组织因子途径抑制物的研究进展.docx

组织因子途径抑制物的研究进展组织因子途径抑制物(tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI)是一种存在于血液中的天然抗凝物质，通过作用于外源性凝血途径对体内凝血系统起调节作用。近年研究发现，TFPI在血友病、脓毒症、抗磷脂综合征、静脉血栓栓塞等疾病中起重要作用，随着对TFP1.功能机制、检测方法及其与疾病的关系研究的深入，有助于探索TFP1.的潜在诊疗作用。一、TFPI的基本特征TFPI基因位于染色体2q31-2q32,属于KUnitZ型蛋白酶抑制剂家族蛋白，具有三个串联功能区，从带负电荷的酸性氮基端到带正电荷的碱性较基端，分别为K1、K2、K3,如图1所示，通过与体内多种蛋白酶结合从而发挥生理功能。TFPI主要由内皮细胞合成，也广泛在多种细胞与组织中表达。在合成后TFP1.存在于内皮细胞、血浆和血小板中。在血浆中，与脂蛋白结合的TFP1.约占80%；20%的TFP1.以游离形式循环于血液中。研究证实与脂蛋白结合的TFP1.由于缺乏疑基末端而无抗凝活性，从而为游离的TFP1.起主要抗凝活性提供依据。图1TFPI的mRNA结构(框代表外显子，连接线代表内含子，框内显示由每个外显子编码的TFP1.区域，C-Term为C末端，K为KUnitZ结构域，1.为连接区域，N-Terrn为N末端）二、TFPI的多重抗凝调控机制TFPI作为天然抗凝物质主要发挥抗凝功能，研究者分别对其结构域和抗凝机制进行了一系列的研究，发现TFP1.的主要抗凝方式是以FXa依赖的方式使TF-FVIIa复合物失活，通过外源性凝血途径抑制凝血的起始阶段。该过程需要两步完成：TFPI通过K2与FXa结合形成TFPI-FXa复合物，抑制FXa活性；TFPI-FXa复合物中TFPI通过K1.与TF-FVIIa复合物中的FVIIa活性部位结合，形成稳定TF-FVIIa-TFPI-FXa四联体复合物，而后被单核细胞等吞噬清除，从而实现对TF-FVIIa复合物的抑制1o蛋白S作为TFP1.的辅因子在上述的抗凝过程中起协同作用已被研究证实，蛋白S通过与TFPI的K3上的Arg199和G1.u226结合，降低TFP1.的受体亲和力，增强TFP1.FXa复合物的形成，减少凝血酶生成。随后TeraZ-OrOSZ等2通过结构研究挖掘到蛋白S的层黏连蛋白G1残基介导其TFP1.的辅因子功能，并且受C4BP的竞争性调节，但其竞争机制尚不清楚。与此同时，肝素与TFPI的协同抗凝作用也被PeterSon等3研究证实，TFP1.的K3结构域上有肝素结合位点，在肝素作用下，结合于内皮细胞的TFPI释放到循环，可使血浆中TFPI增至24倍，促进TFP1.与FXa结合，达到抗凝目的，但其与肝素的相互作用在临床疾病上的诊疗作用还需要更多的临床研究。此外，WOOd等4研究发现TFP1.存在新的抗凝方式，TFPI的C末端的碱性区域与FV的B结构域的碱性区域有同源性，使其和FVa的B结构域的酸性区域的相互作用，抑制凝血酶原酶的早期形式，从而进一步抑制凝血的启动。继而研究发现FV缺陷患者的TFP1.水平显著降低，表明TFP1.和FV可能以复合物的形式循环，随后FV剪接变体(FV-short)在抑制FXa中充当TFPI的辅因子也被Dah1.back5研究证实，因此研发特异性阻断TFPI介导的抑制凝血酶原酶的药物有助于治疗血友病，为其提供新治疗途径。三、TFPI的检测方法目前人类尚未发现有TFP1.缺乏个体的存在，因此TFP1.对凝血-抗凝系统至关重要，为更好地研究TFP1.的调节机制及其与疾病的关系，目前有多种方法检测TFPI的基因表达、抗原含量和功能水平。随着科技进步，DNA分子标记技术逐渐普及，研究报道TFPI基因调控区域中的单核甘酸多态性，即TFPI-287C、-399T等位基因和-33T/C的多态性影响启动子的活性。随后学者将TFP1.基因多态性与多种疾病相联系进行研究，Naji等6研究确定TFP1.变异体rs10931292和冠状动脉疾病风险显著相关(OR=1.23,P=O.005);GUerra-Shinohara等7将遗传性血栓形成倾向作为复发性流产患者的风险因素进行研究时发现TFP1.T-287C可作为其保护因素(OR=O.46,P=O.009);TFP1.的单核甘酸多态性与静脉血栓形成易感性的关系近年来也被广泛研究，有研究表明TFP1.基因多态性决定TFP1.的表达并增加易感静脉血栓栓塞的风险，并在抗磷脂综合征、FV1.eiden等患者人群中得到验证。由于酶联免疫吸附实验具有快速、简便等优势，研究主要应用双抗原夹心法检测TFP1.的抗原含量。TFPI以全长分子和可变较基末端截短形式存在于血浆中，也与血浆脂蛋白结合循环，所以该检测方法的敏感性主要取决于TFP1.抗体定位于不同的TFP1.表位。OStergaard等8研发针对人TFP1.K3结构域的单克隆抗体适用于检测全长型TFP1.和覆基末端截短型TFPI但对无K3结构域的TFPI不敏感,其正常范围在7.826.0ng/m1.;OkUgaWa等9研发针对TFPHFXa复合物的单克隆抗体适用于检测血浆中TFPHFXa的含量，其平均值为(35.5÷11.7)pmo1./1.;此外，AmericanDiagnosticaInc>DiagnosticsStagO和R&Dsystems3家公司相继研发试剂盒检测血浆中游离型TFP1.或总TFPI的抗原含量，分别研发针对TFP1.K1-K2结构域和TFPI-C末端的单克隆抗体适用于检测总TFPI和游离型TFPI的抗原含量。StagO试剂盒检测出健康人群的总TFPI的平均含量为77.6ng/mI,但Eren1.等10应用AD1.试剂盒检测出健康人群的总TFPI的平均含量为88.67ngm1.,可能是由于抗体差异性,导致检测出的TFP1.抗原含量有所差异，不具有可比性。此外该测定方法的问题在于其测量的是抗原水平，而非功能活性。TFPI的抗原含量并不能代表其功能活性，鉴于TFP1.的抗凝特性，需要对其在高凝状态和出凝血疾病中发挥的抗凝活性进行定量和研究，因此有必要研发TFP1.的抗凝活性检测方法。1.indah1.等11基于TFP1.抑制TF-FVIIa复合物的催化活性的能力将发色底物法应用于检测血浆中TFP1.的活性。第一步通过TF-FVIIa复合物对FXa的抑制：TF+FVI1.a（剩余）+FXa+TFPI（血浆）一TF-FVIIa-TFPHFXa+TF-FVi1.a残余；第二步FXa与底物反应导致发色团的释放:TF-FVIIa+FX（过剩）+S-2222（FXa发色底物）-TF-FVIIa+FXa（剩余）+肽+生色团；而后用微量滴定板读数器在405nm处读取吸光度，表示FXa生成量。血浆中的TFP1.活性与FXa生成量成反比。但限制该测定方法的主要问题有2点，其一是该方法结果与TFPI总抗原水平呈正相关，无法充分区分截短型TFP1.和游离型TFPI,后者虽起主要抗凝作用但在血浆TFPI中占很小比例;其二是TFP1.除了与TF-FVIIa和FXa形成四联体复合物外，还具有抑制凝血酶原酶等抗凝功能，但在该方法中不能体现。随后Girard等12基于凝血酶原时间将血液凝固法应用于检测血浆中TFP1.的活性。首先在血浆中加入低倍稀释的组织因子，以启动外源性凝血。将通过添加TFP1.抗体而阻断血浆TFP1.活性的凝固时间与未添加TFP1.抗体而不阻断血浆TFP1.活性的凝固时间进行比较，从而使血浆TFP1.的抗凝作用得以量化。此测定方法具有观察到整体“体内”抗凝作用的优势。其结果与游离型TFP1.具有正剂量依赖性关系，表明TFP1.的抗凝活性测定主要是游离型TFP1.的功能作用。但其不足之处在于凝血酶原时间转换为TFP1.活性的统一度量尚未标准化。随着凝血酶生成实验的研发，WinCkerS等13将其应用于检测TFPI的抗凝活性。将添加与不添加TFPI抗体的2种实验体系下得到的2条凝固曲线进行分析，两者曲线下面积差值代表TFP1.在凝血酶生成过程中所起的抗凝作用，以此量化TFP1.在凝血酶生成过程中的抗凝功能。此检测方法将TFP1.活性与凝血酶生成量进行连接，从而反应TFP1.的抗凝活性，同样具有观察到整体“体内”抗凝作用的优势。但其缺点在于其实验试剂价格昂贵，如果想进一步应用于临床,还需降低试剂成本。此外，鉴于该检测方法结果受检测人员的操作熟练程度影响较大，其所需血浆量多也是需要纳入考虑的因素之一。继而本实验室建立了检测TFPI抗凝活性功能的新方法及其健康人群的生物参考区间，应用血浆比浊法原理，实时动态监测血浆的吸光度随时间变化的曲线，比较添加与不添加TFPI抗体的曲线差异，计算相关参数代表TFPI抗凝活性能力。随后的研究发现TFP1.抗凝活性在创伤人群中显著升高，或许可以作为内皮损伤标志物14o四、TFPI的临床应用1. TFPI与血友病：血友病是出血性疾病，其特征表现为反复出血、自发性出血和创伤相关出血。近年来逐渐意识到因子替代疗法的局限性和恢复凝血酶生成的重要性，鉴于血友病患者凝血因子FVI1.1.或FIX缺乏导致内源性凝血途径受损，TFPI作为外源性凝血抑制物或许可成为潜在治疗靶点进行研究。Chowdary15研究发现可以通过抑制TFP1.的抗凝作用促进组织因子诱导的凝血，恢复凝血酶生成，从而防止血友病患者自发性出血。目前多种TFP1.的单克隆抗体、拮抗剂、抑制剂等作为血友病治疗药物被研发，广泛应用于动物模型和临床试验16,17o动物研究显示使用TFP1.抑制剂治疗的血友病兔子模型出血减少，随后的临床研究表明,血友病患者通过使用TFPI抑制剂恢复了凝血酶生成和促凝作用，且有减少出血的趋势。此外，Marar等18研究指出血友病小鼠的血小板TFPI具有调节血栓形成和出血严重程度的作用，提示抑制血小板TFP1.的抗凝活性可能是血友病的潜在治疗靶点。2. TFPI与脓毒症：脓毒症是一种宿主应对感染时出现炎症反应失调导致的器官功能障碍综合征。微血管血栓形成与内皮激活的组织因子介导的通路在重症脓毒症患者多器官衰竭发生发展中起重要作用，而TFP1.作为组织因子相关凝血级联反应的内源性抑制物，两者具有一定联系。研究发现，脓毒症患者血浆TFP1.水平显著升高，从(61±19)ng/m1.到(110±90)ng/mI,可能是结合于内皮细胞的TFP1.为发挥抗凝作用释放到血浆中19o后期结合于内皮细胞的TFP1.耗竭，血浆中TFP1.含量下降，可能需要补充外源性TFPI,因此Tang等20提出内源性TFP1.未能充分平衡TF驱动的凝血激活可能是脓毒症发生弥漫性血管内凝血的基础，外源性TFP1.或许是治疗脓毒症的新方向。随后重组人TFP1.的脓毒症疗效在动物模型中得到验证，继而将分别接受重组人TFPI或安慰剂治疗的脓毒症患者进行比较时观察到前者28d全因死亡率降低20%,其改善高凝状态的同时降低了循环中细胞因子的水平，表明涉及组织因子的凝血级联反应可能是导致重症脓毒症患者器官功能障碍的主要原因，而重组人TFPI是改善重症脓毒症患者预后的有效治疗方法21,22o3. TFPI与抗磷脂综合征：抗磷脂综合征是指患者体内存在抗磷脂抗体的自身免疫性疾病，常表现为动脉或静脉血栓形成和病理妊娠等。研究者提出组织因子途径的上调可能是导致抗磷脂综合征患者高凝状态的主要原因23oEfthymioU等24通过临床研究支持上述观点，原发性抗磷脂综合征患者的TFPI功能活性明显低于健康对照组（0.89±0.37）U/m1.比（1.05±0.15）Um1.。随后体外实验证明，在正常血浆中加入抗磷脂综合征患者具有天然TFPI抗体的IgG组分后，削弱了TFP1.对FXa活性的抑制作用，导致凝血酶生成增加，提示在抗磷脂综合征患者体内存在TFP1.抗体，并可能在高凝状态中起作用。因此，组织因子途径的上调可能是由于TFP1.活性降低或TFP1.抗体，从而导致抗磷脂综合征患者的高凝状态。此外，研究发现TFP1.抗体与抗磷脂综合征患者不良妊娠结局具有相关性。4. TFPI与静脉血栓栓塞：静脉血栓栓塞是指血液不正常凝结于静脉中，使血管发生阻塞，常见于创伤、病理性妊娠、癌症等疾病。一项meta分析结果表明TFP1.多态性与静脉血栓形成有关联25,尚需进一步扩大样本量验证。TFPIrs8176592可能增加亚洲人的静脉血栓形成风险（隐性基因，0R=1.48,P=O.023）;TFPIrs10931292可能增加非亚洲人的静脉血栓形成风险（隐性基因，0R=1.42,P=O.033）;此外，TFPIrs10931292和rs10153820可能降低住院患者的静脉血栓形成风险（纯合子基因，0R=0.43,P=O.037;隐性基因，0R=0.45,P=0.039）o与此同时，目前TFP1.的抗原含量在静脉血栓栓塞患者体内呈升高趋势还是下降趋势未得到一致结果，Dahm等26研究显示TFP1.抗原水平较低人群的静脉血栓形成风险略有增加，而Fei等27在188例非小细胞肺癌患者人群中发现合并深静脉血栓形成患者的总TFPI抗原水平明显低于未合并深静脉血栓形成患者，(51.0±8.6)ng/m1.低于(87.1±15.9)ngm1.,并且可作为非小细胞肺癌患者深静脉血栓形成的预测因子(0R=4.15,P<0.05),Cao等14发现创伤合并深静脉血栓形成患者的TFPI抗原含量及其抗凝活性均显著高于创伤未合并深静脉血栓形成患者，(33.43±16.15)ngm1.高于(29.43±9.93)ng/mI,可用于预测创伤患者深静脉血栓形成。因此TFP1.的抗原含量及其抗凝活性在静脉血栓栓塞患者体内是呈升高趋势还是下降趋势未得到一致结果，原因尚不清楚，可能与其检测方法的差异、TFP1.在凝血过程中的释放与消耗程度有关，内皮损伤的严重程度和TFP1.的合成与清除可能也起一定作用。五、展望自1988年NOVOtny等28发现并克隆TFP1.以来，其在凝血过程中所起的抗凝作用不容忽视，近年来研究者不断探索其抗凝机制，不仅限于传统地形成TF-FVIIa-TFPI-FXa复合物抑制外源性凝血过程，还有TFP1.通过其C末端抑制凝血酶原酶等，尚需更多的结构与功能研究才得以全面揭示TFPI的多重抗凝机制。为了更好地评估TFP1.与疾病的关系，应继续研发与完善其在基因水平、抗原含量和抗凝活性的检测方法。在临床疾病中，所研发的TFP1.阻断药作为血友病的潜在治疗靶点已进入临床药物试验阶段，相反重组人TFP1.被发现可改善脓毒症患者的预后，仍要探索其在脓毒症诊疗中的效用。在多项研究中将TFP1.作为内皮损伤标志物用于评估疾病的内皮损伤程度与静脉血栓形成风险，这为疾病引起高凝状态的研究提供了一个新的思路。