细胞外ATP对U87胶质瘤细胞生长和侵袭的作用研究.docx

细胞外ATP对U87胶质瘤细胞生长和侵袭的作用研究王晖,谒华.陈世南.赵明月,李怦.季飞(400038.重庆.笫三军医大学西南医院神经外科,全军神经系统疾病微创诊治专科中心，全军神经外科神经创伤防治重点实验室)IMX1.目的，观察细胞外.三礴酸腺甘(aden。SineTriph。SPhaeATP)对体外培养的U87人脑胶质掩细胞增柏、侵袭和迁移能力的影响，方法1来用MTT法检测不同浓度细胞外ATP对U87胶质痛细胞塔宛的影响：以相同条件|<不加ArP作为对照组，以加入100moV1.ArP作为处理1,采用Transwe1.1.细胞侵袭实验检测100moV1.细胞外ATP对U87咬质痛细胞侵袭能力的影响：用时间显微镜动态观察100mo1.'1.的ATP作用下U87胶质痛细胞的迁移情况结果,总浓度(5000moU1.)细胞外ATP对U87股质桶细胞增殖有显著抑制作用,较低浓度(50、100、5mok1.)细胞外ATP对U87胶质痛细胞增殖无明显影响.5000mo1.1.ATP组与其他浓度组比较，差异有统计学意义(P<005>:TanSWCu侵袭实验中，处理乳细胞障膜细胞数为(16383±I7.81)明显多于对照组(89.83±I3.27><P<0.01.):迁移实验中，处理组细胞运动速度为(163.83±17.81.)HmM,对照组细胞运动速度为(89.83±13.27)m'h,2组比较，差异有统计学意义(PVOQ5),结论I1.oOMmoI/1.的细胞外TP对体外培养的U87胶质痛细胞的侵袭和迁移具有明显促迸作用.I关健词IATP：胶质疑：侵袭；迁移EffectsofExtrace1.1.u1.arAdeiK)SineadenosineTriDho5DhutetriphosphateimprovesOft-GgrowthandInVttS沁OimraSiOnOfU87Giome1.iomaGece1.1.sitF8VVangHui9EengHua9ChengTunan,ZhaoVingyue,1.iBo,1.iFeiDcpanmcniofNCUrUrg沁cry,gpRmeMZSouthwestHospita1.ThirdMi1.itaryMedica1.University,Chongqing,400038,China)AbstractObjectivesToIheeffect*ofextrace1.1.u1.araAdensineTriphosphate(ATP)onUK_growthandinvasionofU87g1.iomace1.1.、加丫八，,MethOdSCeH8uni唯ki1.8WaSUsedIQde1.ectIheMRiRrnIiQnMU87ce1.1.、UnCI1.hCIrVuImCn1.带格式的：7:体：帧斜力辰Mnapru1.ifeH1.ion/i1.hATPa1.differentconcentrationof0,50,100,200,500and5000Htto1.''1.ATRInvasionandmiura1.ionAb2ofU87g1.ima-cci1.siit疝mRndm里同icnWith100-mo1.,1.ATPIreHImcntWCreexaminedbyTranswci1.andTimemicroscopye.Resu1.tsThepro1.iferationofU87g1.iomawasinhibitedobvious1.ybyhighconcentrationofATP(5_(XX)moV1.).However.Theie-there,wasnosignificantimpactonIhCPrOIifCnHioninU87gMetm-ccI1.spRU4emkft-bya1.oweramountofextrace1.1.u1.arATP(5(-x.I(Xh-and500n>1.1.).Theinvasionandmigrationabi1.ityofU87ghemt-cc1.1.sweresignificant1.yenhancedbytheusingof100moV1.ATP.带格式的3字体：小五.I1.加粗 帝格式的：字体：非加粗常格式的：字体：非加粗Conc1.usions:Extrace1.1.u1.arATPcansignificant1.yenhancetheabi1.ityofinvasionandmigrationefinU87g1.k¼)Mt-ce1.1.s-¼-¼wo.Keywordswd5Zwichzhug钮G1.tOmMWi<>m:invasion:migraiionSupportedbytheNationa1.BasicKefI¢3TChPhJgra1.n<S3Program.2010CB523).Me-feHmPwgtw4he"E1.eventhFiVeyewP1.an"forSci&.TcchReseafvhofChina<20()7DA!05DOK>andtheCiciwura1.ProgramofNa1.iunaJNatuiu1.ScienceF<MBida1.ixofChinaJ).Cc>mxpoc×!ing3u1.hcr.1.i.fi.Ik862E*mai1.:基金项目】国*RC荔喻杆允发展计划(“9T3计划,20IaI»29Wf1.>,M«+1.i-WttAIfitMian<2OKI>1.)U0H一国*rii¾H学5金I)1脑胶质细胞瘤是人类恶性肿瘤之一，其侵袭性生长是其难治性的重要原因之一，由于肿痛常侵袭到重要的脑功能区，手术切除布限，其预后差，诊断后5年生存率不足10%1.-2恶性胶质瘤患者的平均生存期Q年，2年生存率不超过20%'”因此，了解脑胶质瘤侵袭和迁移的机制对于指导肿瘤的治疗有重要的意义。肿瘤的侵袭和迁移是一个多步变化的过程，首先是细胞与细胞间粘合的减少、细胞自主运动性的增强，随后是细胞向别处的转移过程.三磷酸腺甘(adenosineTriphosphate,ATP)作为中枢神经系统中不可缺少的能Si物质以及参与新陈代谢外，其受体构成的信号通路还参与了细胞的增生、迁移、分化、死亡以及突触的神经传递过程"、而且，在细胞处于神经传递、低渗透压、肿瘤细胞坏死、甚至在胶质痛细胞在生长过程中对胶质细胞的世性作用和破坏均可以导致ATP的释放，因此胶岐痛所处微环境中ATP浓度的升高"T本研究应用细胞外定浓度的ATP作用于体外培养的U87胶质痫细胞，探讨细胞外ATP对U87胶质瘤细胞生长、侵袭和迁移中的作用以及胶质病所处微环境中ATP浓度的升高的原因，明确ATP对U87胶质瘤细胞的作用结果。1材料与方法1.1 细胞和试剂细胞来源：连续传代5代的人脑胶质痼细胞系187.由第三军医大学西南医院病理科提供。主要试剂：10%胎牛血清（FBS）、DMEM-F12培养基购自美国IIyC1.one公司：Matrige1.购自美国Sigma公司：聚碳酸惭微腴孔彳仝为8Um的24孔TranS.e1.1.小室由美国Corning公司提供：ATP购自美国Sigaa公司：含毒素-链费素溶液、CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术研究所.1.2 细胞培养用含有】灰胎牛血清有霉素100UZm1.和链霉素50Wm1.的DMEM/F12培养基于5%二氧化碳、37C条件下进行培养传代生长.1.3 增殖实验取对数生长期的U87细胞，常规肤的消化，1。Oormin离心5min收黑细胞，用0.1kIk10%FBS的DMEM/F12培养基分别M入0、50、100、200、500、5000umo1./1.（ftATP,鼻孔】×10“细胞接种于96孔板培养24h后用CCK-8试剂检测.KF5¾C0j37C瓣箱中培养4h后用的标仪测定光密度值3（450）,每组实验独立曳复3次”1.4 细胞周期检测取对数生长期细胞消化制成单细胞悬液，计数细胞，将IXI0"个细胞移入离心管中，1000r/nin离心5min.弃去上清后.用PBS溶液清洗1次,在离心管中用约0.51PBS,加入70%冰乙酹54混匀固定,4C放置48h以上。检测时.离心离去乙静,PBS清洗1次，在离心管中留1m1.PBS,轻微吹打细胞团成分散状，加入51.RNase<10gm1.>,37C放置1h,加入PK1.OOgm1.）染液，室温避光染色30min,计数1。OoO个细胞，流式细胞仪检测细胞周期分析，1.5 Transwe1.1.侵袭实验用含0.1%FBS的DMEM-F12培养基培养细胞12h.将Matrige1.胶80U1.均匀平铺于24孔TranSTeI1.小室的聚碳酸能做段上，37C孵箱预置30min聚合成凝胶备用.收集经过含0.1.¾FBS的培养基处理过的细胞，用含0.1%FBS的DMEM/F12培养暴骷浮细胞,上空每孔加入2X10'个细胞，细腿悬液体积为200U1.,分为ATP处理组和对照殂，对照组卜室加入含IWFBS的DMEM-F12培养基400u1,干扰如下室加入400u1含有10¾FBSJ00o1.1.ATP的DMEwF1.2培养基，每组各3孔,随后将装有TranSe1.1.小室的培养板置入培养箱中培养24h,弃上室液体、取出小室，以湿棉签擦去聚碳酸酯做膜上未穿过膜的细相，进行苏木精+结品紫染色，冲洗后封片，于倒置相差显微镜卜观察穿过膜的细胞数分别于每张膜中央部分和周围部分随机选取3个视野（XIo0）,计数每视野内穿过膜的细胞数目.1.6 细胞外ATP作用下U87胶质瘤细胞迁移实殴实驶前12h收集细胞，用含有0.NFBS的DMEM-F12培养超悬浮后种植于无菌长条形我破片上（长2c,宽1cm,厚度0.5mm）.年片】00个细胞，于含5%C0:、37C解箱中培养12h.甑后于时间显微健下，对照组为含10FBS的DMEM-F12培养基.ATP组为含有10%FBS100uno1.1.ATP的DMEaFI2培养基，调节显微镜每2分神采集1次照片，分别记录4h.1.7 统计学处理采用SPSS10.0统计软件，计馈资料以又土s表示，两独立样本均数间的比较行（检验。2结果2.1 细胞外ATP对U87胶质病细胞增殖的影响实验CCK-8检测试剂盒分别检测了0.1%、遥、10%血清中各浓度梯度ATP对U87脑胶质痛细胭作用2-1h的细胞增柏情况。结果显示，50、100、500uoI1.的细胞外ATP对1187胶质揄细胞增殖无明显作用，而较高浓度（5000Umo1.1.）细胞外ATP对U87胶质瘤细胞有显著抑制作用（P<0.05）.见图3.1W1.作敬4W用MMU*E1.1.HI”18JMSN9EB1.01%血清作用于U87细胞2站堵殖情况（5000S1./1.MP娘倒也死亡）ItMI1.ii1.a：P<O.06.fe4ft)ttt图2居血清作用于U87细胞24hJ®殖情况InM与琳，+Mi匚网I1.ixtwM*,aa:XQg500.5000w>I0+100not&M图310%血清作用于1.e7地的24h增殖情况2.2组地外ATP对U87肢及痛X电周期的影嘀实验采用流式细胞技术检测了不同培养状态下培养24h后U87脑胶质瘤细脆的生长周期，结果发现，处理组(IoOmo1.1.AP)及对照组对U87脑股侦箱细腿的生长周期无明显影响.2.3 用地外ATP对U87细胞迁趋速度的影喻情况实验采用时间显微镜每隔2分钟采集照片1次其恒温3讨论ATP是机体不可或缺的能量与代谢物质，在中枢神经系统，ATP及其受体构成的信号通路还参与了胶质细胞的增生、迁移、分化及神经元之间的相互作用过程。近来研究发现胶质瘤细胞对细胞外ATP的降解速度远低于胶质细胞冈，胶质瘤细胞在生长过程中对胶版细胞的毒性作用和破坏也可导致ATP释放，因此胶质病细胞所处的微环境中ATP的浓度升高：细胞外ATP浓度升高对正常脑组织有细胞毒性作用，而胶质瘤细胞不但耐受性高风而且细胞外的ATP还可促进胶质癌细胞的生长和侵袭U(M%有研究应用ATP水解酶(APyraSe)可抑制大鼠脑内种植C6胶质痛细胞的生长和侵袭呵。这些研究表明，脑胶质瘤细胞生长的微环境中ATP的浓度升高,虽然细胞外ATP对正常脑组织有细胞毒性作用，而胶质瘤细胞不但耐受性高，而且细胞外的ATP还可促进胶质痛细胞的生卡利发袭心叫本实验研究中，我们用ATP作为处理因素,以相同条件下不含ATP组作为对照，分别研究了ATP对U87胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响。在增殖试验中，分别用0.1%、1%、10%FBS作为对照，用以系统也Ur以很好的保持细胞活性，结果发现培养基中不加ATP时.U87胶质福细胞运动速度为(89K3±1327)Vh.在培养基中加入100mo1.1.的ATP后.细胞运动速度为(I63.83±1.7.81.)mh.100mo1.1.的ATP可以显著增强U87胶质瘤细胞的运动能力，使其迁移增强<P<005).2.4 *电外ATP对U87X电体外侵*的影响实验采用TranSWCI1.侵袭实验，以相同条件下不加ATP作为时照组，以加入100mo1./1.ATP作为处理组，经过24h培养并处理小室，处理组细胞跻胺细胞数为(16383±I781),明显多于对照组(89.83±13.27),表明定浓度ATP可以显著增强U87咬质揣细胞的侵袭能力(PVO.01.见图4.用4f100>o1.1.ATPHU87WfeTrensvwII侵我实检(×200)排除血清浓度对实验的影响：再分别用设匿不同梯度的ATP浓度作为处理组。结果表明，一定浓度的ATP对胶版痛细胞增殖并无明显影响，但较高浓度<5000mo1.1.>的ATP却严重抑制胶脑瘤细胞的生长。但众所周知的是，恶性肿痛之所以危害性大，其最重要的生物学特性是侵袭性生长”为了进一步研究ATP对U87胶质瘤细胞侵袭的作用，我们用Matrige1.以及TnmSWeII小室。重建后的Matrige1.能在聚碳酸滤膜表明形成类似天然基底膜的结构，细胞侵袭穿过重建Mairige1.的能力反映出该细胞的侵袭能力。我们以相同条件下不加ATP作为对照组，以加入100mo1.1.ATP作为处理组，经过24h培养并处理小室，统计学分析发现，处理组(Ioomo1.1.ATP)细胞跨膜细胞数明显多于对照组。结果表明,ATP可以显著增强U87胶质瘤细胞的侵袭能力。时间显微镜自带的恒温系统可以很好的模拟细胞生存外环境，最重要的是其自动每隔一定时间采集的照片可以直观的看到加入处理因素后细胞的运动及速度。我们采用同等条件不加ATP作为对照组，而力入ATP(1.mo)1.ATP)作为处理组。结果发现加入ATP组可以显著增强U87胶质瘤细胞的运动能力，使其迁移增强.本实胶提示细胞外ATP可以促进胶质痛侵袭和迁移能力。从理论上讲，本实验具有一定的研究和应A1 XnrdcnAD.WcnPY.GIi(XIatherapyinadu1.txJ.Neuro1.ogist,2006.12(6):27-292.2 SUghrUcME.Rutk<wiMJ.KancAJ.ctn1.Hunnng1.inmndcfionxtrntcxee1.IIinCspecificrexu1.tsvithATP-basedCbeni1.uminescentce1.1.u1.arpro1.iferationassaysJ.JC1.inNeurosci,2010.17(12):1573-1577.3 <BI'H张兴生,李例等.而帕密米联合啜呢亚硝眼抑树187TG股质痛细胞堆琦J.第三军联大学学报.2010,32(H)11529-1533.4 SteegPS.Tunoretasasis:echanisticinsightsandc1.inica1.chaiIens(J.XatMed.2006.12(8):895-904.5 Fie1.dsRDtBurnstDckG.Purinericsigna1.1.ing;inneuron-g1.iainteractions(J.NatRcvXJeurosci.2006.7(6):423H36.6 RapaportE.FirmanRF,GercCC.Grovthinhibiti<xofhunant>rce1.1.sinSOr1.Farcu1.turesbyIreatnentvith1.w1.eve1.sOfadenoxine5'-triphoxphntcJ.CnncerRcj;.1983.43(9):4402-4IO6.7 DcHT,Csemoch1.Extrace1.1.u1.arATPendcancer:anOVgrVieVwithspecia1.referencetoP2PMrirWrgiCreceptorsJ,Patho1.Onco1.Res.2008.14(3):219-231.8 ZhangZ.ChenG.ZhouW,ea1.Regu1.atedAIPre1.easefromastrocytesthroughIysosoneexocytosis(J.tCe1.1.Bio1.2007»9(8):945-963.9 NinkMR.1.eiuG.Braartho1.E.e1.a1.A1.teredextrace1.1.u1.arATP,ADPaiidAtf1Caiabo1.isaning1.i<mace1.1.1.ineU.Cancer1.ett.2003.>982>:2U-218.用潜力，但由于肿瘤细胞侵袭和迁移涉及多种曳杂过程，其相互关系及相关信号通路还有待进一步研窕。NeurooncoJ.2005,71(2):135-140.11""：''V11utrnuc1.eotidesandnuc1.eosidesinducepro1.iferationnndincreasenuc1.eosidetransportinhunang1.ionac«1.1.1.inesJ.JNeuroonco1.2003.M(3>:211-218.12Huang1.»1.iB11.i-eta1.ATPre1.WiIiVepotassiunchanne1.scontro1.eH<nace1.1.spro1.iferationbyregu1.atingERKactiv1.1.y(J.Carcinogenesis,2009.30(5:737-744.tI3j''.I!：:1.1.>.11!：!.'：/.Invivog1.Iob1.astonagrowthisreducedbyapyraseactivityinaratg1.iax>de1.J.BMCCancer.2006.6:226.HHardm7K,IJixarovskiKR.Re1.easeofA1.PnndUTPfronstrocytwc«sJ.ProgBrainRes.1999,120:135-143.15 Fie1.dsRD.BurnsUckG.Purinergicsigna1.1.inginneuron-g1.iainteractions(J.NatRevN(Mrosci,2006,7(6):423-43.)5与5相向p*rp*”*#*y16 RaportE.FistwnnRFGerco1.C.Growthinhibitionofhunantunorce1.1.sinsoft-agarcu1.turesbytratwntwith1.ow1.eve1.sofade<i08i>e5'-triphophatJ).CancerRes,19©,43(9):4402-4406.*姓1.Hu6与6相M*XmeKIN*(收桶2011-12-13：修回，2012-01-15)(嫔辑王小东)10rmcFB,IinrnAP.Stc1.IaJ.etn1.Incrcnxcdrcxixtnnccofg1.i<xaca1.1.1.inestoextracr1.Iu1.arATPcytotoxicityJ.J