH率和的床妊&率逐渐卜降CarvalhoM.H2020)kImICSI<6h>6h淅户”.累计活产率MrnbrrLTM.rtL<2O2l)lnS811IOIO-Mlh/SmilhMR.rial.<2020m12ICSI2-6h/EdsFM.U(2021产9575737ICSIIXSll<15h或>6.5h(7VF)4精率SillhN.rt.<2O22>8726ICSI24/注:EV东南烷体外受附；ICSl示卵*矶内千样注射;M：（；示人战心腕保竹谶素;“广加文中无Kl美内容近期一项纳入了9575个周期的大型回顾性研究显示，不同的孵育时间对C-IVF卵母细胞受精能力的影响不同（1.5h受精率显著降低,而受精率提高可能增加累积妊娠率），而胚胎发育及妊娠结局却无明显差异39。因此该研究认为，体外孵育时间对卵母细胞的发育潜能无显著影响，可根据胚胎实验室的工作流程在一定时间范围内（孵育1.56.5h）安排授精时机。另外，适当延长扳机至取卵的间隔时间（3638h）同样有助于卵母细胞胞质的进一步成熟（体内成熟），从而改善临床结局41,因此授精时机的选择应结合扳机时间来决定。也有学者在授精前将COCs置于体外成熟培养液中孵育，发现可以促进胞质的成熟并提高囊胚形成率42。推荐意见4:鉴于各中心促排卵方案、扳机时间、取卵时机及患者个体间的差异，导致成熟卵母细胞（Mil）比例有所不同或卵母细胞间胞质成熟度不一致，因此授精时机的选择应综合考量后合理安排时间节点。本共识建议根据取卵后COCs的状态选择个体化的孵育时间,正常情况下建议在扳机后3840h内完成授精。五.短时受精短时受精是将精卵共孵育的时间由过夜受精的1624h缩短至16h的一种C-IVF衍生技术43。有研究显示，精子产生的活性氧可促进卵丘细胞的凋亡44,且卵母细胞长期暴露在高浓度的精子中可能会对早期胚胎发育产生负面影响45。另外Li等46的研究显示，过夜受精组受精液中的钱离子浓度显著高于短时受精组，缩短受精时间可以显著降低早产率。早期的荟萃分析显示，缩短精卵共孵育的时间会增加临床妊娠率、持续妊娠率及种植率43。但也有研究提示，尽管短时受精比过夜受精在提高优质胚胎率、种植率和持续妊娠率方面具有优势，但受精率有所降低，且活产率和临床妊娠率并未提高47。短时受精分两种：将COCS从受精液移至新的培养液中继续培养;将COCs移出受精液后对其进行脱颗粒,去除卵丘细胞及放射冠,使卵母细胞透明带完全或大部分暴露，该方法可以同时观察第二极体的排出情况，有助于尽早预测受精失败从而避免LFR或TFF的发生。现有研究尚不能证实短时受精可显著改善ART治疗结局。对于LFR或TFF高风险病例（如精液参数处于临界值、不明原因不孕、不孕年限较长、多次人工授精失败等），可选择脱颗粒后进行早期受精预判。但需注意的是，受精早期颗粒细胞较为致密，脱颗粒过程中的机械应力可能对受精卵产生不利影响48;另外，早期脱颗粒或与多精受精相关47,49-51对于继发不孕且精液质量较好或既往C-IVF受精正常的病例，可采用过夜受精或不进行脱颗粒操作的短时受精。推荐意见5:（1）鉴于尚无更充分的证据表明过夜受精与短时受精在活产率方面存在差异，因此两者均可作为C-IVF的常规授精方式。（2）对于不明原因不孕、多次人工授精（3次）失败、原发性不孕、继发不孕年限5年且无其他明显器质性疾病（如双侧输卵管阻塞、宫腔粘连等）和/或精液质量处于临界值的周期可以采用短时受精结合早期脱颗粒方式，通过观察第二极体排出情况，对受精情况进行早期预判。（3）对于继发不孕5年且精液质量较好的周期，若采用短时受精，也可考虑不进行早期卵母细胞脱颗粒或部分脱颗粒。（4）对于获卵数3枚的周期，为避免误判可考虑采用过夜受精或短时受精而不进行脱颗粒观察。如果有条件，也可早期脱颗粒后利用纺锤体观测仪辅助判断受精与否。六、JlVF受精失败的补救ICSl在行C-IVF周期中，当第1天（授精后1824h）发生TFF时，可以对未出现原核的卵母细胞（仅明确见第一极体）进行ICSIz即晚期补救ICSI（laterescueICSI,L-RICSI）o虽然通过L-RICSI可以对部分病例进行挽救，但效果并不理想52。2003年早期补救ICSI（earlyrescueICSIxE-RICSI）被首次提出，即通过观察授精后6h的卵母细胞是否排出第二极体来判断受精情况，并对明确未受精的卵母细胞（未见第二极体排出）实施补救ICSI53oE-RICSI相较于L-RICSIz可以减少卵子老化对胚胎发育的影响,并且胚胎发育与子宫内膜生长的同步性也更好。事实证明，E-RICSI可以获得比较满意的治疗结局54-55目前尚无证据表明L-RICSI/E-RICSI（相较于c-IVF/ICSI）会对子代安全产生负面影响，但相关研究有限,亟需更多的长期随访数据进行评估52,54-57。多数情况下，典型的第二极体较容易判断，但若极体碎裂或因第二极体排出推迟，则容易造成误判进而出现医源性多精受精48,53尤其部分卵母细胞受精失败的周期，行早期补救ICSl会增加多精受精的风险58o对于获卵数3枚的早期受精观察，误判的风险也会增高，同时也给胚胎实验室人员带来压力。因此早期受精观察的时机和准确的判断尤为重要。另外，对于ACROSIN基因突变导致的C-IVF受精失败，通过E-RlCSl可以实现正常受精59;但对于PLCACTUk、ACg/Q。V等基因突变导致的受精失败则需要利用ICSI结合人工卵母细胞激活才可能实现正常受精60。因此，对于E-RICSI依然受精失败的患者，条件允许的情况下可以进行受精失败相关基因的遗传学检查，以明确病因指导后续ART治疗。推荐意见6:（1）E-RICSI的效果明显优于L-RICSI52,对于已实施L-RICSI的周期，可以考虑将胚胎培养至囊胚阶段，再行复苏周期移植56,61o（2）目前仍然以第二极体的排出作为早期受精判断的依据，也可结合纺锤体观察进行辅助判断。（3）建议短时受精时精卵共孵育45h后再行脱颗粒，当含有第二极体的卵母细胞比例30%50%时（分母为成熟卵母细胞），应延迟至授精后6h再行观察，若含有第二极体的卵母细胞比例仍50%,可行补救ICSI;鉴于临床结局与补救推迟的时间呈负相关62建议授精后7h之内完成补救ICSI63o对于透明带异常卵母细胞（如蜡样透明带），发现无第二极体排出时即直接行补救ICSI操作。七.受精观察C-IVF的原核观察时间点通常为授精后(17±1)h64,即出现2个原核(twopronuclei,2PN)及2个极体为正常受精65;出现1个原核(monopronuclear,IPN)或2个原核为异常受精；未见原核(nonpronuclear,OPN)多数情况为未受精，也有少部分是原核出现的时间不在观察时间点内66。因此，结合相关的新技术避免误判对于胚胎实验室正确观察和处理卵母细胞非常重要。推荐意见7:(1)不建议将C-IVF的IPN或OPN来源的胚胎直接丢弃,尤其对于高龄或卵巢储备低下的患者。由于囊胚培养有利于筛选正常胚胎67-69,故建议对OPN或1PN来源的卵裂期胚胎进行囊胚培养，若形成可利用囊胚，经充分知情同意后再行冷冻保存或移植。如果对这部分胚胎进行遗传学筛查，在筛选整倍体胚胎的同时还需进一步排除单亲二倍体及多倍体胚胎70-72o由于安全性尚需进一步的研究和评估,故临床移植OPN或1PN来源的胚胎仍需谨慎73(2)对于有条件的中心，也可以考虑将短时受精并脱颗粒后的卵母细胞放入时差成像系统进行培养和观察，以避免原核早消失造成的误判。八、JlVF在PGT与NlCS周期的应用2020年欧洲人类生殖与胚胎学会发布的PGT指南依然推荐将ICSI作为PGT周期的首选授精方式74。选择ICSI的主要目的是避免精子携带的父源性遗传物质的干扰及颗粒细胞引起的母源性污染。但近几年的相关研究显示,PGT周期中应用C-IVF同样可以获得与ICSI相似的胚胎发育结局和遗传诊断结果75-78。因此，对于非男性因素不育行PGT的病例，ICSI是否仍然作为首选授精方式产生了争议。2020年美国生殖医学学会和辅助生殖技术学会发布的非男性因素ICSI适应证委员会意见中指出，在非男性因素行PGT周期的情况下，ICSI仅限在精子DNA可能对检测结果准确性造成影响的情况下应用79这归因于部分扩增技术(如MALBACxPicoPLEX)较难扩增出精子DNA,父源性污染的发生率可忽略不计77,80o但多重置换扩增技术(multipledisplacementamplification,MDA)中使用的碱裂解法对细胞裂解效力更强，可以实现精子DNA的扩增，因此基于MDA的PGT周期不能选择C-IVF作为授精方式7802023年国际生殖遗传学学会发布的PGT指南认为，使用囊胚滋养层细胞活检结合第二代测序(next-generationsequencing,NGS)技术的PGT周期，可以采用C-IVF作为授精方式，但应尽量避免附着在胚胎上的精子或颗粒细胞的污染81。同样，也有研究表明在NICS周期中，利用C-IVF与ICSI来源的囊胚培养液进行NICS检测的结果相似，并且检测结果的准确性与滋养层细胞活检相比无差异82。推荐意见8:(1)本共识建议ICSI作为PGT周期的首选授精方式。对于胚胎植入前非整倍性检测(preimplantationgenetictestingforaneuploidies,PGT-A)周期也可考虑选择C-IVF作为授精方式，但应严格限制使用条件并签署知情同意书。(2)基于MDA的PGT周期仍需选择ICSI授精。(3)应用NICS技术进行胚胎优选，可考虑选择C-IVF授精。九.C-IVF的质量控制及胚胎实验室新员工培训与考核1 .C-IVF的质量控制指标及参考标准根据2017年维也纳共识65及胚胎实验室关键指标质控专家共识83中的指导意见，将C-IVF实验室质控指标的计算方式及参考标准归纳如下，详见表3表3cJVF实验室质控指标及参考标准质控指标计算质控标准正常受精率=授精后16-18h出现260%75%2PN及2PB的卵母细胞数/行授精的CoCS总数X100%（最低标准）（理想标准）受精失败率=受精失败周期数/行授精周期数X100%<5%多PN率=大于2PN卵母细胞数/行授精的CoCS总数X100%IPN率=IPN卵母细胞数/行授精的<6%COCS总数X100%<5%注：正常受精率和受精失败率为关键质控指标；多PN和IPN率为一般质控指标;PN示原核；PB示极体;COCS示卵丘.卵母细胞复合物2 .辅助生殖实验室新员工培训与考核:c-IVF的技术操作相对简单,应从精子动静态分析、精液的优化处理、捡卵、颗粒细胞去除以及早期受精的判断（短时受精）等方面进行重点培训。并且培训完成后需通过相应的考核方能上岗，当考核指标和同期同条件下的质控指标与带教老师偏差较大时，应积极帮助新员工寻找原因并及时给予纠正。推荐意见9:（1）辅助生殖实验室新员工在进行岗前培训期间，要求充分掌握世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册（第六版）2中ART相关理论及操作技能，充分了解精子动静态分析技术及相关指标临床意义，并能够熟练掌握精子浓度、形态及活动率计数。（2）对不同质量精液进行优化处理时，当处理后TPMC和前向运动精子百分率与带教老师差异小于10%后（n=10）,方可开始尝试进行临床操作。（3）新员工须在经验丰富的带教老师指导下完成至少50例捡卵操作并有能力对COCs进行初步评价。（4）卵母细胞脱颗粒的前期培训包括巴氏吸管或剥卵针口径的选择、剥卵时吹吸力度、幅度、频率及体外操作时间的控制等。操作熟练后，可在带教老师指导下对12枚卵母细胞（应选择获卵数15枚的病例）进行脱颗粒操作，建议累计操作至少100枚卵母细胞,且后续胚胎发育指标达到中心同期质控要求。（5）当对早期受精进行判断时，在严格控制体外观察时限的情况下判断结果与带教老师差异小于10%后（n=100）,方可开始尝试进行临床操作。十.相关操作参考方法1 .精液优化处理参考方法（1）DGC法：在15mL离心管中制备非连续密度梯度离心液，分别取40%45%上层梯度液和等体积的80%90%下层梯度液1.0-2.0mL;将液化后的精液样本（2mL）缓慢沿管壁注入低浓度的梯度离心液上方，（300500）×g离心1520min;弃去上清液或直接吸取精子沉淀，将精子沉淀重悬于152mL培养液中，（200300）×g离心510min,此步骤可进行12次。最后弃去上清液,依据沉淀量将精子重悬于051.0mL培养基（受精液）中备用，以上方法仅作为参考。（2）SU法：首先将精液（2mL）置于圆底试管中（建议使用容量较大的试管）,随后将152.0mL培养基轻轻铺在精液上方，或者将精液（2mL）缓慢加入1.52.0mL培养基底部。注意保持精液与培养基界面分明。将试管倾斜45。置于通气培养箱内上游3060mino将孵育后的上清液（中上层呈云雾状液体部分）转移至新的无菌离心管，（200300）×g离心5-10min弃去上清液，将精子沉淀重悬于152.0mL培养基中（200300）×g离心5-10mino最后弃去上清液，依据沉淀量将精子重悬于0.51.0mL培养基（受精液）中备用。（3）DGC联合SU法：首先进行DGC法（同上），最终保留0.51.0mL的精子沉淀悬液；将精子悬液移入新的离心管底部，再将11.5mL培养基轻轻置于精子沉淀悬液上层,或将精子沉淀悬液轻轻加入含115mL新培养基的试管底部；将试管倾斜45。置于培养箱中上游530min,随后吸取上清液备用。（4）其他新方法：除了上述经典方法外，胚胎实验室宜结合自身条件与特点进行具体方法改良，也可以参照其他相关新方法进行尝试（如微流控技术），经过实验室质控稳定后形成标准操作程序。（5）特殊情况处理：精液不液化或液化不良的样本，建议在离心前用巴氏吸管反复吹打混匀，或加等体积的培养液反复吹打（尽量避免产生大量气泡），促其液化后再离心处理；精液黏稠度较大的样本，可以添加适当培养液进行稀释，再行优化处理；精液里有团块或者胶冻样物，可将精液转移到15mL尖底离心管内，待团块或者胶冻样物自然沉淀后弃去，再对样本进行密度梯度离心；若精液存在絮状漂浮物，待液化后可采用瞬时离心方法去除，如将液化后的精液利用Eppendorf的ShortSpin功能瞬时离心35so.前向运动精子浓度的调节方法：吸取制备后的精子混悬液101.,滴入Makler计数板，双人分别计数横竖各10个小方格后取平均值，计数所得前向运动精子个数X106/mL即为前向运动精子浓度。例如：计数结果为20条精子/10个小方格，则前向运动精子浓度为20×10mL（2OOO万mL）。加精体积计算参考公式如下：加精体积ML） =预期受精体系前向运动精子总数（万条）前向运动精子计数浓度（万条mL）举例1:预期受精体系前向运动精子总数为15万条（例中央井皿法），计数浓度为2000万条mL,加精体积（L）计算如下：15(万条)2 000(>mL)× IOOO = 7.5 (L)举例2:预期受精体系前向运动精子总数为1万条（例100L微滴法），计数浓度为3500万条mL,加精体积（L）计算如下：1(万条)3 500(万条/11±)× 1 OOO 0.3(L)提示：制备后的精子浓度越高，加精体积则越小，移液枪的定量偏差则越大，因此建议依据最后一次离心沉淀量进行0.1.0mL的稀释;或者先将制备后的精子混悬液调整至合适浓度，便可以按固定的体积进行加精。另外使用移液枪加精时，建议选用长枪头，避免移液枪杆接触到精子样本导致交叉污染。2 .短时受精观察的辅助判断方法（1）常规辅助判断方法：短时受精的判断除观察第二极体外，还可结合COCs形态（图1）、卵周间隙变化（部分受精卵卵周间隙会有所增加）、卵母细胞形态规则性（部分受精卵胞质轮廓可能呈现不规则形态）综合判断。对于较难判断受精情况的卵母细胞，也可适当延时观察时间，通过前后时间点极体形态和数量变化鉴别。注:CoCS示卵冠丘复合物;CoCS松散程度与精子浓度及共孵育时间相关,因此其仅作为辅助早期受精判断的参考指标之一图1短时受精5h后受精与未受精卵母细胞COCs的形态（40X）A示受精卵母细胞,COCs表现为卵丘细胞松散、脱落；B示未受精卵母细胞,COCs表现为卵丘细胞致密、黏稠,不易将卵/：上细胞与卵丘细胞剥离（2）纺锤体观测仪辅助判断方法：通过极体结合纺锤体观察（授精后56h）,可以进一步提高卵母细胞受精情况判断的准确度62,84o具体判定方法：出现双极体或碎裂极体，未见纺锤体（图2A）或纺锤体位于胞膜并与极体形成交联（图2B）,则为完成受精的卵母细胞，无需早补救；出现单极体或碎裂极体，纺锤体位于胞质内（图2C）,则为未完成受精的卵母细胞，可行早补救；出现单极体却未见纺锤体（图2D）或纺锤体位于胞膜并与极体交联（图2E）,为刚排出第一极体或质量较差的卵母细胞，可根据具体情况考虑延迟行补救ICSI或不进行补救。图2纺律体成像系统辅助判断Y期受精情况（2（X）x.授精行Sh.箭头示纺体体）东双极体.胞质内未奶访漳体（未行ERICSI.第1天为2I>N）:B小碎裂板体,纺环体仅于胞牒并与极体交联（未行EHKK.第1人为2PN）：C示碎裂裂体.纺律体口的质内（"E-RICSI.第I人为2PN）：D示加S体.胞质内卡处纺It体（未行E-RlCSI.第I人为IPN）；E示单极体.幼棒体位胞服Jl。第极体交联（授精后6h行K-RICSI,第1天为2%）十一、小结目前我国已普遍开展短时受精结合早期补救技术，有效限制了ICSI的过度应用。本共识通过对C-IVF相关操作细节的归纳总结及相应推荐意见的阐述，以期为ART从业者提供实用性的参考，进而选择更合适的授精方式，最大限度地避免LFR或TFF的发生,在获得稳定且满意的临床治疗结局的同时，亦可节约医疗支出、减轻患者经济负担。