急性缺血性卒中血栓特征的研究进展2024.docx

急性缺血性卒中血栓特征的研究进展2024摘要：血栓栓塞和原位血栓形成是缺血性卒中发生的最主要原因,但由于人体血栓组织获取困难,既往关于卒中血栓特征的研究较少。近年来,血管内介入技术的快速发展为研究血栓构成创造了条件。该文从病理学、免疫组织化学、组学、力学、外源性物质5个方面回顾了急性缺血性卒中血栓的构成特点,分析了这些特征在卒中诊断、分类及治疗方案制定中的价值,并探讨了这些特征对急性缺血性卒中患者行机械取栓术后神经功能预后的影响。卒中具有高发病率、高复发率、高致残率、高致死率等特点,其中缺血性卒中约占所有卒中的70%1。血栓栓塞和原位血栓形成是缺血性卒中发生的最主要原因2,但由于获取人体血栓组织困难,既往关于卒中血栓特征的研究较少。近年来血管内介入技术的快速发展为研究人体血栓构成创造了条件3。相对于尸检,经机械取栓获取的血栓具有更好的时效性,能够发现血管事件发生当时的血栓结构特征。本文从病理学、免疫组织化学、组学、力学、外源性物质5个方面阐述了急性缺血性卒中(acuteischemicstroke,AlS)血栓的构成特点,分析了这些特征在卒中诊断、分类及治疗方案制定中的价值,并探讨了这些特征对AIS患者行机械取栓术后神经功能预后的影响。1血栓病理学血液流动状态下,血管内皮细胞功能失调或血管内膜发生损伤后,血管内皮下的胶原纤维暴露,激活并促使血小板聚集形成血小板团块,纤维蛋白原转变为纤维蛋白,聚集的血小板附着在血管壁上,形成血小板梁结构,纤维蛋白网住白细胞和红细胞,最终凝结成块状物体,该过程即为血栓形成4。血栓形成后,血管内血流动力学发生继发性改变,血液中大量红细胞聚集在血栓起始部位,形成以红细胞为主的血栓。AIS血栓通过苏木素-伊红、马休黄-酸性品红-苯胺蓝染色等病理染色后,经显微镜下观察,可分为两种类型:红细胞富集区和血小板富集区。红细胞富集区的结构特点为稀疏的纤维蛋白网络结构内聚集大量的红细胞,偶见散在分布的白细胞;血小板富集区为可见致密的纤维蛋白结构包裹血小板,并将其分割成岛屿样结构,称之为血小板梁5。大多血栓为二者的混合成分（混合血栓）,少部分血栓为富含血小板而缺乏红细胞的血栓（白色血栓）,或是富含红细胞而缺乏血小板的血栓（红色血栓）5-9。目前较多研究根据血栓整体结构特点将血栓分为富含纤维蛋白及血小板的血栓和富含红细胞的血栓6,10-12oFitzgerald等13纳入441例AIS患者,采集行机械取栓术过程中每次尝试通过血栓后所得的血栓样本（共尝试612次通过取栓）,以术中尝试通过次序为分类变量第1次（352例）,第2次（142例）,第3次（56例）,第4次（29例）,第5次（33例）,计算每次尝试通过后所得血栓的面积及组成成分相对含量,结果显示,早期尝试通过后所得血栓的红细胞相对含量更高第1次:42.78%,第2次:39.06%,第3次:39.64%,第4次:30.86%,第5次:35.20%;H=11.644zP=0.020,血小板相对含量更低（第1次:25.00%,第2次24.77%,第3次:26.30%,第4次:27.73%,第5次:37.43%;H=15.977zP=0.003）,提示与富含红细胞的血栓相比,富含纤维蛋白及血小板的血栓可能导致更多再通尝试次数、更长的手术时间。AIS血栓结构具有高度异质性,但也具有共同结构特征。显微镜观察结果显示AIS患者的血栓边缘通常会形成一层致密的纤维蛋白外壳,血小板、红细胞和纤维蛋白在血栓边缘高度集中，而在中心区域相对稀疏14。位于血栓边缘的红细胞被压缩成多面体形态,并且其排列具有一定的取向性,靠近中心区域的红细胞则倾向于正常的双面凹形态,并且缺乏取向性,这可能是由于血栓边缘分布的活化血小板形成伪足,吸附纤维蛋白,驱动血栓收缩,最终形成外周边缘致密、内部疏松的结构特点15。这种壳-核结构可能是发生溶栓抵抗的重要原因之一12o目前,已有较多研究将血栓中主要成分相对含量的差异与卒中病因关联起来,可能由于样本量的差异及统计学方法不一致,各研究所得结论并不统一16oSporns等17纳入187例行取栓治疗的AIS患者,77例(41.2%)为心源性栓塞型卒中,35例(18.7%)为大动脉粥样硬化型卒中1例(5.9%)为其他明确病因型卒中,64例(34.2%)为隐源性卒中。通过病理组织染色以及免疫荧光法标记出红细胞、白细胞及纤维蛋白,半定量分析各成分相对含量,结果显示,与非心源性栓塞型卒中患者的血栓相比,心源性栓塞型卒中患者的血栓中纤维蛋白(60.0%比51.5%?=0.027)、白细胞(8.0%比5.0%,P=0.026)占比更高,而红细胞占比较低(28.0%比42.0%,P=0.005)。进一步分析显示,隐源性卒中患者的血栓与心源性栓塞型卒中患者的血栓组织学成分比例高度相似(纤维蛋白：63.5%比60.0%,P=0.916;红细胞:26.0%比28.0%zP=0.767)。部分研究者认为膜床上病因不明的卒中有可能为潜在的心源性疾病所致,对于不能明确病因分型的AIS,通过个体化分析血栓结构特点或许可协助明确病因18-19。另一项研究纳入1350例接受取栓治疗的AIS患者,267例(20%)为大动脉粥样硬化型卒中,662例(49%)为心源性栓塞型卒中,301例(22%)为隐源性卒中,其余为高凝状态或夹层。半定量分析血栓中红细胞、纤维蛋白、白细胞、血小板的相对含量,大动脉粥样硬化型卒中患者血栓中的红细胞相对含量高于心源性栓塞型卒中(46±23)%比(42±22)%lP=0.01及隐源性卒中(46±23)%比(41±24)%,P=0.02患者的血栓。在此基础上进行的受试者工作特征曲线分析未能找到可以显著区分心源性栓塞型和大动脉粥样硬化型血栓的阈值点20L该研究结果与Sporns等17的研究结果基本一致。由此可见,AIS患者不同病因分型的血栓组成在客观上具有差异性,但血栓中红细胞、血小板、纤维蛋白的相对含量差异可能更多取决于卒中当时的血管内血流动力学特点,例如大动脉粥样硬化型血栓通常在大血管狭窄的基础上有原位血栓形成,此时血流缓慢,红细胞更容易聚集成块。因此以血栓成分及其含量作为病因分型依据仍有局限性,需要结合免疫组学、蛋白组学等方法。血栓形成后,其组成成分、结构特点会发生动态变化。体积较小的新鲜血栓可能更易被纤溶酶等溶解,体积较大的血栓可仅部分区域发生软化。若血栓未能被溶解持续存在于血管中,则肉芽组织逐渐取代血栓,这一过程被称为血栓机化21基于红细胞、粒细胞含量及结构特点可判断血栓形成时间22oRittersma等23首次对不同血栓形成时间的结构特征作出明确定义新鲜血栓(形成时间1d)通常由血小板、纤维蛋白、红细胞和形态完整的粒细胞组成;溶解性血栓(形成时间15d)可见凝固性坏死和粒细胞核破裂现象;陈旧性血栓(形成时间5d)可见梭形细胞生长,偶见伴有结缔组织沉积和毛细血管生长,经免疫荧光技术可见抗-平滑肌肌动蛋白抗体阳性。后续关于血栓形成时间的研究大多以此作为参考标准。在实际中,一个血栓通常是上述三种的混合体。Kitano等24观察了185例经取栓治疗AIS患者的血栓样本才安照以下标准划分血栓形成时间：(1)显微镜下见完整的粒细胞占80%以上,考虑为新鲜血栓;(2)凝固性坏死或核破裂的粒细胞占20%以上时考虑为溶解性血栓;(3)可见抗-平滑肌肌动蛋白抗体阳性时,考虑为机化血栓。结果显示,经取栓治疗AIS患者的血栓以溶解性血栓71%(131185)和新鲜血栓23%(43/185)为主,机化血栓少见6%(11185)。将溶解性血栓与机化血栓归类为陈旧性血栓,与新鲜血栓比较,在病理组织学上陈旧性血栓的红细胞所占比例更小(35%比53%zP0.01)。通过限制平均生存时间分析新鲜血栓组与陈旧性血栓组患者在规定截断时间(120min)内动脉穿刺至再灌注的平均时间,结果显示,新鲜血栓组平均穿刺至再灌注时间较陈旧性血栓组短(55.9min比71.5min,P=0.002),发病后90d预后不良改良Rankin量表(mRS)评分56分的患者比例较陈旧性血栓组降低了51%(调整后cOR=0.49,95%CI:0.240.99;P=0.047)o2血栓免疫组织化学免疫组织化学分析发现,AIS血栓中几乎都存在血管性血友病因子(VOnWillebrandfactor,vWF)及中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophilextracellulartrapszNETS),因此目前一般认为VWF及NETs是血栓构成的基本成分25-27。2.1vWFVWF可黏附和募集血小板,稳定凝血因子vm,从而对止血、血栓形成发挥重要作用。vWF正常分布于血浆、内皮下基质、内皮细胞和血小板内的储存颗粒中,当血管内皮损伤时NWF因子从储存颗粒中释放至血液中,受到血流剪应力的作用后,vWF因子发生活化并锚定于内皮下胶原,与胶原纤维共同活化并聚集血小板28。通过免疫组织化学技术分别标记血栓中vWF、纤维蛋白、血小板,可以观察到在富含纤维蛋白的白色血栓中,vWF富集区与纤维蛋白及血小板富集区高度重合27,29。VWF因子在血栓形成过程中可能充当着激活及黏附剂的角色,可促进血小板、纤维蛋白、胞外DNA物质聚集并黏合成稳定的团块黏附在血管壁上。VWF裂解酶(adisintegrinandmetalloproteinasewithathrombospondintype1motifmember13zADAMTS13)是一种特异性解聚vWF多聚体的蛋白酶30。越来越多证据表明，重组人源ADAMTS13(recombinanthumanADAMTSl3,rhADAMTS13)可能成为AIS溶栓治疗新药30-31。Denorme等32通过构建富含vWF血栓的小鼠AIS模型发现,阿替普酶对富含vWF成分的血栓疗效较差,对该类阿替普酶抵抗血栓在5min内使用rhADAMTS13治疗后可恢复血管再通,并且血流改善程度呈现出剂量依赖性。该实验在血管闭塞5min后给予rhADAMTS13(3500U/kg)并监测闭塞血管血流量,结果显示,闭塞血管在25min内逐渐恢复血流量并维持在发病前基线血流量的75%以上,血管闭塞60min后血流量可恢复至发病前基线血流量的(76.6±15.9)%。由于ADAMTS13仅针对性解聚VWF多聚体,不能降解纤维蛋白,因而限制了其在其他类型血栓中的应用。vanMoorsel等33研发了一种新型靶向溶栓剂微溶酶由靶向VWF的纳米颗粒和尿激酶纤溶酶原激活剂的催化结构域组合而成;微溶酶靶向结合VWF后激活尿激酶纤溶酶原激活剂,进而活化纤溶酶原,发挥溶栓作用。该实验利用激光散斑技术测量血栓形成Wmin后小鼠脑灌注水平,该值定义为AIS小鼠模型大脑灌注基线水平。分别测量血栓形成70min后阿替普酶治疗组和微溶酶治疗组小鼠脑灌注水平,评估灌注改善率(治疗前后脑灌注差值与基线水平的比值)。结果显示与安慰剂组相比,阿替普酶组(35.8±17.1)%比(15.6±7.5)%zP=0.O01及微溶酶组(39.3±13.1)%比(15.6±7.5)%,P<0.01小鼠脑灌注改善率均提高提示微溶酶在AIS发病早期能够改善脑皮质灌注。该实验对推进AIS溶栓药物研发具有一定的意义,但限于目前实验样本量较少,未来还需要更多动物实验或临床研究来证实新药的有效性及安全性。2.2NETsAIS血栓中含量最丰富的白细胞亚型为中性粒细胞26。在血栓形成过程中,应激状态促使中性粒细胞活化,细胞内的核物质解聚后释放至细胞外,形成表面装饰有瓜氨酸修饰组蛋白H3和颗粒蛋白的细胞外DNA纤维网状结构,称为NETs34-35oPir等5通过免疫荧光技术详细地描述了血栓中NETS结构,利用瓜氨酸修饰组蛋白H3特异性抗体标记胞外DNA结构,并用中性粒弹性蛋白酶和髓过氧化物酶共同染色标记出中性粒细胞,结果显示,胞外DNA结构与中性粒细胞分布高度重合,从而证实血栓中所观察到的胞外DNA为NETS。该实验在所有AIS血栓中均观察到NETs结构,主要分布于血栓中富含血小板的区域或富含血小板与富含红细胞区域的交界处。越来越多研究尝试探索NETs在AIS血栓中的作用机制及其与临床预后的关联。Novotny等36研究表明,血栓横断面切片NETs阳性面积与机械取栓患者(70例)的血管再通时间(r=0.3823,P=0.0011)及AlS患者(38例)术后90dmRS评分(r=0.440,P=0.006)均呈正相关。这可能是因为NETs的纤维网状样结构特征为红细胞、血小板、纤维蛋白和凝血因子等提供了附着的支架37,使血栓结构趋于稳定,增加了溶栓治疗及取栓治疗难度。AbbaSi等38分析对比了不同血管再通时间患者的血栓组成差异。该研究纳入了137例症状出现至动脉穿刺时间小于8h的AIS患者,所有患者取栓治疗后获得血栓标本,结果显示,血管再通时间较短(症状出现至动脉穿刺时间4h)组(88例)与血管再通时间较长(症状出现至动脉穿刺时间4h)组(49例)血栓中的白细胞(3.21±2.02)%比(4.25±2.50)%,P=0.02、纤维蛋白(25.62±13.90)%比(33.03±18.09)%,P=0.02xNETs(16.31±19.88)%比(26.57±25.90)%fP=0.03、VWF(13.94±13.48)%比(20.36±20.61)%zP=0.04含量差异均有统计学意义才是示血栓在造成急性脑血管事件时,原位血栓趋向于成熟和机化34。因此研发NETs靶向药,早期干预血栓中白细胞或NETs的聚集或许能够成为提高AlS溶栓疗效的突破点。NETs本质上为分布于细胞外解聚状态的DNA,容易受到核酸酶活性的影响,理论上能够通过重组脱氧核糖核酸1(recombinantdeoxyribonuclease1zDNaSel)破坏NETS聚集状态以促进整体血栓溶解。DUCroUX等39对经取栓获得的11例AIS患者的血栓进行体外研究,分析单独使用DNaseI或联合使用阿替普酶对血栓的影响,该实验采用自身对照法,以溶栓前后血栓重量变化百分比作为评估指标,结果表明,单独使用DNaseI与DNaseI联合阿替普酶分别处理血栓60min后血栓重量变化百分比平均值差异具有统计学意义(83.36±33.89)%tt(37.83±17.65)%,P=0.Oo1。因此认为虽单独使用DNaseI并不能显著提高血栓的溶解成功率,但与阿替普酶联合治疗具有协同效果。虽然目前该药的研究成果仅限于临床前实验,并且缺乏大样本实验证据,但笔者认为,评估新药物治疗后出血转化风险是溶栓药物研发的重要衡量指标QNaSel药物作用靶点为NETs,理论上其出血风险可能低于阿替普酶、替罗非班等直接拮抗凝血过程的药物,因此认为DNaseI很可能成为一种有潜力的新型缺血性卒中溶栓治疗药物。3组学分析组学分析是近年来新兴的一门学科,有研究尝试通过组学分析来探索血栓中基因、RNA,蛋白质和代谢产物的状态以找到新的分子靶点,进一步探究血栓形成机制。多数研究分析后显示,AIS血栓中的差异性表达蛋白大多与心血管、血小板功能、免疫细胞活化聚集相关40。血小板糖蛋白Vl(PIateIetglycoproteinVLGPVl)作为血小板特有的膜糖蛋白,是血管内皮下胶原蛋白的主要信号受体。在血管壁发生损伤时,血管内皮下成分胶原暴露于血流中,血小板通过GPVl受体与胶原蛋白的相互作用使血小板活化和黏附,进而血栓形成。为验证GPVl的数量与取栓手术过程的难度是否具有相关性Qekoye等41纳入250例经取栓治疗的AIS患者,根据患者接受血管内治疗过程中尝试的取栓次数,分为首过效应组(91例)及非首过效应组(159例),结果显示,首过效应组的血栓GPVl平均含量低于非首过效应组098±0.023)ng/mg½(0.111±0.024)ng/mg,P<0.01。作为血小板的特异性受体,GPVI含量在一定程度上能够间接反映血小板含量,因此该研究提示血栓中血小板含量增加可能增加取栓的难度。目前GPVI作为具有低出血风险的新型抗血小板聚集分子的潜在靶点而备受关注42。格伦佐西单抗Glenzocimab(ACT017)是一种新开发的人源抗GPVl单克隆抗体Fab片段。格伦佐西单抗治疗急性缺血性卒中临床研究(clinicalstudyofGlenzocimabinpatientswithacuteischemicstroke,ACTIMIS)为一项随机、双盲、安慰剂对照研究,纳入了美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分6分并接受阿替普酶溶栓治疗的AIS患者,该临床试验目前已完成Ib期及2a期试验。1b期临床研究经安全性分析及药代动力学分析后确认格伦佐西单抗推荐总治疗剂量为1000mgo2a期试验纳入106例AlS患者并随机分组至安慰剂组(阿替普酶联合安慰剂)和试验组(阿替普酶联合格伦左西单抗1OoOmg),结果显示,试验组(54例)中18例(33%)发生脑出血转化(均为无症状性脑出血),17例(32%)发生严重不良事件(包括房室传导阻滞、心室功能不全、心肌缺血、梗阻性胰腺炎、多器官功能障碍综合征、急性胆囊炎、肺炎、肺栓塞、脓毒血症、进展型卒中、休克等),4例(7%)发生死亡(其中2例死因与卒中直接相关)；安慰剂组(52例)中31例(60%)发生脑出血转化(症状性脑出血5例,无症状性脑出血26例),19例(37%)发生严重不良事件(包括急性心肌梗死、肺炎、脓毒血症、脑疝、颅内出血、卒中、癫痫持续状态、短暂性脑缺血发作、肺水肿、肺栓塞等)/1例(21%)死亡(其中7例死因与卒中直接相关),两组发病后90d生存率差异具有统计学意义(风险比:0.29z95%CLO.090.90,P=0.035),发病后90d良好预后(mRS评分02分)率差异无统计学意义试验组：42%(22/52),安慰剂组:49%(26/53);优势比:0.77z95%CI:0.351.66,P=0.51。虽然该研究目前尚未找到阿替普酶联合格伦佐西单抗治疗更具有疗效性的证据,但该研究仍认为格伦佐西单抗联合阿替普酶治疗可能通过降低颅内出血及全因死亡率使重症AIS或需要行机械取栓治疗的患者获益,未来还需要更多临床研究数据提供支持43。转化生长因子叩是人体中参与免疫反应、纤维化的重要细胞因子44。Mai等45首先通过蛋白组学分析技术对比心肌梗死及AIS患者的血栓质地硬区域和质地柔软区域蛋白质的组成差异,结果显示,转化生长因子1在质地硬的血栓区域中表达上调尤为突出,该研究提示转化生长因子1可能是促进动脉溶栓的关键治疗靶点。4血栓力学目前对于血栓大体外观的描述在国际上尚无统一标准,大多数研究使用软、硬、韧、脆等词汇去描述,这类描述较为主观,这也导致了目前关于血栓力学方面的研究较少,并且现有对血栓力学分析的研究大多为体外构造血栓模型。部分研究对血栓作出力学分析,通常而言,富含钙沉积或胆固醇的血栓硬度更大。但大多数血栓的基本构成仍为纤维蛋白、血小板、红细胞,因此目前多数关于血栓体外力学分析的研究为以不同比例的纤维蛋白、血小板、红细胞合成多种血栓模型,在压缩或拉伸试验下建立血栓样本的应力-应变曲线,模拟在实际介入手术过程中通过取栓器械对血栓进行牵拉、抽吸、穿透等操作,从而展现血栓的弹性、抗形变力等力学特性46。一项研究纳入了19例接受取栓治疗的AIS患者,共得到41个血栓进行无限压缩实验,以应力-应变曲线的75%应变下的切线模量(Et75)作为血栓刚度,结果显示,血栓样本平均刚度为560kPa。多因素分析结果显示,血栓的纤维蛋白及血小板含量与血栓刚度增加密切相关(a=9z95%CI:513)47。因此推测富含血小板、纤维蛋白的血栓更耐形变,在机械取栓手术过程中能够接受更大牵引力而不被撕裂,导致闭塞的血管不易再通。一项在荷兰进行的关于急性缺血性卒中血管内治疗的多中心随机临床试验研究(multicenterrandomizedclinicaltrialofendovasculartreatmentforacuteischemicstrokeintheNetherlands；MRCLEAN)分析了670例大血管闭塞AIS患者的血栓体积、长度与临床预后的关系,该研究将头部CT、头颈部CT血管成像的影像学结果应用软件处理后得到血管内血栓的预计体积及预计长度,分析结果显示,血栓体积每增加0.1ml,相对良好预后(术后90dmRS评分4分)的发生概率平均降低17%(调整后COR=0.83,95%CLO.710.97),取栓次数平均增加0.16次(调整后=0.16z95%CIO160.28提示血栓体积较大的AIS患者在手术治疗时需要更多次尝试将血管内血栓取出,并且功能预后较差48。这可能是因为血栓体积大通常意味着为高负荷血栓,血栓阻塞程度严重,并且血栓发生脱落概率高,可能造成血栓逃逸、远端栓塞等。血栓逃逸是急性大血管闭塞性卒中行机械取栓术的并发症之一49。血栓发生移动或者碎裂可导致远端栓塞,引发新的梗死灶或阻塞侧支循环,影响缺血半暗带组织的血流灌注。一项前瞻性队列研究评估分析了AIS患者取栓过程中血栓逃逸的发生率及影响因素/63例AIS患者中有36例(22.1%)发生血栓迁移,经二元probit模型分析显示,富含红细胞(B=0.02zP<0.01)、侧支循环评分低(=-0.55zP<0.01)、血栓负荷评分高(=0.29,P<0.01)、长度更短的血栓(B=-0.07zP<0.01)更容易发生血栓逃逸11。推测可能是体积较大的血栓与血管壁的接触面积更大、黏附性更强,而良好的侧支循环增加了血栓远端的反向压力,对限制血栓迁移有一定的作用。因此,当术前高度怀疑为富含红细胞的血栓时,需警惕血栓逃逸发生的风险,术中可考虑使用远端保护伞。手术期间使用球囊引导导管,实现血流停搏和血栓抽吸,或许是一种良好的降低远端栓塞风险的策略。5血栓中的外源性物质血栓中发现的一些外源性物质并非血栓的必要组成成分,但外源性物质的存在可能参与了卒中发生的某些潜在的复杂机制,并且可能成为协助诊断卒中病因的重要依据。一项研究共回收了65例经血管内介入治疗后的缺血性卒中患者的血栓,通过病理组织学染色,在4例患者的血栓中观察到革兰阳性链球菌簇,在术后接受治疗期间,其中2例被确诊为感染性心内膜炎50。心内膜赘生物脱落形成栓塞是感染性心内膜炎的常见并发症之一,在早期可能由于缺乏发热、寒颤等症状而被忽视,临床上可能被划分为隐源性卒中,这对AIS的病因诊断造成一定的难度。术后对血栓进行组织病理学分析,可能可以在早期发现潜在的败血症依据,有助于明确卒中病因。宏基因技术检测显示,AIS血栓中可能存在多种来源的细菌,如温和链球菌、乳酸杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、假单胞菌、葡萄糖球菌、大芬戈尔德菌等,通常情况下这些细菌定植在口腔、肠道、皮肤等,大多为条件致病菌或低毒性菌51。但由于该研究中纳入的研究对象围手术期间均无明显的败血症发生,推测细菌促进血栓事件发生可能有多种复杂的机制,因此目前对于血栓中存在多种来源细菌仍无明确定论。一项研究通过快速准确的微生物来源追溯工具(fastexpectation-maximizationformicrobialsourcetracking,FEAST)分析了大动脉粥样硬化型卒中患者的血栓和同一患者、同时期的血浆、粪便、口腔样本中提取所得的细菌群特征,结果显示,46.7%的血栓细菌可能来源于血浆样本52,该研究结果有利于证实细菌通过菌血症进入动脉粥样硬化斑块内部这一假说。ISOShima等53通过自身对照研究分析了12例颈内动脉狭窄的牙周炎患者舌表面及动脉硬化斑块的细菌菌群特点,结果显示,二者菌群模式完全不同,这也间接证实了口腔细菌可能并不直接参与血栓形成的过程。定植于口腔的细菌在口腔外伤或牙科手术后进入血液,引起短暂的菌血症,进入血液中的细菌,可能被循环中的巨噬细胞吞噬,并最终进入动脉粥样硬化斑块内部,潜伏在动脉粥样硬化斑块中的细菌可能会改变斑块内微环境,促使斑块不稳定、破裂,最终导致血栓形成或血栓栓塞事件54。肠道微生物组是人体中最大的微生物库。肠道菌群紊乱及其内毒素和代谢物在肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化的病理生理过程中发挥重要作用。在AIS血栓中存在肠道微生物这一发现提示肠道微生物与卒中之间有更多潜在作用机制55。当发生脑缺血时,人体应激状态下可迅速诱导肠道缺血,最终导致肠道生态失调、肠道上皮细胞功能障碍,肠杆科菌群扩张并易位至血液中,进一步促进全身炎性反应,从而加重脑梗死症状56。目前研究中,乳酸杆菌是血栓中发现的含量最丰富的肠道菌群之一,推测这是由于乳酸杆菌在进入动脉粥样硬化性斑块内部后形成乳酸菌斑,使斑块内环境酸化,导致斑块脂质核心生长,促使斑块进展至不稳定斑块,这类斑块破裂后可随血流移动至脑动脉形成栓塞51,57。幽门螺杆菌是一种常见的革兰阴性螺旋菌,可引起胃炎、消化性溃疡和胃癌,有研究在颈动脉粥样硬化性斑块中检测到幽门螺杆菌DNA的存在58。基于血清抗体学,部分病例对照研究经荟萃分析后发现,含有细胞毒素相关基因a(cagA)的幽门螺杆菌菌株似乎是缺血性卒中的危险因素59。但由于缺乏大型随机对照试验研究,并且关于斑块中幽门螺杆菌发作的作用机制目前尚不能完全解释,其因果关系仍有待证实。部分研究者认为,幽门螺杆菌感染增加了一些炎性介质的表达,激活了血小板和凝血因子59。研究显示,新型冠状病毒可诱导体内凝血功能障碍,从而促进血栓形成60。DeMichele等61从新型冠状病毒感染的AIS患者血栓中的血小板上检测到SARS-CoV-2刺突蛋白,但未能检测到核衣壳蛋白或核糖核酸成分。这提示游离于血液中的SARS-CoV-2刺突蛋白可能为血小板活化和血栓形成的触发因素。虽然在血栓中直接发现了细菌的存在,但是细菌是否直接参与血栓形成尚且不能下定论。发生败血症时,细菌在血液中大量繁殖并在血液中流动,当血栓形成时,部分细菌被粒细胞挟裹至炎性反应部位,最终与红细胞、纤维蛋白等物质混合形成血栓,这可能是在血栓中发现细菌存在的合理解释。因此细菌对血栓形成的机制、细菌溯源等还需要更多的研究证实。6展望脑血管内介入治疗技术开展以后,研究者得以收集并研究AIS患者血栓的成分及构成特征。AIS血栓的成分复杂,具有高度异质性,该领域研究中仍存在一些局限之处。首先只有来自大血管闭塞并通过机械取栓成功取出所得血栓才可用于研究,无法获得自发或在静脉溶栓治疗后溶解的血栓,仅能通过影像学技术得到间接征象。因此,对于缺血性卒中的血栓研究存在样本选择偏移。此外,现研究虽然通过宏基因等技术证实血栓中存在多种来源细菌,但是并不能直接观察到细菌簇在血栓中的分布特征,难以鉴别其为偶然的菌血症还是卒中事件发生的始动因素之一。此外,通过分析所得细菌种属结果大多数为常见的定植菌,不能除外周围环境污染导致假阳性结果的可能。经过对血栓构成特征的深入研究,ADAMTS13、微溶酶、DNaSe1、格仑佐西单抗等药物有望成为治疗AIS新的靶向药。然而目前尚未发现溶栓疗效强于阿替普酶的新药,并且新药物研发大多仍在临床前阶段,距离实现临床应用仍有距离。目前关于AlS血栓的研究虽尚处于早期阶段,较多研究之间仍存在不同的观点或结论,但随着血管内介入治疗技术的持续发展,未来更大规模、规范化的血栓研究将成为必然趋势。