化妆品毒理学试验方法样品前处理通则、急性吸入毒性试验方法、急性吸入毒性试验急性毒性分类法.docx

附件2化妆品毒理学试验方法样品前处理通则GeneralRuleforPretreatmentofCosmeticinToxicologicalExperiments1范围本规范规定了化妆品毒理学试验样品前处理的基本原则、要求和方法。本规范适用于化妆品原料和产品的毒理学试验检测。2试验目的在毒理学试验开始之前，首先应对样品进行前处理操作，通过样品前处理可以增加受试物与试验体系（包括实验动物、细胞、细菌等）的接触，增加样品吸收率，使样品性状更利于试验操作，保证毒理学试验的科学性和严谨性。3定义3.1前处理指在毒理学试验开始前，对受试样品进行溶解、研磨、混匀、赋形、剂量分组、合理保存等一系列的准备性操作。4前处理的基本原则化妆品原料和产品的前处理方式需要综合考虑样品的理化性质和毒理学试验方案。对于化妆品原料而言，应根据受试物的理化特性和染毒方式确定前处理方法。对于化妆品产品而言，则主要考虑化妆品产品的物理性状和实际应用中的使用方法。化妆品原料和产品的样品前处理均需遵守现用现配原则。5前处理方法根据毒理学试验的要求，需要对样品进行前处理的准备工作。受试物的处理不能改变其原有的毒理学性质。受试物进行不同试验时，应结合毒理学试验项目的染毒方式和受试物的理化性质进行相应的前处理工作。5.1 溶剂的选择化妆品前处理应不改变样品的毒理学性质。当样品需要溶解时，应注意溶剂的选择，以保证样品充分溶解或混悬。样品的前处理稀释倍数应保证最终供试品浓度不低于实际使用浓度。溶剂的选择应充分了解其毒理特性。溶剂应无特殊刺激性或气味，本身应不产生毒性作用，与受试物各成分之间不发生化学反应，且保持其稳定性，如使用其他溶剂应说明理由。体外遗传毒性试验中，所选溶剂必须是非致突变物，且不能影响细胞或细菌存活以及S9的活性。细菌回复突变试验常用溶剂首选无菌蒸储水,其次DMS0、四氢吠喃、丙酮等。细胞试验常用溶剂首选培养液(不含血清)或无菌蒸储水，其次DMS0、丙酮、甘油等；使用有机溶剂时，终浓度应符合具体试验项目的要求，一般而言，DMSO使用终浓度不应大于0.5%,丙酮和甘油使用终浓度不应大于l%o5.2 化妆品原料化妆品原料的前处理方法主要取决于样品的物理形态和染毒方式，具体如下:5.2.1液态(1)准备器材：一次性注射器(2mL5mL),无菌离心管(15mL/50mL),移液枪(0.1L5mL),量筒(IOmL),烧杯，旋涡混匀仪，水相/有机相滤器(0.22m0.45m),溶剂等。(2)取样：根据毒理学试验项目、染毒方式以及样品原液性质计算各剂量组稀释倍数，然后用一次性注射器或移液枪量取相应体积的样品原液，加入适宜溶剂中，并充分混匀。也可应用等比例稀释法。若样品原液为多介质分层液体，应上下摇晃，使其充分混匀后，再做稀释分组。若毒理学试验项目未明确要求剂量分组时，可使用一次性注射器或移液枪直接量取样品原液。(3)储存：将配置好的供试液密封，防止杂质污染，根据样品原液的储存方式选择室温或冷藏暂放或避光。样品配制应适量，遵守现用现配的原则，防止样品在储存过程中发生变质或变性。5.2.2 固态(1)准备器材：研钵，电子天平，称量纸，称量勺，量筒(IOmL),烧杯，无菌离心管(15mL50mL),旋涡混匀仪，水相侑机相滤器(0.22m0.45m),移液枪(0.1L-5mL),溶剂等。(2)取样：首先根据样品物理性状，考虑是否需要研磨，若样品原样为细粉状，则无需研磨；否则，应先使用研钵，将块状、膏状等固体性状，充分研磨成细粉状或糊状。然后根据毒理学试验项目、染毒方式以及样品原样性质计算各剂量组浓度，用电子天平称量相应重量的样品，加入适宜溶剂中，并充分混匀。若毒理学试验项目未明确要求分剂量组时，可直接用电子天平称量相应重量的样品；如果试验项目为经皮染毒时，可考虑用最小体积的溶剂将样品湿化成无散落粉末且无多余溶剂的状态，或在正式试验时，先湿化皮肤。(3)储存：将配置好的供试液密封，防止杂质污染，根据样品原样的储存方式选择干燥通风的环境，室温或冷藏暂放或避光。样品配制应适量，遵守现用现配的原则，防止样品在储存过程中发生潮化或变质。5.2.3 难溶样品难以溶解于无机溶剂或有机溶剂的难溶样品，常见处理方法有（1）使用样品浸提液。根据样品理化性质选择适宜浸提介质、浸提比例、浸提温度、浸提时间和浸提方法，并提供相应说明。样品浸提液应对皮肤无毒副作用。（2）加入悬浮剂或赋形剂，使样品悬浮其中，形成分布均匀的悬浮混合物。悬浮剂或赋形剂应对皮肤无毒副作用、无色无味，且稳定性高。常见的悬浮剂及赋形剂有：玉米油、淀粉、明胶等。5.3 化妆品产品化妆品产品进行毒理学试验的前处理工作时，主要根据化妆品产品剂型分类处理，此外，还需要考虑化妆品的实际使用方法等因素。5.3.2 液体剂型化妆品产品化妆品中的液体剂型（露、液、水、油、油水分离等），除膏、霜、蜜、脂以外的膏霜乳剂型（乳、乳液、奶、奶液等）、凝胶剂型（睹喔、胶等）等流动性的化妆品产品均可参照5.2.1处理。乳化类的液体产品稀释时，需根据产品特征选择脂溶性或水溶性溶剂。5.3.3 固体剂型化妆品产品化妆品中膏霜乳类中的膏体、霜类、蜜、脂，以及粉剂剂型（散粉、颗粒等），块状剂型（块状粉、大块固体等），泥状剂型（泥状固体等），蜡基剂型（以蜡为主要基料的产品）等固体化妆品产品的前处理方式可参照5.2.2处理。5.3.4 敷贴类化妆品产品化妆品中贴、膜、含基材剂型（贴、膜、含配合化妆品使用的基材类）的化妆品产品前处理方法如下：（1）准备器材：取剪刀，一次性注射器（2mL-5mL）,移液枪（0.1L-5mL）,量筒（IOmL）,溶剂等。（2）取样：根据毒理学试验项目和产品的使用方式，如若经皮接触，先用剪刀将样品裁剪成适宜的形状（如2.5X2.5Cm的方块），比如含基质材料的面膜类；当原产品形状不足尺寸时，可叠加多个直到满足形状要求，比如痘痘贴类;如若经眼睛接触，可将样品液从产品袋中挤出，然后按照5.2.1处理。（3）储存：将配置好的供试液密封，防止杂质污染，根据样品的储存方式选择室温或冷藏暂放或避光。534按配比使用的化妆品产品染发剂等按比例配制使用的化妆品，其前处理工作应与产品实际使用方法保持一致，具体如下：（1）准备器材：一次性注射器（2mL-5mL）,移液枪（0.1L-5mL）,量筒（10mL）,电子天平，旋涡混匀仪等。（2）取样：根据化妆品产品的使用说明，用电子天平或一次性注射器或移液枪定量取相应质量的各组分样品，然后充分均匀。（3）储存：将配置好的供试液密封，防止杂质污染，根据样品的储存方式选择室温或冷藏暂放或避光。此类化妆品产品应严格遵守现用现配原则。5.3.5 气雾剂剂型及喷雾剂剂型化妆品产品化妆品中气雾剂剂型（含推进剂）及喷雾剂剂型的化妆品前处理如下：（1）准备器材：烧杯，一次性注射器（2mL5mL）,移液枪（0.1L-5mL）等。（2）取样：一般情况下，首先将样品喷至烧杯容器中，收集其液体，再按照5.2.1处理。若样品因为蒸发而无法收集时，可模拟产品的实际使用方法，直接将产品在受试动物正前方IOCm处喷射，此距离可根据喷雾压力及内容物做出适度调整。（3）储存：将配置好的供试液密封，防止杂质污染或挥发，根据样品原液的储存方式选择室温或冷藏暂放或避光。5.3.6 具有特殊使用方法的化妆品产品若产品备注有特殊使用方法，如需要加热、溶解等操作，如冻干粉、浴盐等，应在前处理时，按照样品的实际使用方法，尽可能保持受试物在实际使用中的形态。此类化妆品产品的配制应注意现用现配的原则。5.4 其他化妆品原料和产品为其他特殊性状时，应综合考虑受试物理化特性和人群接触特征，选择不影响受试物毒理学特性的前处理方式。6注意事项经皮染毒时，溶剂应另外注意不影响受试物穿透皮肤，保证受试物与皮肤有良好接触，常用的介质有蒸储水、羊毛脂、凡士林。经口染毒时，受试物均应溶解于适宜的溶剂中，在选择溶剂时应不高于经口染毒液体的最大容量，啮齿类动物所给液体容量一般为ImL100g,水溶液可至2mL100go通过调整受试物溶液浓度使各剂量组经口染毒的容量一致。吸入染毒时，受试物须在空气中保持一定浓度，必要时可加入适当的赋形剂。赋形剂本身应无毒性，不与受试物反应且不影响受试物的吸收。在体外试验中，需要注意无菌条件，化妆品原料和产品的酸碱度不能影响细胞或细菌的正常生长，若化妆品原料和产品为强酸强碱（pHW2或PHNIL5）,可不再做皮肤刺激性/腐蚀性试验和急性眼刺激性/腐蚀性试验。附件3急性吸入毒性试验方法AcuteInhalationToxicityStudy1范围本规范规定了动物急性吸入毒性试验的基本原则、要求和方法。本规范适用于化妆品单一成分的原料安全性毒理学检测。2试验目的急性吸入毒性试验可评价化妆品原料能否被直接吸入或者通过其他途径进入呼吸道所产生的毒性反应，可对受试物进行毒性分级，为亚急性毒性和其他毒理学研究中染毒浓度选择提供依据。3定义3.1 急性吸入毒性acuteinhalationtoxicity实验动物短时间(24h内)持续吸入一种可吸入性受试物后，在短期内出现的健康损害效应。3.2 半数致死浓度(LCso)medianlethalconcentration在一定时间内经呼吸道吸入受试物后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量，以单位体积空气中受试物的质量(mg?)来表示。3.3 空气动力学直径aerodynamicequivalentdiameter(AD)气溶胶颗粒与不同直径标准单位密度(1.0gcm3)球形颗粒中某一颗粒的终端沉降速度相同时，该标准球形颗粒的直径即为空气动力学直径。其计量单位为m°3.4 质量中值空气动力学直径massmedianaerodynamicdiameter(MMAD)气溶胶中小于和等于某一空气动力学直径的颗粒总质量，占全部颗粒物质量50%时，该直径即为空气动力学质量中位数直径。3.5 几何标准差geometricstandarddeviation(GSD)用以描述气溶胶颗粒大小的分布状态。以撞击器各级累积百分比为Y轴、粒径为X轴拟合对数概率曲线，以累积百分比84.1%对应的粒径除以累积百分比50%的粒径，即为几何标准差。4试验的基本原则受试物通过吸入暴露装置制备成不同浓度的样品，各试验组动物在一定时间内吸入不同浓度的受试物，暴露浓度的选择可通过预试验确定，吸入暴露后观察动物的毒性反应和死亡情况，试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时存活的动物要处死进行大体解剖。5试验方法5.1 受试物试验前受试物的有用信息包括：受试物的特性（如纯度），化学结构和理化性质；任何体外或者体内性试验结果：预期用途和人体暴露的可能性；得到的结构类似物的构效关系数据和毒理数据，在研究中，尽可能使用一组受试物，而且其样本应该在能保持其纯度、稳定性的条件下保存。受试物的准备：可对受试物进行适当处理，使其达到适当浓度和粒径。如果是颗粒材料可经过机械加工，以达到所需的粒度分布，但不要分解或者改变供试品，如果在机械过程中已经被认为改变了物品组分时,应对受试物成分进行验证,验证如果不产生可吸入颗粒，则不需要进行吸入毒性试验，否则应进行吸入毒性试验。5.2 实验动物和饲养环境常规选择啮齿类动物，首选大鼠，一般选用872周龄的大鼠，使用雌性动物应是未孕和未曾产仔的。如需使用其他品系需说明理由。试验开始时动物体重的差异应不超过平均体重的±20%。试验前动物要在实验动物房环境中至少适应35d时间。染毒前，动物应提前适应口鼻暴露时所用的固定器，以减少进入新环境引起的不适。实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用标准配合饲料，饮水不限制。5.3 染毒浓度在试验开始前，通常要进行预试验，为主试验的浓度选择提供帮助，受试物已知或预期有毒则进行限度试验。用全球化学品统一分类和标签系统（GHS）的分类系统，气体、蒸气、溶胶的限定浓度分别为20000PPm、20mgL和5mgLo传统LC50试验至少设置3个不同浓度的染毒组，每组动物一般为10只，雌雄各半。各剂量组间距大小以兼顾产生毒性大小和死亡为宜，通常以较大组距和较少量动物进行预试，以便能在各浓度组的试验动物中发生一定程度毒效应和死亡。所得资料应足以绘制出浓度一死亡曲线，并在可能情况下求出LCso值。5.4 暴露方式根据受试物的性质和试验目的来选择吸入染毒方式，首选的暴露方式为口鼻式暴露，特别是在研究液体或固体气溶胶或者可凝结成为气溶胶的蒸气时。对于特殊的研究目的，也可采用全身暴露染毒装置以更好地满足研究需求，但应在试验报告中予以阐释说明。采用全身暴露染毒时应保证染毒柜中气流的稳定性，试验动物的总体积不能超过染毒柜容积的5%o5.5 暴露条件口鼻式暴露时间推荐为4h,暴露期间应禁食，在全身暴露时可以提供水。如果需更长时间的研究，应提供理由。5.6 方法5.6.1 传统的LC50法在传统法中，暴露时间为4h。动物暴露在一个限定浓度（限度试验），或在至少3个不同的浓度下（主试验）。除已知受试物信息外，在开展主试验前,需要进行预试验。预试验：预试验可用来估计受试物的毒性效应，确定易感性的性别差异，并为限度试验或主试验的浓度选择提供帮助。在选择预试验的浓度水平时，应该充分使用所有可得的信息，比如现有的定量一构效关系（Q）SAR数据和类似化学品的数据。试验中，每个浓度水平的每种性别的试验动物不超过3只，通常只有一个浓度水平。已经进行过的急性吸入毒性试验一急性毒性分类法研究可以用来替代预试验。限度试验：当受试物已知或预期基本无毒时，可采用限度试验。受试物的毒性作用信息，可以来源于已测试过的类似化合物或混合物或产品的特性和具有毒理意义的组成成分。在限度试验中，雌雄各3只动物暴露在限定浓度中。如果在限定浓度发现动物死亡或濒死，则限度试验的结果可作为其他浓度试验（如主试验）的预试验。如果受试物的理化性质决定其不可能达到限定浓度，则需测试其最大可及浓度。如果最大可及浓度的死亡率小于50%,则不需进行进一步试验。主试验：进行主试验时，一般每个浓度组有10只动物，雌雄各半（或5只易感性别的动物），且至少有3个浓度水平。必须有足够多的浓度水平足以绘制出浓度死亡曲线，并在可能情况下求出LC50各暴露组之间的时间间隔取决于中毒体征的出现、持续时间与严重程度。是否需要对下浓度水平进行试验，取决于先前的试验动物是否能够成活。5.6.2 浓度一时间法浓度一时间法是传统LC50法的另一种替代方法。这种方法使试验动物暴露在不同浓度的受试物水平，而且暴露时间也不同。所有的试验都采用口鼻部吸入的方法。与传统法相比，浓度一时间法得到的LCOl与LGoo的值更加稳定。当在4个浓度水平和5种暴露持续时间的主试验采用浓度一时间法时，每个浓度一时间间隔只需使用2只动物（雌雄各半或易受影响的单一性别）。在某些情况下,在每浓度一时间间隔，可以选择两种性别的动物各2只，这能减少参数估计的误差和变异性，增加成功率，提高置信区间的覆盖范围。当用来参数估计的数据拟合不好时，可能需要第5个浓度水平。预试验：预试验一般用各性别、各浓度3只动物，它可以为主试验选择1个合适的初始浓度和最大化减少动物使用。暴露时间为4h。如果能从急性吸入毒性试验一急性毒性分类法中得到死亡数据，那么可以不进行预试验。在选择研究中的初始目标浓度时，应该考虑在急性吸入毒性试验一急性毒性分类法中观察到的各性别和各个浓度的死亡率。主试验：初始浓度（第一步暴露）可能是限定浓度，也可根据预试验选择浓度。每组雌雄各1只动物暴露于此浓度下，持续时间不同（如15、30、60、120、240min）,总共用到10只动物。限定浓度可根据监管要求选择，气体、蒸气、气溶胶的限定浓度分别为20000PPm、20mg/L5mg/L（或为最大可及浓度），如果在第一步暴露中发现死亡，则引起死亡的最小暴露浓度将为下一步试验的浓度建立提供指导，每一个后续的试验都将取决于先前的试验结果。当供试品物理或化学性质无法达到极限浓度时，应测试可达到的最大浓度。如果在可达到的最大浓度下，致死率低于50%,则不需要进行下一步的测试，如果不能达到极限浓度,研究报告应提供说明和数据支持，如果可达到的最大蒸汽浓度不会引起毒性,则可能需要将供试品作为液体气溶胶产生。对于很多受试物，如果暴露时间间隔适当，在初始浓度得到的结果与在其他3个浓度组得到的结果，就能足以绘制浓度一时间一死亡曲线。5.7 暴露条件的监测5.7.1 浓度监测试验期间为保证实际浓度的稳定性，可以使用实时监测设备（如气溶胶光度计），或定期通过特异性的方法（如采用撞击器吸附或化学反应的原理直接采样，然后进行化学分析），或非特异性的方法如滤膜采样法来测定呼吸区或染毒柜内气溶胶浓度，以保证暴露条件的稳定性。对于气体和蒸汽，单个腔室浓度样品的平均浓度不得超过±10%,对于液体或固体气溶胶，平均浓度不应超过±20%,应计算和记录腔室的平衡时间（t95）。5.7.2 粒径监测在发生系统中，应进行粒度分析，以确保气溶胶浓度的稳定性。推荐可吸入质量中值空气动力学直径（MMAD）应该在14m,几何标准差（）在1.53.0。在染毒期间，需经常进行粒度分析，以测定粒度分布的一致性。如达不到要求,应说明理由。气溶胶粒径的测定需在染毒4小时内至少采样2次，可采用级联撞击采样器或其他设备如气体动力学粒径仪等，粒径分析所得质量浓度应处于由滤膜分析法所得质量浓度的合理的限度范围内。5.7.3 暴露系统内环境监测染毒装置内气流：染毒装置应配备动态气流，口鼻吸入染毒过程中应使装置内保持轻度负压，全身暴露装置染毒柜内应密闭，以防止受试物泄露到外部环境中。暴露期间尽可能连续监测并每小时记录1次，在暴露系统中，氧气浓度应至少为19%,二氧化碳浓度不得超过1%,如果达不到要求，应定期监测氧气和二氧化碳浓度。染毒装置内温度保持在22±3I,口鼻暴露和全身暴露都需监测记录动物呼吸区的相对湿度，试验期间应至少监测和记录三次，较短时间内每半小时测一次。理想的相对湿度一般在30%70%,但在某些情况下，可能无法达到（例如在测试水溶液型受试物时），应在试验报告中予以阐释说明。5.8 临床观察在暴露刚开始当天至少进行两次临床观察，或者根据动物反应，进行更频繁观察。观察期限最少为14d,以后每天至少进行一次观察。中毒体征出现和消失的时间都十分重要，特别是在有中毒体征延迟趋势时。动物濒死、疼痛剧烈与严重且持久的痛苦皆应予以安乐死。当动物被安乐死，或者发现死亡时，应该尽可能准确记录死亡时间。所有的观察应该被系统地记录，每个动物应该保持单独记录。观察内容应该包括皮毛，眼睛和黏膜，呼吸，循环，自主和中枢神经系统,肢体活动和行为的改变。应该记录可能的局部和全身反应的差别。要注意有无震颤、惊厥、流涎、腹泻、昏睡、睡眠和昏迷症状。测试直肠温度可为出现反射性呼吸迟缓、C纤维刺激反射或与给药方式或封闭相关的低温/高热情况提供佐证。每只动物体重应该在暴露前一天到暴露（day）,并且至少在第1天、第3天和第7天（以及此后每周），以及在第1天后的死亡或安乐死时进行记录。若动物体重出现20%的持续递减，应该进行密切监测。在暴露结束后，应测量存活动物的体重，并实施安乐死。5.9 病理检查5.10 所有实验的动物，包括在实验中死亡的，或者出于动物福利原因被安乐死以及从试验中撤离的，应该进行大体解剖。如果动物被发现死亡后，应尽可能快地进行尸体解剖，通常在l2d内，如不能被立即进行尸体解剖，动物应该被冷藏，以尽量减少自溶。记录每个动物的大体病理变化,并特别注意呼吸道改变。其他附加检查可为研究提供更为深入的解释价值,例如测量存活大鼠肺的重量，和/或提供呼吸道刺激性的显微镜检查证据，对死亡和存活24h及24h以上的动物中存在大体病理改变的器官进行组织病理学检查。如受试物对水有反应（如酸和吸湿性受试物），可开展整个呼吸道的显微镜检查。5.11 1.C50的计算一般可采用多种方法测定LCso,建议采用一次最大限度试验法、霍恩氏法、概率单位一对数图解法和寇氏法等。5.12 试验结果评价5.12.1 结果处理应该提供每只动物的体重和尸检发现的数据。临床观察数据应该以表格的形式呈现，统计出各实验组使用的动物的数量，出现特殊中毒特征的动物数量，实验中死亡或者人道处死的动物数量，动物个体的死亡时间，毒副作用的描述和时间进程，可逆体征以及尸检发现。5.12.2 结果评价评价试验结果时，应将LCso与观察到的毒性效应和尸检结果相结合考虑，LCso值是受试物急性毒性分级及判定受试物经呼吸道吸入后引起动物死亡可能性大小的依据，引用LC50值时一定要注明所用实验动物的种属、性别、暴露方式及时间长短、观察期限等。评价应包括受试物吸入暴露剂量与动物异常表现（包括行为和临床改变、大体损伤、体重变化、致死效应及其他毒性作用）的发生率和严重程度之间的关系。毒性分级见表K表1吸入毒性分级分级气体（PPm）蒸气（mgL,4h）粉尘和雾（mgL,4第1类LC5o1OOLC5oO.5LC5oO.O5第2类1OO<LC5o5OOO.5<LC5o2.OO.O5<LC5oO.5第3类5OO<LC5o25OO2.O<LC5o1O0.5VLCsoW1.0第4类25OO<LC5o2OOOO1O<LC5o2O1.O<LC5o5第5类>20000>20>5注：分类标准引用全球化学品统一分类和标签制度（GHS）o第5类的标准旨在识别急毒性危险相对较低，但在某些环境下可能对易受害人群造成危险的物质,这些物质的LC50范围预计值分别为：气体大于20000ppm,蒸气大于20mgL,粉尘和雾大于5mgL,如果现有的可靠证据表明LC50在第5类的数值范围内，或者其他动物研究或人类毒性效应表明对人类健康有急性影响，那么物质划入此类别。为保护动物，不应在第5类范围内对动物进行试验，只有在这样的试验结果与保护人类健康直接相关的可能性非常大时，才应考虑进行这样的试验。6试验结果的解释急性吸入毒性试验研究和LCso的测定，可评价受试物的急性吸入毒性及其毒性等级,其结果外推到人类的有效性很有限。附件4急性吸入毒性试验急性毒性分类法AcuteInhalationToxicity-AcuteToxicClassMethod1范围本试验方法规定了急性吸入毒性试验急性毒性分类法的试验原则、试验方法、数据和报告。本试验方法适用于化妆品原料急性吸入毒性的急性毒性分类。本试验方法适用于单一成分的化妆品原料，非单一成分的原料若使用本方法进行评价，需要提供更多的科学依据说明其可行性。本试验方法不适用于测试某些特殊的材料，如难溶的等轴状(isometric)或纤维状(fibrous)材料、或人造纳米材料(manufacturednanomaterials)。2试验目的本试验方法的目的是通过测试获得受试物的健康危害信息等资料，从而可参考联合国全球化学品分类和标签管理协调制度(theUnitedNations(UN)GloballyHarmonizedSystem(GHS)ofClassificationandLabellingofChemicals)的化学品急性毒性分类标准对其急性毒性进行分类。3定义3.1 急性吸入毒性分类法按照一定的连续试验步骤和相应的浓度进行测试，从而获得受试物的毒性分类和半数致死浓度(LC50,LethaIConCentration50%)估测范围的试验方法。3.2 计算浓度nominalconcentration使用受试物的量除以通过染毒系统空气的总体积所得到的浓度。3.3 实际浓度actualconcentration在吸入式染毒柜中动物呼吸道中的受试物浓度，可通过特异性(如直接采样、吸附或化学反应等方法进行采样、分析)或非特异性(如滤膜增重法)等方法进行测试分析。4试验原则本试验采用分步试验的方法，观察试验动物暴露4h的反应，从而得到满足对受试物急性吸入毒性等级进行分类的信息。为了特殊的监管目的也可采用其他暴露时限（不是4h）的试验。每步试验使用每种性别3只动物，在确定的浓度下进行吸入暴露试验。根据动物死亡和/或濒死状态，有时只进行2步试验操作就可以对受试物的急性吸入毒性类别做出判断。如果有证据表明某种性别的动物比另外一种动物的敏感性要高时，可以只使用敏感性别动物进行试验。前面一步操作的试验结果决定着下一步试验操作：a）无需进行下一步试验；b）每性别3只动物；或c）只使用6只敏感性别的动物。方法是每个试验浓度组使用6只敏感性别的动物，性别不限，以估测的毒性类别界限范围数值中较低的浓度来进行试验。对濒临死亡的、处于难以忍受疼痛的或严重持久痛苦的动物,应人道地处死。人道处死的试验动物，在结果统计时应与试验中死亡的动物一并对待。5试验方法5.1 方法描述5.1.1 动物种属的选择应使用健康年轻、实验室中常用的种属动物进行试验。首选大鼠，如使用其他动物应进行论证，说明理由和依据。5.1.2 动物的准备雌性动物应是未经产的、未妊娠。要保证每步试验暴露时的鼠龄在8W12W；试验开始时动物体重的差异应不超过平均体重的±20%。采用随机选择原则，并对每只动物做出标记。在进行试验之前至少要在笼内饲养5d以适应实验室饲养条件。试验前还需在试验设备中进行短期的适应训练，以减少因为进入新的设备环境造成的应激反应。5.1.3 饲养条件实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。选用标准配合饲料，饮水不限制。实验动物暴露前后按性别、浓度分笼饲养，但是每笼动物的数量不能妨碍对每只实验动物的观察，并应减少由于同种相残和相互撕咬而造成实验动物信息的丢失。以口鼻式装置暴露时，需将动物放入固定管内使其适应固定管的环境。固定管不能过度的增加动物体力、热量和活动的负荷。动物的限制固定可能影响动物的体温（过热）和/或每分钟动物呼吸量。如果有资料表明这些改变没有达到可感觉到的程度，就不一定需要预先在固定管内进行适应操作。全身暴露气溶胶的动物在暴露期间需各自相隔互不接触，防止柜体内动物的相互趴卧造成被毛对气溶胶的过滤作用。除暴露期间外（暴露期间禁食），给予实验动物常规检验合格的饲料，自由饮水。采用人工照明，每12h明暗交替。5.1.4 吸入染毒装置要根据受试物的性质和试验目的来选择吸入染毒方式。首选的染毒方式是口鼻式（nose-only）暴露（其中包括仅头部暴露、鼻部暴露或口鼻部暴露三种染毒模式）。当受试物是液体、固态气溶胶和能产生气溶胶的蒸气时，首选口鼻式暴露方式。对于特殊的研究目的，也可采用全身暴露（WhOIe-body）的染毒方式以更好地满足研究需求，但应在试验报告中予以阐释说明。为了保证全身染毒时柜体内空气中受试物的稳定性，实验动物的总体积不应超过染毒柜总容积的5%o5.2 暴露条件5.2.1 染毒浓度5.2.1.1 推荐暴露吸入时间为4h,但需除去达到浓度稳定平衡所需时间。根据特殊试验需要也可采用其他的暴露时限，但是需在试验报告中给予说明。全身暴露时动物应各自隔离互不接触，防止染毒柜内其他动物的理毛行为造成经口摄入受试物。吸入暴露期间需要禁食。全身暴露时可提供饮水。5.2.1.2 动物吸入暴露的受试物是气体、蒸气、气溶胶或是它们的混合物。试验时将受试物制备成何种物态，取决于受试物的理化性质、设定的浓度，和/或在实际加工应用中最有可能使用的物理状态等。具有吸湿性的和会发生化学反应的受试物在试验中需保证吸入的空气是干燥的。需注意避免使用发生爆炸的浓度进行试验。5.2.2 颗粒粒径的分布对所有的气溶胶和可能形成气溶胶的蒸气都需测定颗粒粒径的大小。为了使整个呼吸道都能暴露受试物，推荐的气溶胶颗粒的质量中值空气动力学直径（MassMedianAerodynamicDiameter,MMAD）为1m4m,其几何标准差为1.53.0。需尽可能达到此标准，如技术上无法满足要求时需由专家做出评判。例如，金属烟尘比本标准的粒径要小，但是带电的粒子、纤维和吸湿性受试物（在呼吸道潮湿环境下其粒径增加）可超过这个标准。5.2.3 溶媒选择与受试物的配制为了制备具有合适浓度和粒径大小的受试物，需要使用载体溶媒，作为一条规定，水是首选的载体溶媒。颗粒物需要机械加工达到要求的粒径大小，但要注意加工中是否引起受试物的分解和变性。如机械加工改变了受试物的组成成分（如由于过度研磨、摩擦产生高温），受试物的组成要经过检测分析进行确认。需注意不要污染受试物。对不能形成可吸入性的、不易成为粉末的颗粒材料不需要进行试验。磨损试验是用来证明加工这些材料时会不会产生呼吸性颗粒物。如果经磨损试验证实可产生呼吸性颗粒物，则该材料应当进行吸入毒性试验。5.2.4 对照组不需要设立平行阴性（空气）对照。即使制备试验气体的载体溶媒不是水,也只有在没有载体溶媒历史数据的情况下才设立溶媒对照组。如果所用溶媒制备的受试物没有引起毒性,至少说明在该受试物浓度的条件下，溶媒是没有毒性的,所以不需要设立溶媒对照组。5.3 暴露条件的监测5.3.1 染毒装置内气流通过染毒柜（装置）的气流速率需严格控制，可连续在线监测记录或每次暴露期间至少每小时监测记录一次。试验所用空气中受试物浓度（或其稳定性）的监测数据是对染毒系统中各个动力学参数作用的综合结果，因此这些数据可提供控制制备动态空气设备相关参数的间接方法。在口鼻式染毒时通过染毒系统的试验气体的气流动力不足时，需注意动物的在染毒装置内发生重复吸入。已有确定在所选定的操作条件下不会发生重复吸入的方法。氧气的浓度至少为19%；二氧化碳的浓度不超过1%。如果证实确实不能达到这个标准，需要测定并记录试验空气中氧气和二氧化碳的浓度。5.3.2 染毒装置柜内温度和相对湿度染毒柜内温度维持在22±3口鼻式暴露和全身暴露都需监测记录动物呼吸带的相对湿度，在吸入染毒的4h之内至少3次；吸入染毒暴露期限较短的试验可以每小时监测记录1次。理想的相对湿度需维持在30%70%；但是有时很难达到（如受试物以水配制），或者受试物与测定方法发生干扰而难以测定。5.3.3受试物53.3.1计算浓度无论何时都应尽量记录并计算染毒柜空气中受试物的计算浓度。计算浓度是指制备产生的受试物的量除以通过染毒系统的空气总体积得到的参数。虽然计算浓度不是用来描述动物暴露特征，但是可通过计算浓度与实际浓度进行比较可以得到试验系统制备效率的指征，从而可发现制备染毒空气过程中存在的问题。5.33.2实际浓度1.1.1 2.1实际浓度是吸入染毒柜内动物呼吸道中的受试物的浓度，可以通过特异性的方法（如采用吸附或化学反应的原理直接采样，然后进行分析）；或是通过非特异性的方法（如滤膜增重法）来获得。单一成分的粉末、低挥发性液体的气溶胶才能使用增重法，同时还需要专门预试验数据的支持。对多成分的粉末气溶胶也可以用增重分析法测量，但是这需要证实所制备的空气与最初受试物的组成成分相似。如果没有此类数据资料，则需在试验期间按照规定的时间间隔对制备产生的空气进行再分析（理想的是染毒柜中的空气）。对可挥发的或易升华的气溶胶，需证实所用方法能收集到所有物相的受试物。需在试验报告中报告靶浓度（目标浓度）、计算浓度和实际浓度，但只有实际浓度可用来计算致死浓度值。1.1.322 应使用同一批试验受试物。技术可行时尽可能将试验样品保存在能维持纯度、均匀性和稳定性的条件下。开始试验前对受试物的特征有充分的了解和描述，如纯度、鉴别特征和鉴定出来的污染物和杂质。这可用以下参数来证实，如保留时间、相对峰面积和通过质谱、气相色谱或其他的检测方法得到的分子量，包括且不限于以上内容。虽然受试物样品的特征鉴别不是实验室的责任，实验室还是需要对委托方提供的受试物进行必要的简单有限的描述（如颜色、物理状态等）。1.1.323 需尽可能的保持染毒空气成分稳定，可采用适当的分析方法连续或间隔采样监测。间隔采样时，吸入染毒4h的试验至少采样2次。如果由于系统内染毒空气流量过低所限，或染毒浓度太低需采集较多的空气样本时而不能完全满足连续或间隔采样量的要求，可在整个暴露期内只采集一个样本。如果样本与样本之间出现明显波动，进行下一个浓度试验时需在暴露期间采集4个样本进行分析。染毒空气各个样本之间的浓度波动范围应符合规定，气体和挥发性受试物浓度范围不得超过平均浓度±10%,液体或固体气溶胶浓度范围不得超过平均值±20%。并需要计算柜内空气受试物达到平衡时的时间（T95）o一个暴露周期内需要考虑到制备受试物空气的时间和达到T95的时间。对组成非常复杂混合物的蒸气/气体、气溶胶（如推动终端装置设备产生的燃烧空气和试验物形成的）在染毒柜内空气中每一相成分物相各不相同，至少要选择一个标志性物质来进行分析，通常是受试制备物中处在某一物相（蒸气/气体或气溶胶）的主要的活性物质。如果试验物质是制剂（商品形式的产品）分析报告的浓度应是制剂的总浓度，不是活性成分的或某成分的浓度。5.333 颗粒物粒径的分布气溶胶的粒径大小需在染毒的4h期间至少测定2次，方法是使用级联撞击采样器或其他替代的设备如空气动力学粒径仪等。如果级联撞击时采样器与替代的测定方法所得到的结果相同，在整个试验期间的就可以使用替代的方法进行监测。如采用滤膜增重或尘埃测定器/气体发泡收集管等第二种设备检测，则需要与基础检测设备进行平行试验，以验证基础检测设备的收集效率。粒径大小分析得到的质量浓度应与采用滤膜分析法得到的质量浓度在一个合理的限度之内。如果在试验开始阶段就证明两种试验方法的质量浓度相同，就可以免去验证性试验。从动物福利方面考虑，需采取措施减少无确定结果的数据资料，因为这会要求重复进行暴露试验。如果空气中的蒸气受试物能发生凝结而形成气溶胶，或者染毒蒸气空气中测定到颗粒物也就是暴露空气存在潜在的混合相，则需对这种受试物进行粒径的测定。5.334 步骤5.334.1 正式试验（mainIesi）5.334.1.1 步使用雌雄各3只动物，或6只敏感性别的动物。如果采用口鼻式暴露方式时使用的啮齿类动物不是大鼠，则需要调整最长的暴露时间以减少动物种属之间的负荷的差异。可从4个固定的起始浓度水平染毒，这个浓度应能引起染毒动物中的某些动物出现毒性作用。气体、蒸气和气溶胶的试验步骤图（见7试验步骤流程图）的浓度水平是GHS第1类7类的分类标准的界限值：气体为（IoOPPm/4h、500ppm/4h2500ppm/420000ppm/4h）（见图1）；蒸气为（0.5mgL4h2mgL4h>IOmg/L/4h、20mgL4h）（见图2）；气溶胶为（0.05mg/L/4h、0.5mg/L/4h1mg/L/4h>5mg/L/4h）（见图3）。高于各相应物态类别的上限浓度就归为第5类。按照各自的试验图表来确定起始浓度。根据人道处死和动物试验死亡的数量，按照图中的指示的箭头来决定下一步的试验，直到能对受试物作出毒性分类时结束试验。5.334.1.2 下一个暴露浓度组试验的时间间隔长短要根据毒性体征的发作时间、持续时间和严重程度来决定。决定进行暴露下一个浓度水平需要直到前一个浓度水平的动物存活状态完全确定下来后再进行。建议的每个浓度水平之间的时间间隔为3d至