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最新人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻中国专家共识2023摘要人类卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻是辅助生殖技术的重要组成部分。由中国医师协会生殖医学专业委员会发起，参考最新国际指南和共识，结合中国临床实践现状，经充分讨论后形成该共识，旨在加强玻璃化冷冻技术质量控制，进一步改善卵母细胞及胚胎冷冻结局，提升辅助生殖服务质量。卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻保存是人类辅助生殖技术(assistedreproductivetechnology,ART)的重要环节。相较于传统的程序化冷冻，玻璃化冷冻技术以其简单快速、不依赖昂贵设备，且复苏率极高的显著优点，在国内外各大生殖医学中心迅速普及推广，从而为人类生育力保存、胚胎植入前遗传学检测以及全胚冷冻策略的广泛临床应用，提供了必要的核心技术支持。卵母细胞及胚胎的冷冻复苏结局受诸多因素影响，包括冷冻保护剂种类、样本平衡时间、降温/升温速率和冷冻载体类型等，造成各生殖中心间冷冻结局的差异。有鉴于此，参考最新指南和共识CF,结合中国临床实践，由中国医师协会生殖医学专业委员会发起，组织本领域专家对人类卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻技术流程和细节进行归纳总结，以期提供一套全面系统的玻璃化冷冻操作规范指导意见，提升生殖医学中心服务质量。一.人员资质培训初学者培训采用导师负责制，以经验丰富的胚胎学家作为指导老师，由指导老师依据质控指标和经验判断初学者达到标准后，方可进入下一阶段培训。整个培训过程形成书面记录存档。1 .理论学习初学者应理解玻璃化冷冻的基本原理，掌握冷冻保护剂浓度、操作温度、降温/升温速率等基本概念及控制方法网。2 .动物样本建议初学者在指导老师监督下使用动物样本进行为期12个月的培训。以小鼠8-细胞胚胎为样本不断练习冷冻和解冻操作，以熟练掌握试剂耗材的使用方法。鉴于小鼠胚胎对冷冻和解冻操作的敏感性低于人类胚胎，建议对初学者的要求设为操作50例小鼠8-细胞胚胎的复苏率不低于同中心人类卵裂期胚胎（第3天）复苏率，且复苏后的小鼠8-细胞胚胎需继续培养24-48h,其囊胚形成率应80%3.由于鼠与人的种属差异，动物样本操作应在单独设置的培养室开展，不宜在人类体外受精（invitrofertilization,IVF）实验室进行。3 .人类废弃卵母细胞或胚胎使用常规废弃人类卵母细胞或胚胎进行培训，如不成熟卵母细胞、多精受精卵母细胞、废弃的卵裂胚或囊胚（多精受精卵母细胞来源），以熟悉人类卵母细胞或胚胎形态体积及冷冻解冻操作。4、临床实践操作初学者通过使用动物样本和人类废弃样本熟练掌握技术，在复苏率达到控制标准后，由指导老师带领初学者开展临床实践操作，分配患者的小部分卵母细胞/胚胎交由初学者处理，建议初始比例不超过20%o二、试剂与耗材的选择使用1 .坡璃化冷冻保护剂主要包括渗透性和非渗透性冷冻保护剂。前者具有较好的水溶性和膜渗透性。高浓度渗透性冷冻保护剂所形成的高渗透压环境可促使细胞快速脱水，同时渗透性冷冻保护剂能迅速进入细胞内并置换水分子，这既能避免降温过程中大冰晶的形成，又能确保在极低温度下细胞内呈玻璃化状态，最终实现在液氮中长久保存。常用的渗透性冷冻保护剂有乙二醇、丙二醇、丙三醇和二甲基亚飒等【11】。非渗透性冷冻保护剂不能通过细胞膜，通过在细胞外形成适度的渗透压促使细胞进一步脱水。非渗透性冷冻保护剂的使用既减少了渗透性冷冻保护剂使用浓度，又缩短了细胞在冷冻保护剂中的暴露时间。在解冻过程中，非渗透性冷冻保护剂可以防止细胞过度膨胀而崩解。常用的非渗透性冷冻保护剂有蔗糖和海藻糖【皿。玻璃化冷冻试剂套装一般包括基础液、平衡液和冷冻液。基础液通常含有人血清白蛋白和PH缓冲体系，如4-羟乙基哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid,HEPES)和3-吗琳丙磺酸(3-(N-morpholino)-propanesulphonicacid,MOPS);平衡液是在基础液中添加渗透性冷冻保护剂制成；冷冻液是在基础液中添加更高浓度的渗透性和非渗透性冷冻保护剂制成。解冻试剂套装通常包括解冻液、稀释液和基础液，解冻液和稀释液分别是在基础液中添加高浓度和低浓度非渗透性冷冻保护剂制成。建议选择带有注册信息的商品化冷冻和解冻试剂，不推荐自行配制；首选鼠胚实验、内毒素检测、无菌性检测、PH和渗透压检测等质控项目齐全的产品。有条件的中心常备两套不同品牌的玻璃化冷冻和解冻试剂，以应对突发性事件，如批次质量不合格或供货不稳定等问题。2 .冷冻载体按照储存方式分为开放式和封闭式两类。开放式载体，如商品化的Cryotop载体、VitriFit载体，可达到较高的降温速率；由于样本直接接触液氮，存在交叉污染的可能性【13，但目前尚无样本污染报道。封闭式载体，如商品化的HSV载体、RaPid-i载体，可阻止生物样本间交叉污染HG,但降温速率较开放式载体有所降低"I。开放式拉伸麦管载体(如OPS载体)兼顾开放式载体的降温速率、封闭式储存和恒定冷冻装载液体量等特点口叫开放式和封闭式载体进行卵母细胞和胚胎冷冻的效果相当口7-2。,建议感染检查阳性或携带者使用封闭式载体或单独液氮罐储存。三、卵母细胞.卵裂胚和囊胚的坡璃化冷冻和解冻操作1 .卵母细胞坡璃化冷冻(1)准备冷冻试剂提前预热至室温(2426°C)卵母细胞冷冻时间应在人绒毛膜促性腺激素注射后38-40h【2】。冷冻前应进行脱颗粒细胞操作0,并评估成熟度，但也有报道称冷冻过程中放射冠细胞保留对解冻后卵母细胞发育有积极意义MR。成熟卵母细胞特征是卵周间隙见第一极体。对于未成熟卵母细胞，先进行2448h的体外成熟培养，发育成熟后行玻璃化冷冻保存23-24。建议单个载体装载的卵母细胞数量不多于5枚。(2)操作步骤示例卵母细胞玻璃化冷冻操作在室温下进行，参考步骤详见图1。在60mm培养皿盖上滞!J作等体积的基础液和平衡液液滴，体积不小于150L;将卵母细胞移入基础液后，桥接2个液滴，卵母细胞移到连通液滴中间位置，静置3min。冷冻试剂使用前充分混匀。在连通液滴正下方，制作1个新的平衡液液滴，并与上方液滴桥接，将卵母细胞移至连通液滴中间位置，静置3mino另取一个35mm的培养皿，制作新的平衡液液滴并覆盖培养油,将卵母细胞移入液滴后静置69min,卵周间隙恢复至初始状态即可结束此步操作（图2AC）。为维持液滴渗透压稳定，建议单个液滴体积不小于40L,并覆盖至少3mL培养油，此步骤操作皿即做即用，并在Ih内完成使用25-26。另取一培养皿制备数个体积不小于40L的冷冻液液滴，将卵母细胞在冷冻液中至少转移35个不同位置，以去除残留的平衡液。按所用冷冻载体操作方法进行装载和液氮冻存（步骤+总时长是4560s）。选择口径略大于卵母细胞直径的转移管装载有助于精准控制携带液体量，卵母细胞装载后立即浸入液氮。注:液滴数盘及小局仅供参考图1邸母IMK冷冻撵作示意IS图2卵件细胞渗透平衡过程A东初始形态卵母细胞;B示平衡液中Imin;C示卵卅细胞渗透平衡2 .卵裂胚和囊胚坡璃化冷冻操作(1)准备室温(2426)或37下行冷冻操作,相较37。(：，室温条件下需更长平衡时间，提前预热冷冻试剂、培养油和培养皿。制备含有基础液和平衡液液滴的操作皿，并覆盖足量培养油，每个液滴体积不小于40L0卵裂胚可直接冷冻，囊胚冷冻前行人工皱缩操作(详见四、冷冻和解冻相关操作。单个载体装载卵裂胚或囊胚个数不多于2枚，由于单囊胚移植策略的广泛应用，建议优质囊胚进行单胚冷冻。(2)冷冻胚胎选择选择第23天的可利用卵裂胚以及第57天的可利用囊胚进行冷冻。胚胎级别描述详见人类卵裂期胚胎及囊胚形态学评价中国专家共识。(3)操作步骤示例参考步骤见图3。胚胎移入基础液中清洗约1min（非必选项）o将胚胎移入平衡液液滴上方中间位置，使其缓慢下沉，根据操作温度将胚胎静置相应时间，待其细胞球体积恢复至初始状态即可结束此步（图4AC）。另取一培养皿制备数个体积不小于40L的冷冻液液滴，将胚胎在冷冻液中至少转移35个不同位置，以去除残留的平衡液。按所用冷冻载体操作方法进行装载和液氮冻存。6期囊胚粘油后易飘浮至液面上层，导致胚胎吸取转移困难，因此需确保转移管中与胚胎接触的液体不含油。注:液清数星及布局仅供参考图3卵&杯国奥杯冷冻掾作东它图图4卵裂胚的渗透平衡过程A示初始膨态卵裂胚;B示平衡液中1min;C示卵裂胚渗透平衡3 .卵母细胞、卵裂胚和囊胚的解冻操作(1)准备提前制备操作皿并充分预热，参考步骤见图5。解冻液操作皿:培养皿中制备一个解冻液液滴(200L),充分预热至37,覆盖培养油有助于在解冻第一步中维持液滴温度稳定。稀释液及基础液操作皿：培养皿中制备数个体积不小于40L的稀释液和基础液液滴，覆盖培养油并于室温备用。注:液滴数出及布局仅供参考图S那姆细袍.丽装杯和囊胚的M冻掾作示.盘图(2)操作步骤示例按所用载体操作方法将卵母细胞或胚胎快速(1S内)从液氮取出并浸入解冻液45-60s,并将飘浮于解冻液上层的样本移至液滴中央。样本转移至稀释液中，静置3min样本转移到基础液中，静置5min样本转移到新的基础液中，静置5mino转移样本时携带少量原液体，以减缓浓度变化。(3)解冻后相关操作时间点建议卵母细胞解冻后23h行卵胞质内单精子注射。卵裂胚可在移植前一天或当天解冻；囊胚解冻与移植时间间隔对妊娠结局的影响尚无充分证据【27】，建议培养2h后移植，以观察囊胚复苏状况并预测妊娠结局。四、冷冻和解冻相关操作1 .囊胚人工皱缩囊胚腔液在冷冻时形成的冰晶可损伤胚胎发育潜能。人工皱缩是指在囊胚玻璃化冷冻之前使用穿刺法或激光法使囊胚腔皱缩的技术，激光法因其简便性而得到广泛应用。人工皱缩能否改善妊娠结局尚存争议，随机对照研究表明人工皱缩不影响囊胚种植率28,但对囊胚复苏率有所改善28-2叫尽管目前尚无人工皱缩导致不利结局的临床证据GO%,但仍需进一步观察其远期安全性。激光打孔位置选择远离内细胞团的滋养层细胞间隙（图6）,不同品牌激光破膜仪的输出功率存在差异，需根据效果设定激光强度，击打12次为宜。囊胚在实施激光皱缩10-15min后即可冷冻，不宜时间过长，预防囊胚再扩张。图6激光打孔位置位于滋养层细胞间隙2 .辅助孵化复苏胚胎移植前是否行辅助孵化尚存争议，尽管有研究显示其对临床妊娠率有一定改善作用田-35,但仍存在增加双胎妊娠的风险田】。对于卵裂期或致密化期胚胎，不同透明带消融程度（削薄法或打透法）的效果尚无明确结论36-40,多项随机对照研究结论不尽相同。为兼顾辅助孵化技术的安全有效性，推荐采用削薄法对卵裂期或致密化期胚胎进行辅助孵化，削薄范围为透明带周长的25%50%,深度为透明带厚度的50%80%14。-4汽复苏周期囊胚的辅助孵化通常是在皱缩状态下进行，4期以上囊胚的透明带较薄，多采用打透法行辅助孵化。为保证囊胚顺利孵出，避免内细胞团卡顿，建议消融透明带周长的25%50%45-47,且激光灼烧处与胚胎细胞保持安全距离。早期囊胚透明带较厚，可行削薄法辅助孵化。五.质量控制1复苏成功的定义根据卵母细胞、卵裂胚和囊胚解冻后的形态学表现判断是否成功复苏。卵母细胞：成功复苏的标志为细胞膜形态正常且细胞质清晰透亮。如出现细胞质变暗、细胞质内大量空泡化、细胞质渗漏或卵周间隙异常等现象，表明冷冻复苏过程中出现细胞结构损伤甚至死亡。如解冻后卵母细胞透明带轻微损伤破裂，但细胞膜完整无异常，不会严重影响卵母细胞发育。卵裂胚：复苏后的卵裂胚可表现为全部卵裂球存活、部分卵裂球存活和全部卵裂球死亡。卵裂胚复苏存活定义为解冻后至少半数卵裂球存活；卵裂胚复苏完整存活定义为复苏后所有卵裂球存活。囊胚：囊胚复苏存活定义为至少75%的细胞存活，也可通过解冻后12h观察囊胚是否再次扩张来判断是否复苏成功。2.质控指标持续周期性监测冷冻和解冻相关质控指标，有助于及时发现安全隐患，确保玻璃化冷冻和解冻技术稳定有序开展。参考国内外最新进展及共识，推荐的卵母细胞、卵裂胚和囊胚玻璃化冷冻和解冻质控指标见表K质控指标的统计需基于适当样本量，并参照能力值（标准下限）和基准值（理想指标）开展评价。判断某一质控指标是否出现异常波动基于三项重要参数，分别是该指标能力值、上一年度平均值及标准差。在如下情况发生时启动异常数据分析路径：质控指标低于能力值；质控指标低于或高于上一年度平均值的2个标准差。«I卵f;J细胞.卵裂胚和囊胚玻璃化冷冻和苏防控指标阳母知Iit复苏率H “活卵母细电数制陈卵母细袍数XloO%IE常受精率=第I大出现2PN卵做数/注射卵 你细胞敢Xl（KKS第3人胚胎形成率=第3大8.细但胚胎数/正常,受 M期口擢色敷XIOIM第W6人囊股形成率H第56*ff（ >2糊）数，行囊 胚培源的用裂胚数Xlo0%件Ift率=孕It数/移用卵裂胚或囊胚故Klo（K与同中心新鲜卵母州也正常受精率相化不Itt F 10个讦分点，同中心新斛卵母加胞第3人胚聆影或率相比弟讣无统计学意义“同中心新”即母细胞界5/6人爱胚形成率相比差计无统计学意义不低同中心新鳏HiIfi计情率的7O%9O%那裂胚和食M依苏存活率=存活卵裂胚或Ir胚数/斛原期裂胚或 囊 MekxlOiMf&苏完整存活率完整存活卵费胚ftf冻卵裂胚 ftx00¾85%80%(Wtb)7<MM 卵裂 IK)95%(卵裂胚, 95%(IHi) 85%(串裂|£)即m率=懵数/移加邪瞿胚或真肝数KIO（Kr不低HnI中心新鲜K胎号M率的与同中心新翼胚酌种桁率相比差兄无统计学注:'示IX的布裂物的种植率的计算仅纳人断葬完整存活卵裂旺;21、示双原核3、数据异常分析路径卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻复苏的结局与人员操作水平、培养环境、试剂和耗材等多个环节密切相关。关键指标异常时可按图7所示路径进行分析。人员是台更改课作流程、人员变冷关W指标异常煤作技术液滴过度、液滴诿透不、 掾作时间、液氯油密封性' 液氨容量,、转移谷住、 破体装荻液体Sl培养环境样本本身因素培养箱温度、用对温度.气体浓度空内环境室温、湿度、空气质量、九IW2A-冷迎月关媒作冷冻觥卵母”脏她吊、扑胎战冽我公类M、耳温/升限速率、批号、外包装破损冷冻/解冻试剂和培齐液品牌、批号、是储/W在温度、角效期的助商化漱光修双、Jft光小打配位人IE缩激光奈度.奚胚兴推程废图7数据异常分析路衿六、冷冻保存时限胚胎冷冻保存时间对妊娠结局的影响尚无定论【48-56,近期不断有研究提示冷冻保存时间延长对胚胎的不利影响【52-55。HU等52报道妊娠结局开始下降的时间点是保存时间达到6个月，Cui等El报道的时间点是5年。现阶段卵母细胞冷冻复苏结局仍无法与胚胎相媲美，且对于卵母细胞冷冻时限研究的数据较少，部分研究报道卵母细胞冷冻保存148个月似乎不影响复苏结局【57。基于有限证据，从冷冻复苏结局、ART治疗效果、伦理学、节约医疗资源等方面综合考虑，建议卵母细胞的最佳冷冻保存时限为1年，胚胎的最佳冷冻保存时限为5年【5叫七、冷冻储存室的管理IVF冷冻储存室存有人类配子和胚胎等重要生物样本，需建立严格的管理制度以确保安全运行59-61】，其管理条例应遵循(但不限于)如下内容。1.人员培训和权限使用液氮前对相关工作人员开展培训并记录存档。冷冻储存室设置安全锁，只有通过培训的工作人员和授权人员可以进入。对于有条件的实验室，液氮罐可采用双锁双人管理或电子锁双指纹管理的模式。2冷冻储存室的配置冷冻储存室较理想的位置是IVF实验室外围房间，需配备通风装置、手套、护目镜、防护罩等设备。冷冻储存室需在门上安装观察窗，地面采用压花钢板等防滑耐冻材质；在距地面高度1.52.0m的墙壁上安装氧气浓度报警器，来确保氧气气体体积百分比不小于19.5%3.冷冻储存室的日常检测和维护(1)液氮含量监测建议每周2次手动检查储存罐液氮量，有条件的实验室安装液氮液位监控报警系统，每季度至少测试一次该系统的有效性。冷冻储存室的日常监控和维护需书面形式记录。(2)液氮罐巡查需每天观察液氮罐外观是否存在冷凝水、锈迹、裂痕及损坏，并触碰罐体感知温度，初步判断罐内真空系统有效性。常备空置液氮罐(装满液氮)以应对突发状况，记录每个液氮罐加注液氮量用来评估液氮损失率，及时更换液氮损失率严重超过预期的液氮罐。八、结语本共识包含人员资质培训、试剂耗材的选择使用、卵母细胞及不同阶段胚胎冷冻和解冻常规操作、质量控制、冷冻保存时限以及冷冻储存室管理等方面内容。人类卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻是辅助生殖技术的重要组成部分，只有不断加强其操作过程的规范、质量控制和管理，同时建立长期有效的质量评价体系，才能确保其安全运行。参考文献中华医学会生殖医学分会第一届实验室学组.人类体外受精胚胎移植实验室操作专家共识(2016)J.生殖医学杂志，2017,26(1):1-8.DOI:10.3969j.issn.1004-3845.2017.01.001.EmbryologistGroup,ChinaSocietyofReproductionMedicine,ChineseMedicalAssociation.ConsensusonhumanIVF-ETlaboratorymanipulations(2016)J.JReprodMed,2017,26(1):1-8.DOI:103969j.issn.1004-3845.2017.01.001.2AlphaScientistsinReproductiveMedicine.TheAlphaconsensusmeetingoncryopreservationkeyperformanceindicatorsandbenchmarks:proceedingsofanexpertmeetingJ.ReprodBiomedOnline,2012,25(2):146-167.DOI:10.1016j.rbmo.2012.05.006.孙青，黄国宁，孙海翔，等.胚胎实验室关键指标质控专家共识J生殖医学杂志，2018,27(9):836-851.DOI:10.3969j.issn.1004-3845.2018.09.003.SunQ,HuangGN,SunHX,etal.CSRMconsensusonkeyindicatorsforqualitycontrolinIVFlaboratoryJ.JReprodMedr2018,27(9):836-851.DOI:10.3969j.issn.1004-3845.2018.09.003.中国医师协会生殖医学专业委员会.人类卵裂期胚胎及宜胚形态学评价中国专家共识J中华生殖与避孕杂志，2022,42(12):1218-1225.DOI:10.3760101441-20220619-00266.ChineseAssociationofReproductiveMedicine.Expertconsensusonhumanembryomorphologicalassessment:cleavage-stageembryosandblastocystsgradingcriteriaJ.ChinJReprodContracep,2022,42(12):1218-1225.DOI:10.3760101441-20220619-00266.5DeIosSantosMJ,ApterS,CoticchioG,etal.RevisedguidelinesforgoodpracticeinIVFlaboratories(2015)J.HumReprod,2016,31(4):685-686.DOI:10.1093humrepdew016.6HughesC.Associationofclinicalembryologists-guidelinesongoodpracticeinclinicalembryologylaboratories2012J.HumFertil(Camb),2012,15(4):174-189.DOI:10.3109/14647273.2012.747891.7PracticeCommitteesoftheAmericanSocietyforReproductiveMedicineandSocietyofReproductiveBiologistsandTechnologists.Areviewofbestpracticesofrapid-coolingvitrificationforoocytesandembryos:acommitteeopinionJ.FertilSteril,2021z115(2):305-310.DOI:10.1016j.fertnstert.2020.11.017.8MontagM,MorbeckD.PrinciplesofIVFLaboratoryPracticeM.Cambridge:CambridgeUniversityPress,2017.9EsfandiariN,GubistaA.Mouseembryoassayforhumaninvitrofertilizationqualitycontrol:afreshlookJ.JAssistReprodGenet,2020,37(5):1123-1127.DOI:10.1007s10815-020-01768-9.10韩倩倩，冯晓明，戴建武，等YYT14342016人类体外辅助生殖技术用医疗器械体外鼠胚试验S.北京：国家食品药品监督管理总局，2016.HanQQ,FengXM,DaiJWfetal.YY/T14342016MedicaldevicesforhumaninVitroassistedreproductivetechnology-invitromouseembryoassayS.Beijing:StateAdministrationforFoodandDrugRegulationofPeople'sRepublicofChina,2016.11EdashigeK.Permeabilityoftheplasmamembranetowaterandcryoprotectantsinmammalianoocytesandembryos:itsrelevancetovitrificationJ.ReprodMedBiOL2017f16(1):36-39.DOI:10.1002rmb2.12007.12ElliottGD,WangS,FullerBJ.Cryoprotectants:areviewoftheactionsandapplicationsofCryoprotectivesolutesthatmodulatecellrecoveryfromultra-lowtemperaturesJ.Cryobiology,2017,76:74-91.DOI:10.1016j.cryobiol.2017.04.004.13ParmegianiLzAccorsiAzBernardiS,etal.Areliableprocedurefordecontaminationbeforethawingofhumanspecimenscryostoredinliquidnitrogen:threewasheswithsterileliquidnitrogen(SLN2)J.FertilSteril,2012,98(4):870-875.DOI:10.1016j.fertnstert.2012.06.028.14PujolA,ZamoraMJ,ObradorsA,etal.Comparisonoftwodifferentoocytevitrificationmethods:aprospective,pairedstudyonthesamegeneticbackgroundandstimulationprotocolJ.HumReprod,2019,34(6):989-997.DOI:10.1093humrepdez045.15PapatheodorouA,VanderzwalmenP,PanagiotidisY,etal.Howdoesclosedsystemvitrificationofhumanoocytesaffecttheclinicaloutcome?Aprospective,observational,cohort,noninferioritytrialinanoocytedonationprogramJ.FertilSteril,2016,106(6):1348-1355.DOI:10.1016j.fertnstert.2016.07.1066.16VajtaG,NagyZP.Areprogrammablefreezersstillneededintheembryolaboratory?ReviewonvitrificationJ.ReprodBiomedOnline,2006,12(6):779-796.DOI:10.1016s1472-6483(10)61091-7.17YoumHS,ChoiJR,OhD,etal.Closedversusopenvitrificationforhumanblastocystcryopreservation:ameta-analysisJ.Cryobiology,2017,77:64-70.DOI:10.1016j.cryobiol.2017.05.006.18PanagiotidisY,VanderzwalmenP,PrapasY,etal.Openversusclosedvitrificationofblastocystsfromanoocyte-donationprogramme:aprospectiverandomizedstudyJ.ReprodBiomedOnline,2013,26(5):470-476.DOI:10.1016j.rbmo.2013.01.016.19DeM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