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人类生殖细胞低温冷冻保存现状与研究进展2024摘要人类生殖细胞低温冷冻作为生育力保存的一种方式，在辅助生殖技术(assistedreproductivetechnologyzART)发展中起着重要作用,目前该技术已成为生殖医学领域的研究热点之一，并在辅助生殖实践中得到越来越广泛的应用。为提高ART的成功率，冷冻保存技术在发展中不断改进，尤其是冷冻策略的选择和冷冻保护剂的改良与优化。冷冻保存技术适用于行ART治疗或是因疾病导致的生育力下降而进行的卵母细胞、精子、胚胎冷冻保存的群体，也适用于癌症患者为保存生育力而进行的卵巢及睾丸组织冷冻保存。然而，不同的冷冻方法对于不同生殖细胞类型的冷冻效果并不一致，且目前不同生殖细胞冷冻效果的评价尚缺乏合理有效的标准。本文综述了人类生殖细胞低温冷冻保存技术的发展现状及应用，并探讨了低温保存未来的发展方向。【关键词】卵母细胞；精子；睾丸组织；胚胎；卵巢组织；低温冷冻保存近年来，生存环境的改变和社会压力的增大所造成的生育力下降，引发人们对生育力保护的需求急剧增加。如今，低温保存已广泛应用于保存动物生物多样性和保存人体组织等多个领域。人类辅助生殖技术(assistedreproductivetechnologyzART)已使大约1OoO万儿童出生，通过低温保存配子或胚胎减少了卵巢过度刺激综合征(ovarianhyperstimulationsyndrome,OHSS)造成的损害，逐步改善了妊娠和活产率等临床结局1o然而，对生殖细胞的多次获取可能会导致睾丸、卵巢的损伤和纤维化，因此对活检或体外培养获得的微量生殖细胞进行冷冻保存尤为必要。细胞低温冻存是指将细胞置于-196OC的液氮中，使其进入休眠状态，大幅度降低细胞的新陈代谢速率，可以使细胞或组织能够安全地长久保存。然而在冷冻过程中，冷冻保护剂毒性引起的冷冻损伤以及锋利的冰晶和渗透失衡所造成的机械损伤的直接结果是细胞死亡，表现为细胞的破裂、凋亡和坏死。尽管如此，生殖细胞的冷冻保存技术已经在冷冻策略、冷冻保护剂改良以及临床应用中取得了一系列的进步。本综述针对目前为止人类生殖细胞冷冻保存技术的研究进展作一简要概述。一.低温冷冻保存的历史与发展冷冻保存对活组织影响的研究起源于19世纪晚期，当时科学家们使用这种技术保存精子和红细胞。在此期间，研究者意识到这一过程存在缺陷，导致冻存效果不一致以及胚胎出现早期死亡。直至20世纪50年代，Lovelock2观察到，低温保存过程通过瞬间冷冻液体，直接促成红细胞中冰晶的形成，从而引起细胞内的渗透压改变，这一报道在当时引起了学者的极大关注。而后Mazur3对这一过程进行了描述，证明了细胞内介质温度变化的速率控制着水在细胞膜上的运动，从而控制着细胞内的冰冻程度。1953年，爱荷华州立大学的2名研究人员首次报道了使用玻璃化精子进行活产的尝试，在干冰上进行精子冷冻，文献发表后不久，就宣布了正常的活产4o大约10年后，同一组研究人员尝试使用液氮进行玻璃化冷冻，并取得了成功5L玻璃化冷冻技术在保存人类精子方面已变得更加有效。这种快速冷冻的方法不会在冷却过程中造成冰晶形成对细胞的损害。此外,通过卵胞质内单精子注射(intracytoplasmicsperminjection,ICSl)和宫腔内人工授精已经实现了玻璃化冷冻精子的解冻后活产6-7O在20世纪80年代,自第一次用冷冻胚胎移植获得成功妊娠和分娩以来，就出现了关于冷冻保护剂的类型和浓度、平衡时间、冷却速率等不同方案的讨论8-9L卵母细胞冷冻保存在1986年通过缓慢冷冻法获得了首次成功10,但在随后的几年中几乎没有成功案例的报道。1999年首例使用玻璃化冷冻技术的婴儿诞生11o超低温保存研究表明,冷冻和解冻的速率是决定细胞存活率的最重要因素12o研究证实，缓慢冷冻和解冻过程阻止了冰晶的快速形成和细胞早期死亡相关的膜结合溶质的增加13低温保存的另一个初步进展是在20世纪40年代末,当时研究人员发现使用甘油作为保护剂可以提高精子在-70。(:下的存活率140该研究显示使用甘油作为冷冻保护剂可以有效减少冷冻过程中冰晶的形成，从而对细胞起到保护作用。1983年，二甲基亚飒(dimethylsulfoxide,DMSO)作为冷冻保护剂获得了人卵裂期胚胎的首次妊娠15o目前常用的冷冻保护剂是DMSo,它是在冷冻过程之前被加入到细胞培养基中。像甘油一样，DMSO被认为可通过增加细胞内溶质浓度来防止冰晶的形成，从而有助于在低温下水的玻璃化160二.低温冷冻保存原理和冷冻保护剂的改良1.低温冷冻保存原理：冷冻保存技术是人为地制造低温环境,使活性生物暂时进入低代谢状态，从而较长时间延长细胞或组织的保存时间。而冷冻过程可导致水结冰，从而破坏细胞内的微观结构。细胞内冰晶的形成和高浓度的溶剂是造成人类生殖细胞低温冷冻死亡的主要因素。人类生殖细胞的冷冻技术可分为慢速冷冻/快速解冻（冷冻速率为0.32°Cmin）和快速冷冻/快速解冻（冷冻速率为20OOOoCmin慢速冷冻的目的是细胞面临胞内冰晶形成和渗透脱水的情况下仍能维持复杂的细胞微观结构17O快速冷冻又称玻璃化冷冻，其原理是将样本放在高渗的冷冻保护剂中，使高浓度的冷冻保护剂进入细胞，并清除细胞内部的水，经急速降温，把细胞内部变成非晶体的玻璃化固态170这一过程可以有效阻止冰晶的形成，保护了细胞和组织。2.低温冷冻保护剂的改良:使用冷冻保护剂的目的是一种减少或抵消低温冷冻造成的损伤。冷冻保护剂主要分为两种，即渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。渗透性保护剂主要是甘油（发现的第一种渗透剂）、DMS0、乙二醇和丙二醇，其特性主要是具有较高的水溶性、能轻易地穿过细胞膜，以及细胞毒性小。结冰时，冷冻保护剂通常能通过与水分子形成氢键，从而对水形成一种束缚力，降低了水的冰点，抑制冰晶的形成。且随着冷冻保护剂浓度的增加，结合未冻结水的能力越强，从而抑制了水分子的运动。非渗透性冷冻保护剂的体积通常更大，以聚合物、二聚体或三聚体的共价键连接。非渗透性冷冻保护剂主要有聚乙二醇、聚乙烯口比咯烷酮、棉子糖、蔗糖、海藻糖等。非渗透剂诱发玻璃化的机理与渗透剂相同，但发生在细胞外,程度较小。近年来，超低温保存技术也在应用中不断革新，包括冷冻保护剂组合和新冷冻保护剂的应用技术。有研究证实，海藻糖可作为一种无毒的低温保护剂，使用低温敏感的纳米颗粒包装的海藻糖可以在不显著改变细胞结构的情况下提高细胞内海藻糖的均匀性，此方法不会对细胞造成毒性和显著的损伤口8o此外，在磷脂酰胆碱脂质体中添加胆固醇可增加膜抗渗漏的稳定性19o此外，褪黑素是一种具有抗氧化特性的物质，它在体细胞和配子（包括卵巢组织、精子和精原干细胞）的低温冷冻保护效果方面的积极作用正在显现20o同样地，在基础培养基中加入强水化能力的黄腐酸小分子，可减少冻结过程中冰的生长和融化过程中冰的重结晶来实现非玻璃化细胞的低温保存，并且黄腐酸主要位于细胞膜上，这表明黄腐酸可能通过稳定膜而发挥其保护细胞的作用21L三.低温冷冻保存的临床应用1 .精子低温冷冻保存：精子在冷冻保存过程中，由于温度和渗透压的剧烈变化，可能会导致精子的活力、呼吸活动、细胞膜状态以及DNA完整性发生不可逆的改变。通过透射电子显微镜观察，经玻璃化冻存的精子头部体积变大，这主要与头部区域的染色质解聚和质膜出泡有关221精子冷冻保存过程的另一个关键点是活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)产生的增加，这将导致精子质膜的氧化应激230而这与大量精浆清除所造成的抗氧化自卫系统活性降低有关。由于精子细胞膜富含多聚不饱和脂肪酸,氧化连锁反应主要参与精子质膜过氧化、蛋白质降解、DNA损伤、精子过早获能、细胞内信号通路改变以及细胞凋亡等240谷胱甘肽作为已知的动物体内的一种内源性抗氧化剂在提高精子质量上起到了重要作用。实验研究表明，山羊精子冷冻保护剂中添加2mmolL谷胱甘肽时，解冻后精子活力、质膜完整率和顶体完整率最高，分别可达62.14%、37.62%和70.87%,显著提高了精子的受精能力250此夕卜,褪黑素是一种内源性神经激素，由松果体的色氨酸合成。褪黑素不仅能够直接清除自由基，还可通过刺激抗氧化酶的活性发挥作用。动物实验研究表明，在狗精子冷冻介质中添加12mmol/L褪黑素可以明显提高精子活力、顶体和DNA完整性260不同的冷冻策略同样影响冷冻后的精子质量。与传统慢速冷冻相比，玻璃化冻融后的精子特征得到了明显的改善,活精子比率显著提高,顶体完整性较好,DNA碎片化大约减少了30%,玻璃化冷冻组的精子特征更接近新鲜样本组27o2 .睾丸组织低温保存:睾丸组织低温损伤的直接结果是细胞死亡，可能表现为细胞破裂、凋亡和坏死。低温保存还可诱导细胞和组织中的转录应激基因Bax、Cirbp、HSP90ab1和Sodl的表达增加表观遗传因子Dnmt1、Dnmt3a、JaridIb、SrdsSirtI和HdaCI的DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰(H3K4me3xH3K9ac和H4K8ac)的表达也存在差异28-290此外，由于睾丸组织不同腔室之间的冷却速率不同和不均的结晶倾向，增加了冷冻对管状结构和血睾屏障机械损伤的机会，导致解冻后精子活力的降低。将冷冻保存的睾丸组织自体或异体移植，可以用来评估睾丸冷冻保存的成功与否。研究人员将小鼠的睾丸组织碎片包裹在海藻酸钙水凝胶中，并补充载有血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGFX血小板衍生生长因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)的纳米颗粒。结果表明，VEGF和PDGF纳米颗粒的组合增加了血管成熟度并诱导移植物中更快地生成血管结构300此外，在含有DMSO的冷冻保护剂中加入100molL褪黑素可通过抑制细胞内ROS的产生和细胞凋亡来保护精原干细胞提高干细胞解冻后的存活率和恢复率31o除了改进培养基成分外，还需要考虑优化物理培养条件。通过使用静态带有聚二甲基硅氧烷室的琼脂糖凝胶的杂交培养系统，猪离体生殖细胞存活率和分化效率得到明显改善32o另外,睾丸细胞体外生成3D睾丸类器官，已被建议作为一种新的评估生育能力的策略。Portela等33将青春期前男性新鲜和冷冻保存的睾丸组织碎片进行器官培养，培养液添加10-7mol/L褪黑素和10-6mol/L维甲酸，补充或不补充3U/L卵泡刺激素/黄体生成素(follicle-stimulatinghormone/luteinizinghormonefFSH/LH),结果表明尽管在体外没有诱导精子发生，但睾丸结构、Leydig细胞的内分泌功能和精原细胞增殖在新鲜和冷冻保存的睾丸组织中都得到了较好的维持。3 .卵母细胞冷冻保存：卵母细胞由于自身体积大，胞内水分多，表面积/体积小，膜的渗透性低，水分子不能快速有效地通过细胞等特点，以及存在复杂的亚显微结构，如裸露的染色质存在于胞质中而无核膜的包裹和减数分裂时期具有纺锤体结构，使得卵母细胞的低温冷冻保存相对困难。卵母细胞冷冻保存会导致细胞内氧化应激增加、线粒体的清除和结构受损,包括线粒体噎模糊、线粒体膜电位下降、线粒体DNA拷贝数减少和RoS生成增加等，都会对卵母细胞的发育潜能产生不利影响。抗氧化治疗已成为克服低温保存引起细胞损伤的一种较有前途的策略。经白藜芦醇处理的玻璃化冻融卵母细胞可通过激活SIRT1通路促进线粒体合成，使得其卵母细胞活性得以恢复34o此外，玻璃化冻融后卵母细胞在行ICSI的同时补充自体脂肪干细胞线粒体，也可恢复卵母细胞质量并提高胚胎发育能力35o近年来，有报道在体外成熟方案中加入褪黑素不仅可以通过清除ROS来提高卵母细胞的发育能力，而且在卵丘-卵母细胞复合体的脂质代谢调节中发现褪黑素介导的Gs-cAMP/PKA信号主要通过MT2受体促进脂肪分解，随后通过水解卵丘细胞内甘油三酯增加脂肪酸释放，并通过CD36蛋白将脂肪酸转运至卵母细胞,维持脂质稳态并限制ROS产生，从而支持卵母细胞胞质成熟和随后的胚胎发育360此外，一项针对1085枚人类生发泡卵母细胞进行玻璃化冷冻的研究表明，体外成熟前进行玻璃化冻存的卵母细胞进入Mll期的比例高于体外成熟后进行玻璃化冷冻的卵母细胞37o为提高生发泡期羊卵母细胞玻璃化冷冻的效率，Davoodian等38向玻璃化冷冻液和复温溶液中加入5mmol/L棚皮素，结果表明榔皮素可提高绵羊卵母细胞的存活率、成熟率和生发泡期发育能力，对绵羊卵母细胞早期凋亡具有保护作用。另外，细胞的水凝胶微囊化策略为细胞提供了保护屏障，减少了细胞外冰损伤并防止了冰核在细胞中生长390Tian等40通过将小鼠腔前卵泡包裹在水凝胶纳米臂上,完成了低浓度渗透冷冻保护剂(15mol/L)玻璃化冷冻,结果表明与传统水浴法相比，腔前卵泡的存活率提高了33%o此外，玻璃化冷冻卵泡发育成Mll期卵母细胞的百分率以及体外受精和胚胎移植后子代的出生率也与对照组相似。卵母细胞冷冻保存可以用来规避与年龄相关的不孕症和卵巢储备功能早期丧失的生育力保存。有研究认为，在年轻时寻求卵母细胞冷冻保存的患者中可以看到更高的卵母细胞产量、更少的卵巢刺激周期和更高的活产率41L这更说明了年龄对生育能力的重要影响。4.卵裂期和囊胚期胚胎低温冻存:低温冷冻保存导致的渗透损伤和氧化应激、冷冻保护剂本身的潜在毒性，以及胚胎细胞在冷冻过程中的大小和形态变化，都可能干扰胚胎基因组的完整性和功能，并传递表观遗传印记。氧化损伤在配子中触发了广泛的修复，但当它影响到配子染色质的成熟时就会影响到患者的临床结局。这可能与CPG位点和转录因子的干扰有关，也与异常启动子高甲基化有关420另一方面，在胚胎培养过程中，ROS的增加也可能对胚胎培养产生有害影响。Bao等43研究显示，在培养基中添加褪黑素可以提高反复不良胚胎患者的优质胚胎率，并提高玻璃化冻融后卵裂期胚胎的囊胚形成率。冻融胚胎移植（frozen-thawedembryotransfer,FET）周期中,子宫内膜厚度endometrialthickness,EMT）常被作为主要的临床监测指标,一项研究FET周期中母亲年龄对EMT与正常妊娠率关系的回顾性分析表明，对于EMT8mm的35岁女性，EMT每增加1mm,卵裂期胚胎移植的持续妊娠率增加150%,囊胚期FET的持续妊娠率增加97%;在年龄235岁的女性中，当囊胚期胚胎移植时，EMT每增加1mm,持续妊娠率显著增加12%44o此外,卵裂球丢失是冷冻保存后发生的常见现象。迄今为止，关于卵裂球丢失对妊娠结局的文献报道有限。Jiang等45研究认为，相较于具有完整卵裂球的冻融后卵裂期胚胎，卵裂球缺失的胚胎发育潜能和妊娠率均下降。即使卵裂球缺失的胚胎已植入并达到临床妊娠，但由于早期流产率较高，最终活产率仍然较低。然而，一旦卵裂球丢失的胚胎发育至活产，则并没有观察到不良的新生儿结局。近年来，新冷冻技术的引入提高了体外受精-胚胎移植治疗的成功率。与卵裂期胚胎移植相结合的慢速冷冻技术已被囊胚玻璃化冻融后移植所逐步取代，因为后者更能改善子宫内膜和胚胎发育的同步性。对玻璃化冷冻优质胚胎移植周期的研究表明，第5天单囊胚移植后活产率（48.65%）、第6天单囊胚移植后活产率（36.93%）均显著高于第3天单胚胎移植后活产率（24.80%）,且第5天/第6天单囊胚移植后的新生儿出生体质量（3395.53g)显著高于第3天单胚胎组(3286.99g)46o此外,为了评估冷冻保存时间对胚胎活力、植入能力、妊娠结局和新生儿结局的影响，Mao等47研究认为，随着玻璃化胚胎冷冻储存时长的增加，胚胎存活率和临床妊娠率呈下降趋势，但对新生儿结局没有显著的影响。进一步研究显示，玻璃化后的长期储存不会影响人类胚胎中mRNA和InCRNA的表达谱；然而，解冻过程会导致转录过程的微小改变，主要与转化生长因子-轿口Hippo通路相关的代谢、应激反应、凋亡、细胞周期和细胞黏附有关4815.卵巢组织冷冻保存：卵巢组织冷冻保存包括将手术取出的卵巢组织冷冻和储存在液氮或蒸汽氮中，而后将组织解冻并移植回去，以恢复生育能力或卵巢内分泌功能。目前为止，绝大多数中心仍然青睐慢速冷冻技术,因为95%以上的活产是在卵巢组织慢速冷冻复苏再移植后实现的。一项关于冻融卵巢皮质组织代谢活性和VEGF-A分泌随时间的变化研究表明，与新鲜卵巢皮质组织相比解冻卵巢皮质组织在培养48h内分泌的VEGF-A显著较少，代谢活性显著降低，且卵巢皮质组织解冻后至少需要48h之后才能恢复代谢，包括VEGF-A的分泌490动物模型研究数据显示，玻璃化冷冻的狒狒卵巢组织碎片在自体移植后至少会存活18个月，但由于未能成功受孕，无法确认生育力是否恢复500尽管如此，卵巢组织玻璃化冷冻保存技术水平也在逐步提高。进一步研究表明，当低浓度DMSO(27%)与乙二醇和其他冷冻保护剂联合使用时，冷冻后形态正常的卵泡率最高,存活率超过90%o当27%的乙二醇和27%的甘油与非渗透性合成聚合物联合使用时，冷冻保存后观察到的正常卵泡的比例甚至更高（可达98%）51o因此，目前的卵巢组织玻璃化冷冻技术可以保存大多数卵泡的完整性。此外，卵巢皮质冷冻已被应用于保护女性的生殖潜能，如接受性腺毒性化疗的青春期前或围青春期女性。然而，卵巢移植后组织的早期缺氧仍然是一个巨大挑战，因为它对卵泡存活有负面影响。在移植后的前几天经常观察到卵泡损失超过50%,导致大量的卵泡激活和耗尽T52o因此在移植后的组织加快血管重建至关重要。一种方法是将缺氧预处理的人脐带间充质干细胞和卵巢组织共异种移植,可改善卵巢移植物的早期血管形成。而这与缺氧预处理的人脐带间充质干细胞显著减少细胞凋亡和增加CD31、CD34和VEGF-A的表达有关53o另一种方法则是通过向异种移植人卵巢的小鼠腹腔注射N-乙酰半胱氨酸增强移植物的抗氧化防御系统并发挥抗炎和抗凋亡作用，减少了人卵巢异种移植物中的缺血再灌注损伤并增加了卵泡存活率54o四.总结与展望近年来，由于肿瘤、非肿瘤和个人原因，患者对保存生育能力的需求急剧增加，满足这一需求是一项重大挑战。为进一步提高冷冻保存效率及其临床应用，需要不断探索和优化：继续深入研究卵母细胞冷冻保存过程中氧化应激的产生以及卵丘-卵母细胞复合体脂质代谢调节机制,优化培养环境和培养液成分，为提高卵母细胞的质量提供更好的保存环境；尝试寻找出更为有效的冷冻保护剂组合和新型抗氧化剂以及移植方案，以提升卵泡存活率及卵巢激素分泌功能；除了改进培养基外，类器官培养法有望成为新鲜和冷冻保存的睾丸组织体外精子发生的一种有效方法；需要进一步的研究来验证长期低温保存是否对其他分子机制产生影响，如表观遗传学的改变；此外，还需要进一步探索新的冷冻保存评价标准、技术和方法，更好地保护患者的生育潜力。总之，ART中的生殖细胞冷冻保存技术已经极大地改变了生育力保存的前景，而且随着我们对冻融程序的优化和对特定患者的应用，必将进一步推动人类ART的发展，以提高生殖细胞复苏率及临床妊娠率，进而改善妊娠结局。参考文献1SteptoePC,EdwardsRG.BirthafterthereimplantationofahumanembryoJ.Lancet,1978,2(8085):366.DOI:10.1016s0140-6736(78)92957-4.2LovelockJE.Thehaemolysisofhumanredblood-cellsbyfreezingandthawingJ.BiochimBiophysActa11953,10(3):414-426.DOI:10.101606-32(53)90273-×.3MazurRKineticsofwaterlossfromcellsatsubzerotemperaturesandthelikelihoodofintracellularfreezingJ.JGenPhysiol,1963,47(2):347-369.DOl:10.1085jgp.47.2.347.4BungeRG,ShermanJK.FertilizingcapacityoffrozenhumanspermatozoaJ.Nature,1953,172(4382):767-768.DOI:10.1038/172767b0.5PerloffWH1SteinbergerE.ShermanJK.Conceptionwithhumanspermatozoafrozenbynitrogenvaportechnic(J.FertilSteril,1964,15:501-504.DOI:10.1016s15-0282(16)35344-4.6IsachenkoV,IsachenkoE,PetrunkinaAM,etal.Humanspermatozoavitrifiedintheabsenceofpermeablecryoprotectants:birthoftwohealthybabiesJ.ReprodFertilDev12012,24(2):323-326.DOt10.1071RD11061.7SanchezR,IsachenkoMPetrunkinaAM,etal.LivebirthafterintrauterineinseminationwithspermatozoafromanOligoasthenozoospermicpatientvitrifiedwithoutpermeablecryoprotectantsJ.JAndrol,2012,33(4):559-562.DOI:10.2164jandrol.111.014274.8TrounsonA,MohrLHumanpregnancyfollowingcryopreservation,thawingandtransferofaneight-cellembryoJ.Nature,1983,305(5936):707-709.DOI:10.1038305707a0.9ZeilmakerGH1AlberdaAT,vanGentI1etal.Twopregnanciesfollowingtransferofintactfrozen-thawedembryosJ.FertilSteril11984,42(2):293-296.DOI:10.1016s0015-0282(16)48029-5.10ChenC.PregnancyafterhumanoocyteCryopreservation(J).Lancet,1986,1(8486):884-886.DOL10.1016s0140-6736(86)90989-x.11KuleshovaL,GianaroliL,MagliC,etal.Birthfollowingvitrifica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