最新侵袭性真菌病真菌学检查指南要点.docx

最新侵袭性真菌病真菌学检查指南要点侵袭性真菌病是感染病学、微生物学、临床药学等学科共同的焦点。欧洲癌症研究与治疗组织和真菌研究小组教育与研究联合会诊断标准中，确定诊断和极似诊断对应有不同的真菌学检查。中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会、中华医学会检验医学分会临床微生物学组、中华医学会微生物学和免疫学分会临床微生物学组组织专家制定指南，就真菌侵入人体导致的血流感染、肺部感染、中枢神经系统感染、眼部感染、胸腔腹腔感染、关节感染等的适应证、适用样本、检测技术、结果解释和会诊等真菌学信息给出了共识性推荐意见，包括了常见的念珠菌、曲霉、毛霉、肺抱子菌、隐球菌、马尔尼菲篮状菌、镰刀菌、赛多施等，为该病的临床诊治防控和真菌学检查提供帮助。侵袭性真菌病(invasivefungaIdisease,IFD)即侵袭性真菌感染(invasivefungaIinfection,IFI),病死率高，是国际、国内关注的焦点1。近期世界卫生组织发布优先真菌病原清单是国际关注的集中体现2o其他感染病流行期间也有涉及3o按照欧洲癌症研究与治疗组织和真菌研究小组教育与研究联合会(EUrOPeanOrganizationforResearchandTreatmentofCancerandtheMycosesStudyGroupEducationandResearchConsortiurn,EORTC/MSGERC)标准4,IFD诊断分为3层，包括确定诊断、极似诊断和初拟诊断。确定诊断和极似诊断对应有不同的真菌学检查、影像学检查等。真菌学检查中，适应证具有不确定性，部分检查的操作和结果解释有挑战性，同时，部分检测技术和项目尚难以普及。中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会联合中华医学会检验医学分会临床微生物学组和微生物学和免疫学分会临床微生物学组组织专家撰写本指南。本指南主要包括适应证、样本、检测技术、结果解释和会诊等内容，目的是析疑解难、促进学科发展，为临床诊疗防控等提供专业帮助，为患者治病康复提供可靠服务。指南制定过程：（1）王辉教授牵头，中国医疗保健国际交流促进会临床微生物学分会、中华医学会检验医学分会临床微生物学组和中华医学会微生物学和免疫学分会临床微生物学组专家形成工作组。（2）确定执笔专家和汇总专家。（3）指南启动会，两次讨论会和定稿会。方法：参照推荐评估的分级、制定和评价（GradingofRecommendationsAssessment,DeveIopmentandEvaIuations,GRADE）方法，工作组对文献质量进行了评价，形成指南的初步文本。经讨论会讨论，最终确定推荐意见。并给出了推荐强度、证据质量等级（表1）。推荐强度分2级：强和弱。证据质量分3级：高、中、低。表i本指南推荐强度、证据质鼻等级的含义口体强逐口体隔述堂的于弊未疗完几乎不可能改立现有跖可嚷性96干长与学蟒相且或不H定中刘喃充可财玳有江56产星.可俱裁兖设育IIiS可，性«未央方克筏有三j能正交有江克群生里Ig.改交五有证JB可信曲可能性取一、适应证1 .念珠菌菌血症和其他念珠菌感染：推荐对有临床特征（持续发热、规范抗细菌治疗无效）同时合并风险因素（抗菌药物的使用、持续粒细胞缺乏、实体器官或干细胞移植、置入导管、全肠外营养、腹腔手术、胰腺炎、糖皮质激素、其他免疫抑制剂的使用等）患者进行相关样本的念珠菌镜检和培养等检查4（强，中）。老年、入住重症监护室（intensivecareunit,ICU）、机械通气、器官衰竭评分高等也是侵袭性念珠菌病（invasivecandidiasis,IC）,包括新型冠状病毒感染相关念珠菌病（COVID-19-associatedcandidiasis,CAC）的风险因素。中心静脉导管感染需要特别关注近平滑念珠菌等。下呼吸道样本直接镜检和分离培养出的念珠菌无法区分定植与感染，临床意义有限，常规不推荐进行鉴定和药敏试验5（强，低）。对所有疑诊IC的患者，推荐进行血液真菌培养，以提高病原学诊断阳性率6（强，中）。一旦确定念珠菌菌血症的诊断，推荐规律复查血培养，直到至少连续两次血培养结果阴性5（强，中）。推荐进行真菌的（1,3）-B-D葡聚糖检测（G实验）（强，中），感染早期G实验即可呈阳性，阴性预测值（negativepredictivevalue,NPV）较高7。怀疑IC,尤其是念珠菌菌血症时，推荐进行血液样本直接聚合酶链反应（PolymeraSechainreaction,PCR）检测（强，高）。与常规血培养相比，该检查具有更高的敏感度，特异度为90%8o临床可考虑常规开展念珠菌对唾类药物的敏感试验，耐药菌感染史、耐药菌高流行区、迁延不愈者，尤其应该进行敏感试验9,10（弱，低）。棘白菌素类药物敏感试验主要用于3种情况：近期有棘白菌素暴露史；近平滑念珠菌、光滑念珠菌、耳念珠菌所致感染需要用药；抗真菌治疗超过1周仍能分离出致病念珠菌9,11（强，低）。2 .曲霉病：推荐对具有侵袭性曲霉病（invasiveaspergiIIosis,IA）风险因素或怀疑IA的患者进行相关样本的镜检与培养12（强，中）。IA风险因素包括：血液系统恶性肿瘤、慢性肺部疾病、移植（实体和骨髓）、糖皮质激素治疗、中性粒细胞缺乏和慢性肝病，也包括使用免疫抑制剂、结构性肺病和肺部血管疾病、入住ICU、老年等。急性呼吸衰竭的新型冠状病毒感染（C0VID-19）患者，特别是有创通气时，使用糖皮质激素或托珠单抗治疗时，尤其需要注意COVlD79相关肺曲霉病（COVID-19-associatedpulmonaryaspergiIIosis,CAPA）o考虑曲霉感染时，建议增加痰样本的送检次数，以增加IA诊断的阳性率13（弱，中）。痰样本一般每天送检1次，不超过2次，连续23do支气管肺泡灌洗液（bronchoaIveoIarIavagefluid,BALF）中曲霉培养阳性时，推荐结合临床表现和影像学有意义特征，考虑诊断为感染而非定植14（强，中）。怀疑IA时，推荐采集组织活检样本，可应用六胺银染色和过碘酸雪夫染色识别真菌形态和结构15,16（强，中）。由于全球的曲霉耐药率仍然较低，初次治疗患者不推荐常规进行药敏检测。但如果出于流行病学和耐药监测目的，可对IA病例中分离的菌株进行药敏检测。治疗失败时，推荐进行药敏检测17,18,19,20（强，中）。由于特异性较差，一般而言，不推荐G实验用于IA诊断21（弱，中）。建议G实验联合其他诊断方法（如GM试验、曲霉PCR检测）用于血液系统恶性肿瘤患者的IA诊断22,23（强，高）。建议G实验用于免疫抑制的重症患者IA的诊断和筛查24,25（强，中）。推荐血清半乳甘露聚糖（gaIactomannan,GM）检测用于中性粒细胞缺乏患者疑似IA时的诊断26（强，高）。建议血清GM用于非粒细胞缺乏患者血液系统恶性肿瘤等情况时疑似IA的诊断（弱，中）27,28o不推荐血清GM用于慢性阻塞性肺病等非免疫抑制患者的IA单独诊断29（弱，中）。不推荐血清GM用于慢性肺曲霉病诊断30（弱，中）。推荐血清GM用于IA患者治疗效果的监测31（弱，中），但不建议其用于已使用预防性抗真菌治疗的无症状患者的监测和筛查32（弱，中）。对于非粒细胞缺乏患者，推荐对BALF进行GM检测，用于诊断IA33,34,35（强，高）。对于影像学高度怀疑慢性肺曲霉病患者，推荐进行曲霉IgG抗体检测36,37,38,39（弱，中）。曲霉IgG抗体在曲霉结节中的诊断价值缺乏文献报道。怀疑IA时，推荐进行BALF的曲霉PCR检测（强，中）。推荐连续2次，或2个及以上样本检测40,41,42o血液样本曲霉PCR可用于血液系统恶性肿瘤的IA诊断43（强，中）。3 .肺毛霉感染/毛霉病：已有基础疾病的患者发生发热伴咯血或其他呼吸道表现、且进展迅速，肺部CT提示局灶性实变、包块、胸腔积液或多发结节或“真菌感染可能”，推荐进行痰液、BALF组织活检（针吸或切片）的真菌染色和培养检查44,45,46,47,48,49（强，高）。基础疾病包括：糖尿病（尤其是酮症酸中毒，或控制不佳）、中性粒细胞缺乏、实体器官移植和造血干细胞移植受者、恶性肿瘤、铁过载、脓毒症、HIV感染等。风险因素还包括：各种原因导致免疫功能低下、外伤、使用广谱抗细菌药物、抱子环境暴露等。罹患C0VID-19时，血液病与实体器官移植、使用免疫抑制剂、粒细胞减少、糖尿病控制不佳、使用糖皮质激素，须注意COVlD79相关毛霉病（COVID-19-associatedmucormycosis,CAM）o糖尿病（尤其是酮症酸中毒）患者发生发热伴或不伴鼻溃疡或坏死、眶周或面部肿胀、视力减退、眼肌麻痹、鼻窦炎、头痛、神志改变，需立即进行相应部位分泌物或组织（针吸或切片）的真菌染色镜检和培养45,46,47,48,49,50（强，高）。4 .耶氏肺抱子菌肺炎（Pneumocystisjirovecipneumonia,PJP）/肺胞子菌感染：HlV感染者出现肺炎，亚急性起病，出现发热、干咳、进行性呼吸困难和低氧血症等临床表现，肺CT显示双侧多发弥漫性间质改变，累及肺门周围区域的双侧肺间质病变和肺泡浸润，双侧弥漫性毛玻璃样改变，推荐进行PJP病原学检测50,51,52,53（强，中）。PJP的风险因素包括：艾滋病、癌症、伴有器官移植（尤其是肾移植）的医源性免疫抑制、自身免疫性和炎症性疾病、肾病综合征等。检查方法包括特殊染色（如六胺银染色）、分子生物学检查（如PCR）、G实验和乳酸脱氢酶（IaCtiCdehydrogenase,LDH）。后两者NPV较高，美国移植学会强调G实验及LDH同时阴性对PJP有较高的NPVo非HIV感染的免疫缺陷患者（包括血液系统恶性肿瘤、实体瘤、器官移植、自身免疫性疾病、接受化疗药物、免疫抑制剂或生物治疗）出现肺炎，急性起病，出现发热、干咳、呼吸困难、低氧血症，肺CT显示肺间质纹理增强，双侧磨玻璃样改变，伴片状实变，推荐进行PJP的镜检和核酸检测50,51,52,53（强，中）。非HIV感染的PJP患者治疗一周后推荐进行肺CT检查以评价疗效，对治疗失败者应再次进行支气管镜检查和支气管肺泡灌洗以证实有无合并感染。不推荐采用肺抱子菌的PCR结果和血清G实验进行疗效评价54（强，中）。PJP发生医院感染暴发时，建议对该病区患者（包括免疫抑制患者及免疫正常者）进行呼吸道样本耶氏肺抱子菌筛查，包括基因型别的筛查51,55,56（弱，低）。5 .肺隐球菌病和隐球菌脑膜炎：免疫功能低下的患者（如HIV/AIDS、淋巴瘤、实体肿瘤、长期服用糖皮质激素等）出现咳嗽、呼吸急促、咯血等呼吸道症状，肺CT提示肺部病变，高度怀疑为肺隐球菌病时，推荐进行痰液、BALF细针抽吸物或肺活检切片的隐球菌染色和培养。有肺部症状且有胸腔积液时，推荐进行隐球菌抗原（cryptococcusantigen,CrAg）检测57,58,59,60（强，高）。注意试剂盒说明书样本范围。免疫功能低下的患者（如HIV/AIDS、淋巴瘤、实体肿瘤、长期服用糖皮质激素等）出现头痛、精神错乱、视力和听力障碍等中枢神经系统的症状，高度怀疑为隐球菌脑膜炎时，推荐进行脑脊液隐球菌培养、脑脊液墨汁染色、脑脊液CrAg检测等57,58,59,60,61（强，高）。影像学检查（特别是肺部及颅内）发现异常，而怀疑隐球菌病的患者，推荐进行血培养、血清隐球菌CrAg检测57,59,62,63（强，中）。不推荐对隐球菌感染患者常规进行抗真菌药敏试验。以下情况进行药敏试验57,63:（1）与氟康喳最低抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration,MIC）增加相关的格特隐球菌感染者；（2）初始治疗失败或复发的新型隐球菌感染者；（3）近期有抗真菌药物暴露（如氟康喳预防使用）的隐球菌感染者；（4）无法准确区分新型隐球菌和格特隐球菌时（强，中）。6 .马尔尼菲篮状菌感染：怀疑马尔尼菲篮状菌感染时，推荐采集感染部位样本进行真菌涂片镜检、培养、PCR或宏基因组下一代测序技术（metagenomicnext-generationsequencing,mNGS）等方法检测（强,低）。可以考虑外周血液和骨髓样本。HIV阳性患者感染马尔尼菲篮状菌常表现为播散性感染，侵犯多个器官。马尔尼菲篮状菌侵袭性感染的风险因素包括：急危重症和免疫功能低下者，如艾滋病患者（风险因素是CD4计数低）、癌症或器官移植患者。对于局部感染为主要表现，考虑为该菌感染的患者，推荐采集感染部位的样本进行真菌培养、涂片镜检、PCR或印NGS方法检测4,64,65（强，低）。对于疑似肺部马尔尼菲篮状菌感染患者，推荐采集痰液、BALF.肺病变部位细针抽吸物或肺活检切片进行染色镜检、培养、PCR或mNGS方法检测（强，低）。首发症状在皮肤，且考虑皮肤马尔尼菲篮状菌感染时，或确诊了皮肤马尔尼菲篮状菌感染时，除皮损部位分泌物或皮肤活检外，建议进行系统性判断，看是否播散性感染（弱，低）。7 .镰刀菌感染：当免疫缺陷人群发生肺部、皮肤等部位的感染、且对经验性抗菌治疗没有反应时，需要检测是否存在镰刀菌感染，推荐采集感染部位的样本进行真菌涂片镜检、真菌培养、PCR或mNGS方法检测（强，低）。侵袭性镰刀菌感染的风险因素包括急性髓系白血病、异体造血干细胞移植、巨细胞病毒再激活和基线时镰刀菌阳性皮损的存在。少数情况下，镰刀菌感染的患者可能表现为单一器官受损伤，如关节炎和鼻窦炎，或导管相关真菌血症4,66o推荐采集关节穿刺液、鼻窦吸出物等感染部位的样本进行涂片染色镜检、培养、PCR或mNGS方法检测（强，低）。8 .赛多把感染和多育节英施霉感染：赛多施是一种透明丝状真菌，广泛存在于土壤和污水中。赛多施和多育节英抱霉是引起人类感染的2种重要的丝状真菌。我国波氏赛多施较为常见（约占60%）o多育节荚施霉更为致命，死亡率高达77%。赛多施感染病例在世界各地均有报道，从局部感染到播散性疾病不等。赛多施感染的风险因素包括恶性肿瘤、实体器官移植、溺水和雪崩等，可以引起各个部位感染，没有具体器官的嗜好性。多育节荚抱霉可引起院内感染。对于疑似赛多能感染引起的足菌肿的患者，推荐采集皮损部位分泌物或皮肤活检进行染色镜检、培养、PCR或mNGS方法检测（强，低）。疑似赛多把引起软组织和手术伤口感染、关节炎和骨髓炎、耳真菌病、鼻窦炎、支气管过敏、眼部感染、血管假体感染、心内膜炎和播散性感染、中枢神经系统感染时66,67,68,推荐采集感染部位的样本进行真菌培养、涂片镜检、PCR或mNGS方法检测（强，低）。对于溺水、雪崩患者，高度怀疑赛多抱引起肺部感染时，推荐采集BALF、胸腔积液、肺病变部位细针抽吸物或肺活检切片进行染色镜检、培养、PCR或mNGS方法检测（强,低）。二、样本重视微生物学样本的采集和送检对于诊断IFD非常重要69o相对于细菌、病毒感染，真菌感染样本采集具有一定的特殊性。表2汇总了常见真菌在不同系统感染中的采集要求和策略。对于临床疑似真菌感染的患者，推荐先采集微生物样本送检，再使用抗真菌药物进行治疗70（强，低）。推荐从无菌部位采集样本；从有菌部位采集样本时，应尽可能减少正常菌群的干扰64,71（强，低）。推荐真菌样本送检前填写真菌检验申请单，申请单除常规内容外，建议添加真菌感染的风险因素、真菌感染的症状和体征、生物标记物如：C反应蛋白（C-reactiveprotein,CRP）、降钙素原（procalcitonin,PCT）、GM、G实验等结果等63（弱，低）。1 .血液：以下情况推荐进行真菌血培养。包括：血流感染（考虑酵母样真菌、丝状真菌和双相真菌）、导管相关性血流感染（考虑酵母样真菌）、心包炎和心肌炎、免疫受损患者会厌炎和声门上炎（考虑曲霉、其他丝状真菌）、免疫受损患者肺部感染（考虑镰刀菌属、英膜组织胞浆菌）、烧伤创面感染（考虑念珠菌、曲霉、镰刀菌、链格抱、毛霉目）、手术部位感染（考虑念珠菌）、皮肤和皮下组织真菌感染（考虑申克抱子丝菌、地霉、马拉色菌、毛霉目）、自体瓣膜心内膜炎且患者吸毒或有严重基础性疾病；人工瓣膜心内膜炎；新型隐球菌脑膜炎或肺炎66,71（强，中）。成人进行血培养后，如果病情持续或加重而临床始终不能除外菌血症，且首次血培养4872h阴性，建议隔12d后重复进行12次血培养，每次2套4瓶70（强，中）。2 .骨髓：推荐骨髓穿刺首选解剖部位是器后崎。如果患者不能活动，可以使用瓶前崎。婴儿可使用胫骨内侧表面67（强，低）。3 .呼吸道样本（痰液、BALF等）：推荐刷牙漱口后采集自气管深部咳出的晨痰，体积20.5mlo推荐挑取含脓液、血液、黏液的部分进行镜检及培养64（强，低）。怀疑曲霉感染时，建议进行大体积的未处理痰液和BALF培养68（弱，低）。对于疑似真菌感染患者，收集BALF样本时应不添加任何固定液，立即送检，不推荐冷藏样本择期送检（弱，低）。推荐用BALF检测GM以诊断是否为侵袭性真菌感染72（弱，中）。4 .脑脊液：注意脑脊液采集的适应证（如考虑中枢神经系统感染，不除外真菌病原的情况）、禁忌证（如颅内高压）。墨汁染色、隐球菌英膜抗原检测等是急查项目，采集后推荐立即送检，实验室接到后立即处理、报告。脑脊液涂片、培养等阳性结果按照危急值进行处理58,61（强，中）。5 .眼部样本：采集样本时若病变处分泌物过多，先用无菌湿棉签去除分泌物再选取病变处样本，立即送检。常温保存不超过2h（强，低）。直接显微镜检查有助于结膜炎的初步诊断，推荐采集2根拭子，1根用于培养，另1根用于制备涂片（强，低）。曲霉属推荐进行KoH涂片镜检，镰刀菌及暗色真菌推荐进行真菌培养，若发现真菌成分并结合临床症状可确诊侵袭性真菌感染71（强，高）。6 .穿刺液（胸腔积液和腹腔积液）：对于念珠菌性腹膜炎患者，建议早期进行腹腔积液样本培养。推荐手术或经皮穿刺收集的坏死或化脓性样本作为念珠菌腹膜炎微生物学诊断的样本，当怀疑有念珠菌时，推荐收集至少1ml腹腔液体或1g组织接种到培养基73（强，高）。对于继发于肺隐球菌感染的胸腔积液，推荐在真菌培养阴性时，检测样本中的新型隐球菌荚膜抗原74（强，高）。推荐在没有分子诊断资源的地区，采集足量组织样本以同时进行组织病理学和真菌涂片镜检、培养以诊断真菌感染75（强，高）。对于COVlD-19相关的肺毛霉病（CoVID-19associatedpuImonarymucormycosis,CAPM）,建议进行经胸穿刺活检，以诊断外周胸部病变患者的CAPM76（弱，中）。7 .鼻窦样本：推荐采集感染部位23块的组织或抽吸物送检（强，低）。当真菌侵袭鼻窦部引起慢性鼻窦炎时，建议样本仅从鼻腔较大的一侧收集并在24h内送往真菌学实验室77（弱，低）。三、检验技术1 .样本涂片镜检：临床考虑侵袭性深部真菌感染采集的样本，均应进行直接涂片镜检（强，高）。直接涂片可评估样本质量，快速明确样本中是否存在真菌，尤其是对尚不能常规培赛或常规生长极其缓慢的真菌，以及危重感染患者尤为重要。对于在组织样本中具有特征性形态（注意分隔、分支等）的真菌，直接涂片即可明确诊断。受制于样本中含菌量的多少和直接镜检敏感性等因素，检出真菌抱子或菌丝可明确表示样本中有真菌存在，但阴性并不能排除真菌感染。直接涂片前应根据样本类型进行前处理以提高真菌检出阳性率（强，中）。脑脊液、胸腹腔积液、关节炎、BALF等液体性样本需浓缩离心后涂片；黏稠性痰液、脓液、胸腹腔积液等可采取酶液化后涂片；大体积的组织样本应多处取样，印片或剪碎组织压片；少量样本应床旁迅速压片以免干燥。所有样本均推荐进行真菌免疫荧光染色，为提高真菌检出的阳性率和准确性，建议采用多种染色方法联合检查（强，高）。真菌免疫荧光染色几乎对所有的真菌均具有敏感度高、特异性强的特点；耶氏肺施子菌感染的诊断宜用荧光染色与六胺银染色联合检测；隐球菌感染的诊断宜用荧光染色联合墨汁染色和革兰染色；毛霉目感染的诊断宜用荧光染色联合糖原染色。直接镜检应仔细查找真菌抱子、菌丝和特殊结构78,79（强，中）。抱子可以从其形态、出芽与否及出芽方式，有无假菌丝、厚壁瓶子、内生施子、英膜等特点来鉴别，菌丝可以从菌丝的大小、有无分隔、菌丝颜色等分辨。真菌特殊结构如颗粒、菌核、硬壳小体对于真菌诊断具有重要价值。推荐涂片镜检结果报告，应报告是否检出真菌，并详细描述镜检发现的真菌抱子形状、排列方式，以及菌丝的形态，仅报告真菌检出阳性或阴性是不够的（强，高）。酵母样、腊肠样抱子,内含瓶子、厚英膜圆形抱子等具有特征性的抱子；假菌丝，透明有隔菌丝，无隔飘带样毛霉目样菌丝，暗色菌丝等特征性菌丝这些初步快速检测结果对于临床诊断方向具有重要参考价值。2 .培养：根据样本来源、可能的病原菌选择合适的培养基，建议实验室配备多种培养基，如不含细菌抑制剂（如氯霉素、放线菌酮等）和含细菌抑制剂的改良沙氏培养基、马铃薯葡萄糖琼脂、增菌培养基、念珠菌显色平板、真菌血培养瓶、常规细菌血培养瓶（弱，低）。进行正常无菌部位样本培养时，推荐同时使用不含细菌抑制剂的培养基和增菌培养基（强，低）。进行非无菌、非皮肤来源样本培养时，推荐同时使用含细菌抑制剂和不含细菌抑制剂的培养基、增菌培养基（强,低）。组织样本应剪碎后半埋在培养基中，不推荐用接种环进一步划线，怀疑组织胞浆菌感染时，推荐研磨组织；角膜分泌物推荐直接接种于培养基；无菌体液、BALF推荐离心取沉淀物接种（强，低）。初始真菌培养推荐2530°C孵育，保持足够的湿度，深部样本如活检组织、BALF.脑脊液等推荐3537°C同时孵育；血培养瓶遵循说明书要求（强，低）。丝状真菌建议平板培养基孵育3周，怀疑双相真菌（如组织胞浆菌）感染建议延长至46周。血培养瓶培养24周（弱，3 .传统鉴定方法和微生物质谱鉴定方法：传统鉴定方式对人员能力、检测体系和质量控制都有一定要求。实验室必须完成人员考核、能力验证，并常规进行质量控制（强，低）。对酵母型菌落和类酵母型菌落，推荐基于菌落形态、镜下形态、化学反应/同化反应、显色培养基（如CHROMagar念珠菌显色培养基）等方式，进行传统鉴定（强，中）。考虑念珠菌属以及其他酵母菌时，建议通过玉米-吐温琼脂上的菌落形态、厚壁抱子的产生与否、尿素酶试验、在含细菌抑制剂培养基上的生长能力、沙氏肉汤中的生长模式、对糖类的发酵同化作用等生长特性进行鉴定（弱，中）。对丝状型菌落和双相真菌，建议以马铃薯葡萄糖培养基上的菌落形态、生长速度、产生的色素，镜检特征性抱子和菌丝为主要依据，初步判断丝状真菌的种属（弱，中）。镜检建议通过乳酸酚棉蓝染色或小培养法显微镜镜下观察菌丝分隔情况、颜色、形态、附着结构、产施结构等（弱，低）。对于菌丝不分隔或很少分隔者，可根据菌落形态、产胞结构、假根等特征将其分为毛霉目（根霉属、毛霉属、根毛霉属、横梗霉属、共头霉属、小克银汉霉属）、虫霉目（耳霉属）、蛙粪霉目（蛙粪霉属）。对于菌丝分隔者，若菌丝为暗色，则需在离蠕抱属、枝施霉属、德氏霉、链格抱霉属、外瓶霉属、瓶霉属、弯施霉属间鉴别；若为透明菌丝，怀疑为丝状真菌，可根据顶囊、假头、抱子（产生方式、形态和排列状态）等特征进行曲霉属、镰刀霉属、枝顶施霉属、拟青霉属、赛多施属、木霉属、帚霉属间鉴别；怀疑为癣菌，则进行小瓶子菌属、毛癣菌属、表皮癣菌属内鉴别；怀疑为双相真菌,则进行组织胞浆菌、粗球抱子菌属、皮炎芽生菌、副球胞子菌属、申克施子丝菌、马尔尼菲篮状菌的鉴别。对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matri-assistedIaserdesorptionionizationtime-of-fIightmassspectrometry,MALDI-TOFMS）技术，必须明确鉴定范围（参见说明书），并定期完成质控。能力具备时考虑自建库，须进行能力验证（强，中）。不同真菌的前处理方式见表3。推荐对酵母样真菌进行MALDI-ToFMS技术鉴定。推荐靶板提取法（强，中）。靶板提取法未产生可接受的鉴定结果或出于生物安全考虑时，建议使用甲酸乙聘萃取法处理酵母样真菌（弱，低）。一般培养1824h的酵母样真菌适宜用于质谱鉴定，而生长较慢的酵母样真菌可延长至48ho美国临床和实验室标准研究所（CIiniCalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）指南CLSI-M58推荐IXIo5-1X107CFU/孔位的菌量以提高鉴定性能。明确质谱数据库中酵母样真菌鉴定范围，并进行定期更新。对丝状真菌，建议采用：（1）制造商推荐的甲酸乙睛萃取法（弱，低）；（2）双甲酸“夹心”法作为前处理方法80（强，中）。不建议对原始样本直接进行MALDI-TOFMS检测。对血培养、体液增菌培养样本中酵母菌，可以尝试该技术，但须进行性能验证（弱，低）。表3质谱鉴定不同种类JtaB时的前处理方式筋处理方法一心用闺S三摧除而承Ses2W三S道网于大部分冷用W用取乙g?；去粕现h2加方正程解加aa,回一好3称收僚”丝状JI全小丝濠有法it夏的It生圣方濠皎方叱新处理方法双”夹心WS道咫于陡6.«9tS*M*力趣分叁状JI塞研库分苔特甲眼乙法适用于手见线状Jl以及生长皎花”状IwB液体中乙!Pm三三遁咫于以S至方濠无法遢熨海员Jta的滔.兄4 .免疫学检测：脑脊液和血液样本中，隐球菌英膜多糖抗原检测阳性为隐球菌脑膜炎的确诊指标；血液样本隐球菌抗原检测阳性作为肺隐球菌病的确诊证据之一；对于检测阳性者，推荐进行半定量检测59,62（强，高）。动态监测英膜多糖抗原滴度，结合临床因素可作为启动治疗和调整治疗方案的证据81,82,83o血清G实验阳性主要用于疑似IFD（包括念珠菌病、曲霉病、肺抱子菌病等）的辅助诊断，但不适用于隐球菌病和毛霉病；G实验NPV较高84。动态连续监测可用于指导念珠菌感染的抗真菌治疗85（弱，中）。对G实验，输注白蛋白或球蛋白、血液透析患者、输注抗肿瘤的多糖类药物、使用磺胺类药物、外科手术后及样本接触某些纱布等可能造成假阳性；采血管污染可能出现假阳性；严重溶血样本可能造成假阳性86o近平滑念珠菌病时有一定假阴性率；抗真菌药物的使用可能造成假阴性。推荐血液、BALF和脑脊液的曲霉GM试验阳性用于疑似IA（尤其是血液恶性疾病、化疗以及接受造血干细胞移植患者）的极似诊断87o在非粒细胞缺乏患者肺侵袭性曲霉感染时，BALF的GM试验敏感性高于血清4,59（强，高）。建议动态监测，注意不同样本的判断阈值不同4（弱，中）。阈值：单次血清或血浆GM值21.0、或BALF的GM值21.0、或单次血清或血浆GM值20.7并且BALF的GM值20.8、脑脊液GM值21.O可作为IA的阳性诊断标准。假阳性可见于其他真菌（马尔尼菲篮状菌、隐球菌等）感染、应用B内酰胺类抗菌药物（尤其是哌拉西林/他喳巴坦）、静脉注射含有半乳甘露聚糖成分的药物、食用曲霉污染的谷类及牛奶等59,88o假阴性可见于应用抗真菌药物、病情较轻、抗原浓度低等情况59o曲霉特异IgG抗体是检测慢性空洞性肺曲霉病最敏感的方法，推荐曲霉特异IgE水平和血清总IgE升高用来确定诊断变应性支气管肺曲霉病（aIIergicbronchopuImonaryaspergiIIosis,ABPA）89,90,91（强，中）。曲霉特异IgG抗体检测可用于慢性肺曲霉病的诊断和治疗监测，推荐在治疗周期内至少检测3次92o念珠菌甘露聚糖抗原与甘露聚糖抗体联合检测适用于念珠菌菌血症和慢性播散性念珠菌病（弱，低）。5 .核酸PCR检测：PCR检测技术可在较短的时间内检测真菌DNA,有利于IFD的早期诊断。但到目前为止，具有注册证的PCR法诊断真菌感染的试剂盒有限。自建的PCR检测技术不能替代常规微生物学检测技术和病理学检查。推荐对真菌PCR检测的试剂、耗材进行性能验证，对结果进行全过程质量控制93（强，高）。对于临床样本含有低丰度的真菌DNA或涂片可见真菌成分，但培养阴性时，建议采用已验证过的PCR方法对临床样本进行检测59（弱，低）。对于念珠菌血流感染，建议对全血液样本进行念珠菌通用PCR检测。该检测项目可用于念珠菌菌血症的排除诊断4（弱，低）。对于耶氏肺抱子菌肺炎，建议对呼吸道样本进行PCR检测4（弱，低）。国内有研究采用PCR对怀疑IFD的537例患者的痰样本进行检测，该方法对耶氏肺抱子菌检出的敏感度为99.28%,特异度为98.50%,阳性预测值为95.80%和NPV为99.75%,临床应用前景良好94o对于肺曲霉感染，建议对血液样本（全血、血清、血浆）、BALF进行曲霉通用PCR检测（弱，低）。2019年修订的EORTC/MSGERC指南中，全血、血清、血浆曲霉通用PCR法已纳入到IA极似诊断的真菌学标准4o欧洲临床微生物学和感染病学会（EUrOPeanSocietyforClinicaIMicrobioIogyandInfectiousDiseases,ECSMID）、欧洲医学真菌学联合会（EUroPeanConfederationofMedicaIMycoIogy,ECMM）和欧洲呼吸学会（EllroPeanRespiratorySociety,ERS）联合指南推荐适度使用BALF样本诊断IA68。其他下呼吸道样本可供参考。对于肺毛霉感染，建议对BALF、血清进行PCR检测（弱，低）。对于组织毛霉感染，建议对新鲜组织或福尔马林固定和石蜡包埋组织样本进行PCR检测。目前国内已经有针对组织样本中毛霉目真菌的分子检测方法，但由于缺乏标准化和全面临床评估，可作为组织病理和培养的辅助诊断方法95o6 .mNGS:mNGS在IFD病原学诊断中的临床应用范围包括免疫功能低下或重症IFD,疑难IFD,经验治疗和早期靶向治疗无效的IFD,对侵入性手术不耐受的IFD96（强，中）。mNGS应用于IFD的报告解读，除了关注检测出病原真菌的特异性序列数和基因组覆盖度图之外，一定要结合临床表现、影像学、患者因素、微生物学其他检测结果、病理学检测结果、其他间接性感染性指标等综合判断97（强，低）。鉴于毛霉目真菌培养阳性率低、血清学G和GM试验不能覆盖等，对于免疫受损患者（如造血干细胞移植）高度怀疑毛霉目真菌感染时，推荐送检真菌涂片和培养的同时，进行血液或感染部位组织样本的mNGS检测（强，低）。耶氏肺瓶子菌可在呼吸道定植，判读其mNGS结果时，推荐结合临床表现、影像学、患者因素、G实验、LDH等综合判断（强，低）。鉴于荚膜组织胞浆菌、马尔尼菲篮状菌和利什曼原虫在组织病理中难以区分，在非流行区组织病理怀疑以上病原体时，mNGS检测可作为辅助病原学诊断手段之一（弱，低）。在BALF中，mNGS测出少量新型隐球菌序列，应参考外周血或BALF隐球菌荚膜多糖抗原检测结果（强，低）。在BALF中，mNGS测出少量曲霉序列，应参考BALFGM实验结果（弱，低）。mNGS在IFD病原学诊断中的技术问题包括：高成本、人类患者宿主细胞的影响、外源微生物污染、厚壁真菌核酸提取效率低（尤其是隐球菌）等。mNGS应用于IFD病原学诊断的流程亟须标准化。7 .抗真菌药物敏感性试验：推荐使用肉汤稀释法进行抗丝状真菌药敏试验。微量肉汤稀释法和宏量肉汤稀释法检测抗丝状真菌MIC具有良好一致性。纸片扩散法可补充肉汤稀释法用于抗丝状真菌药敏试验98（强，中）。推荐纸片扩散法培养基为不补充钙、镁的MH琼脂平板，接种浓度为0.4X1065X106CFU/ml。两性霉素B的判读标准为生长完全抑制的抑菌环，泊沙康喳、伏立康喳、伊曲康喳和卡泊芬净判读标准为80%抑制。进行肉汤稀释法抗丝状真菌药敏试验，方法、流程、质量控制及结果判读推荐参考CLSIM38L99,结果解释推荐参考CLSIM38M51S100及M57S101（强，中）。推荐用RPMI-1640肉汤制备终浓度为0.4X104CFUml_5X104CFU/ml的菌悬液。两性霉素B、伊曲康哇、泊沙康喳、伏立康喳、艾沙康喳的生长终点判断标准为100%抑制，氟康喳、氟胞喀唉和酮康喳的生长终点判断标准为约50%抑制，棘白菌素类应用最低有效浓度（minimumeffectiveconcentration,MEG）生长终点的概念。目前只建立了伏立康喳对烟曲霉的临床折点。对于烟曲霉外的曲霉，两性霉素B、卡泊芬净、艾沙康喳、伊曲康喳、泊沙康喳和伏立康喳已建立了流行病学界值。推荐使用肉汤稀释法进行抗酵母及酵母样真菌药敏试验。微量肉汤稀释法和宏量肉汤稀释法检测抗酵母及酵母样真菌MIC具有良好一致性。纸片扩散法可替代肉汤稀释法用于抗酵母及酵母样真菌药敏试验102（强，中）。推荐纸片扩散法培养基为0.5%亚甲篮+2%葡萄糖MH琼脂平板，接种浓度为0.5麦氏单位。两性霉素B的判读标准为生长完全抑制的抑菌环。喳类、氟胞喀噫和卡泊芬净判读标准为量取至有正常大小菌落生长的抑菌环直径大小。进行肉汤稀释法抗酵母及酵母样真菌药敏试验，方法、流程、质量控制及结果判读推荐参考CLSIM27103,结果解释推荐参考CLSlM27M44S104及M57S101（强，中）。推荐用RPMI-1640肉汤制备终浓度为5×102zw2.5×103CFU/ml的菌悬液。两性霉素B的生长终点判断标准为100%抑制，唾类、氟胞喀噫、棘白菌素类的生长终点判断标准为约50%抑制。目前只建立了白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌的药敏试验判定折点。结果报告应关注特定菌种的天然耐药性和感染部位抗真菌药物的有效药物浓度（强，低）。药敏试验报告中，不报告对特定药物具有天然耐药性的实验结果，如隐球菌属不报告棘白菌素类；克柔念珠菌不报告氟康喳；红酵母菌属不报告棘白菌素类及氟康喳；曲霉属不报告氟康喳；淡紫紫抱菌不报告两性霉素B;毛霉目不报告氟康喳、伏立康喳、伊曲康喳和棘白菌素类；毛施子菌属不报告棘白菌素类；镰刀菌属不报告氟康喳和棘白菌素类；多育节荚施霉不报告两性霉素B及氟康喳。泌尿系统感染不报告棘白菌素类、伏立康唾、伊曲康唾，眼部感染不报告棘白菌素类。结果解释需注意临床折点和流行病学界值的不同意义（强，低）。临床折点的建立是基于MlC分布、药物代谢动力学/药效学参数、临床疗效与MIC结果的关系，可预测临床疗效，可将菌株分为敏感、剂量依赖性敏感、中介、耐药或非敏感。流行病学界值仅根据体外数据建立，基于MlC分布，不能预测临床疗效，但可识别耐药突变菌株，可将菌株分为野生型与非野生型（有/无获得性耐药或敏感性降低）。8 .真菌同源性分析：医学上重要真菌基因分型在研究真菌感染的暴发、医院传播、感染途径和基因型表型相关性等方面都有应用，特别是在继发性耐药方面有较深入的研究。目前比较常用的方法有3种：多位点序列分型（multilocussequencetyping,MLST）、使用短串联重复（shorttandemrepeat,STR）标记的微卫星长度多态性（microsateIliteIengthpoIymorphism,MLP）和全基因组测序分型（whoIe-genomesequencing,WGS）