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流式细胞仪的 FLOW CYTOMETER,原理及应用,BECKMEN-Coulter Epics XL 流式细胞分析仪,流式细胞术,流式细胞术是利用流式细胞仪检测细胞或其它颗粒性物质的物理、化学特性。它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理,同时利用荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。,FLOW CYTOMETRY,FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提供了精密、准确的方法和仪器.,流式细胞仪的发展史1930 年 Caspersson 和Thorell 开始致力于细胞的计数1934 年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞1936 年 Caspersson 等引入显微光度术1940 年 Coons 提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白1947 年 Guclcer 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器1949 年 Wallace Coulter 提出在悬液中计数粒子的方法的专利1950 年 Caspersson 用显微分光光度计的方法在UV 和可见光光谱区检测细胞1953 年 Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理成功的设计红细胞光学自动数器同年Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置成为流式细胞仪的雏形,1954 年 Beirne 和Hutcheon 发明光电粒子计数器1959 年 B 型Coulter 计数器1965 年 Kamemtsky 等提出两个设想一是用分光光度计定量细胞成分二是结合测量值对细胞分类1967 年 Kamentsky 和Melamed 在Moldaven 的方法的基础上提出细胞分选的方法1969 年 Van Dilla Fulwyler 及其同事们在Los Alamos NM(即现在的National FlowCytometry Resource Labs)发明第一台荧光检测细胞计1972 年 Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号1975 年 Kohler 和Milstein 提出了单克隆抗体技术为细胞研究中大量的特异的免疫试剂,流式细胞仪与显微镜,FLOW MICROSCOPE,光源,激光,自然光、灯光、氙(汞)灯,对象,细胞、生物粒子,细胞、生物粒子,承载工具,载(盖)玻片,鞘液及流动室,检测信号,光学信号,形态及染色,放大方式,PMT，放大电路,目镜X物镜,统计,人工，200,计算机，5000,结果,简单，单参数,多参数，综合分析,流式细胞仪组成 Cytometer 流式细胞仪主机 Workstation 流式细胞仪工作站 Power Supply 电源箱,三、几种常用的流式检测方法,一、流式细胞仪的基本原理,二、流式细胞仪的应用,一、流式细胞仪的基本原理,流式细胞仪构造,流路流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml光路光源滤片光电倍增管PMT HV电路放大电路HV及GAIN 增益A/D转换：不同的脉冲信号被转换成数字通道(CHANNEL)的 过程 统计：计算机,液流系统:将细胞依序送到测量区受检。光学系统:产生并收集荧光、光散射等信号。电子系统:将光学信号转换成电子信号。分析所输出的电流讯号，以脉冲高度、宽度、积分面积显示。量化讯号并传至电脑。,综合三个系统的功能:,流式细胞仪的分选原理,流式细胞仪主要技术指标,1流式细胞仪的分析速度2流式细胞仪的荧光检测灵敏度 3前向角散射（FSC）光检测灵敏度 4流式细胞仪的分辨率 5流式细胞仪的分选速度,Single Parameter Histogram,Dual Parameter Histograms,3-D Histograms,免疫荧光分析,细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。,原理：,免疫荧光分析的意义：流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验的一项重要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗原位点的细胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。对于造血系统疾病、免疫功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评估都起了重要作用。,常用荧光染料介绍荧光染料 激发波长发射波长用途FITC488nm 525nm免疫标记PE(RD1)488nm 575nm免疫标记ECD488nm 610nm免疫标记PE-CY5488nm 675nm免疫标记PI488nm 620nmDNA分析7AAD488nm 675nm 区分死细胞PE-CY7 488nm 755nm免疫标记,荧光素标记的单克隆抗体结合于细胞表面特异的抗原或分子，经过（或不）溶血后，上机检测相应抗原的表达率和荧光强度。,细胞表面分子或抗原分析,膜渗透剂作用于细胞，细胞膜通透性增强，荧光素和特异性抗体进入细胞内与特异性抗原或分子结合，经过流式细胞仪检测胞内抗原的表达率和荧光强度。,细胞内分子或抗原分析,细胞微球试验：使用一系列荧光微球捕捉样品中存在的多种可溶性蛋白，通过流式细胞仪进行快速和灵敏的定量检测标本：血清、血浆、培养液、其他体液,体液中可溶性分子的检测,标本处理,1，标本的获取2，标本的处理3，标本的转运4，样本的制备,标本获取常规标本来源 外周血和骨髓穿刺液 培养细胞 组织(实体瘤、脾、肝)标本是否合格 凝集、溶血、量太少或骨髓穿刺液无骨髓小粒均为不合格,标本的处理标本的抗凝及存放时间肝素抗凝的外周血和骨髓标本，在室温的条件下（160C-250C），储存时限为48-72小时。EDTA抗凝的标本，室温下储存时限只有12-24小时。ACD抗凝的外周血，室温下储存时限可达72小时ACD不推荐用作骨髓穿刺液的抗凝。组织细胞的处理：机械法、酶法,对于要作胞浆内检测的标本，先固定，然后可长时间的保存。但标本的保存时间要取决于抗原的种类及染色的方法。虽然标本可以保存一定时间，但有条件应立即送检。因为死亡细胞会增加结果分析的难度。,新鲜血液和骨髓标本抗凝新鲜血液和骨髓标本在室温条件下（注意不能低于100C或高于370C），且在储存时限以内，可以不作任何处理直接转运。但转运途中要注意不能剧烈震荡，以免溶血。,标本的转运,对于固定标本 根据不同的实验目的选择不同的固定剂。最常用的是4%的甲醛固定15分钟。适用于各类蛋白质的检测。70%冰乙醇，用于细胞周期分析的标本固定 60%的酸性丙酮PH4.2，固定10分钟。适用于血及骨髓标本磷酸酶和酯酶的检测。固定完全的标本，可以转运和存放。,对于需要作膜标记而送检又较远的标本 作膜标记一般需要保持细胞的活力，故需要 Ficoll分离单个核细胞。然后加入1640完培，并含DMSO，置液氮或-700C转运。,标本的制备 免疫标记（膜表面)的样本处理 保证单细胞悬液：组织标本采用机械法、酶法。300目尼龙网过滤调整细胞浓度：25X106/ml，标记：取100ul样本+适量抗体孵育：室温避光20分（或根据抗体说明）（加二抗）溶血：溶血剂的选择（市售、氯化氨、草酸氨）检测：,免疫标记（细胞浆内)的样本处理先将细胞膜“打孔”-破膜破膜剂的选择：Triton 皂素 毛地黄毒甙按前述方法进行标记,细胞周期分析的样本处理 传统方法：单细胞悬液（如全血，则需分离单个核细胞）冰乙醇固定过夜洗涤细胞加复合染液（Triton，RNA酶、PI）20-30分钟后上机检测BC公司DNA-Prep试剂溶血（如需要）固定染色一步完成20分钟后上机检测,注意事项,FCM是依据相对荧光量来反映所测定的物质。因此，测定时相应的对照管是必不可少的。细胞免疫功能受多种生理病理因素影响很大，下结论时应结合临床选择抗体时要遵循以下原则：选择亲和力高的抗体；由于不同的单克隆抗体针对的抗原表位不同，应该选用合适克隆的抗体；由于抗原分子的表达程度不同，应选用合适的荧光标记，尤其是对于表达弱的抗原，应用强的荧光素标记；注意抗原表达在不同品系的差异，尤其是针对动物抗原。,二、流式细胞仪的应用,细胞生物学,临床免疫学,临床血液学,临床肿瘤学,血栓与止血,骨髓和器官移植,(一)FCM在细胞生物学中的应用,检测细胞的结构组成：大小、粒度、DNA含量、RNA 含量、蛋白质含量等。检测细胞功能：细胞表面及胞内抗原、细胞因子等。,细胞DNA分析原理,利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量,细胞DNA 分析的意义：DNA含量是随细胞增殖分裂周期各时相的变化而变化的。DNA含量正常与否以及各阶段细胞分化情况，可作为了解肿瘤恶化程度和预后的重要参考。,G0期：DNA合成静止期 2NG1期：DNA合成前期 2NS期：DNA合成期 2N4NG2期：DNA合成后期 4NM期：细胞分裂期 4N,细胞周期,DNA倍体,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA Analysis,DNA content,Count,Normal Cell Cycle,0,200,400,600,800,1000,PI Fluorescence,2N,4N,DNA Analysis,DNA倍体性Ploidy：细胞内染色体DNA含量二倍体Diploid：正常体细胞内染色体DNA含量DNA指数（DI）：测定标本的G0/G1期细胞DNA含量与同种系正常细胞的G0/G1期细胞DNA含量的比值，表示细胞倍体性S期含量SPF：S期细胞占总周期细胞的比例增殖指数PI：增殖细胞占总周期细胞的比例G0/G1期细胞DNA含量变异系数CV,细胞凋亡的FCM检测 Annexin-PI APO2.7蛋白 DNA含量变化 TUNEL bcl-2 P53 Fas及FasL Caspase(半胱氨酸蛋白酶),与细胞凋亡有关的疾病,细胞周期分析-异倍体与凋亡峰,基本原理,主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性。,细胞核的特征性改变,细胞核的改变 2.光散射特性,凋亡检测 Annexin V-PI双标记,凋亡的形态学变化,坏死的形态学变化,细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。,基本原理,Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。,凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料（如PI）有拒染性，而坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的DNA被PI着色而发出红色荧光信号。在流式细胞术双参数散点图上左下象限为阴性细胞即活细胞（Annexin-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞（Annexin+/PI+）；左下象限为凋亡细胞（Annexin+/PI-）。,Annexin V Assay,(二)FCM在临床免疫学中的应用,CD分子(Cluster of differentiation)-人类白细胞分化抗原,由WHO发起，人类白细胞分化抗原国际研究小组组织鉴定和统一命名，将识别相同抗原的单抗归于一组，以Cluster of Differentiation member system,简称CD表示。自1982年始至2000年，共召开了七届国际人类白细胞分化抗原会议，共命名 200种CD单抗。同一CD中有几种、十几种、甚至几十种单抗，克隆不同，生产实验室不同，虽然同一CD单抗识别同一抗原分子，但这些单抗与抗原不同位点反应，因此用同一CD系列中多个单抗测定时，结果会有差异,CD抗原及其相关细胞群,细胞群 CD抗原 T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94 血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f 内皮细胞 CD105 CD106 CD109细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126,淋巴细胞亚群测定,T淋巴细胞(CD3+)T辅助细胞(CD3+CD4+)T抑制细胞(CD3+CD8+)B淋巴细胞（CD19+或CD20+）NK细胞(CD3-CD56+),(三)FCM在临床血液学中的应用1.白血病的MIC分型 Morphology Immunology Cytogenetics 白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。白血病免疫分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。,免疫分型的价值,能正确区别AML和ALL，并能进一步区别 ALL中的T系和B系及亚型。能正确鉴别AML中的M0、M6、M7 诊断双系或双表型白血病 发现仅表达个别次要非本系列相关抗原 的白血病 诊断少见疑难白血病(如毛细胞性白血病),(四)FCM在临床肿瘤学中的应用 肿瘤患者的免疫功能检查 肿瘤患者的粘附分子检查ICAM-1 CD54ICAM-2 CD102ICAM-3 CD106CD62、CD63、CD42a/b、CD41/61、TSP,肿瘤标本的FCM检查 耐药基因检查 癌基因与抗癌基因在肿瘤细胞中的表达及与预后的关系 粘附分子检查 细胞凋亡检查 细胞DNA及细胞周期分析(癌前病变,恶性肿瘤预后评价)细胞增殖能力研究 肿瘤细胞耐药性筛选 肿瘤相关抗原，特异标志物 激素受体 与癌细胞生物行为有关的因子，如CD44,DNA诊断肿瘤病标准,1.出现非整倍体细胞峰，DI1.1或DI15%3.无明显的异倍体，但G0/1的CV10%，S期在10%-15%4.S+G2/G1/0 20%,(五)FCM在血栓与止血中的应用1.血小板糖蛋白 血小板质膜糖蛋白GPa：CDw49b GPa：CD61GPb：CD42b GP：CD36GPc：CDw49f GP：CD42aGPa：CD29 GPb：CD41GPa：CD31 血小板颗粒膜糖蛋白颗粒：CD62P(GMP140、PADGEM)GMP-33 TSP颗粒：溶酶体完整膜糖蛋白 CD63 溶酶体相关膜糖蛋白-1 LAMP-1 溶酶体相关膜糖蛋白-2 LAMP-2,(六)FCM在骨髓和器官移植中的应用 骨髓或脐血的祖干细胞细胞测定CD34+CD38-CD34+CD38+CD34-CD38+移植前配型HLA-I类抗原的抗体(PRA)血管内皮细胞抗体(VEA)移植后的免疫监测淋巴细胞及活化淋巴细胞亚群粘附分子,三、几种常用流式检测方法,细胞凋亡检测 细胞内因子检测 细胞功能检测,步骤：1）制备单细胞悬液于200ul的PBS中 2)加2ml预冷的70%的酒精中，边加边振动保证细 胞不粘连 3）置于4摄氏度冰箱过夜 4）2000转离心5分钟，去上清 5）重悬细胞沉淀于PBS中，2000转离心，去上清 6）重悬细胞沉淀于PBS中，轻轻吹打，过300目 滤网过滤，调整细胞浓度为106/ul 7)加入100ulPI染液，避光孵育30分钟上机检测。,（一）细胞凋亡检测,1、细胞DNA分析凋亡峰,阴性对照,24小时,48小时,72小时,2、Annexin V-PI双标记,步骤：1）制备单细胞悬液，用冷的PBS洗两次2000 转离心，去上清。用400ul 1X Binding Buffer重悬 2）分a、b、c、d、e五管，调整细胞浓度106/ul/管 3）a管不加任何试剂，作为阴性对照管 4）b管加2%的多聚甲醛固定30分钟，用AnnexinV和PI 各5ul双染，作为阳性对照 5）c管只加5ul PI，避光孵育5分钟；d管只加5ul AnnexinV,避光孵育5分钟 6）e管加入5ul PI 和5ul AnnexinV,室温孵育5分钟 7）每管各加入400ul 1XBinding Buffer 上机检测。,阴性对照,0.125,0.25,0.5,4、Fas(CD95)的检测,（二）细胞内因子的检测,细胞内细胞因子的染色依赖于与固定渗透过程一致的细胞因子特异性的单克隆抗体的识别。优化的细胞内细胞因子的染色技术包括多聚甲醛的固定和随后的用去垢剂皂角苷处理增加细胞膜的通透性。多聚甲醛固定能保留细胞形态完整性和细胞内物质的抗原性，也能使细胞避免去垢剂的渗入。去垢剂皂角苷处理细胞后能使细胞因子特异性的抗体渗入细胞膜、细胞质、内质网膜和高尔基复合体。在细胞活化过程中加入蛋白质运输抑制物，如莫能菌素（monensin）和布雷非尔德菌素（Abrefeldin A）等，阻断胞内高尔基体介导的蛋白质转运，使细胞因子聚集、蓄积，增强了细胞因子信号，可用于流式细胞仪检测。,原理：,流式细胞仪检测细胞内细胞因子的一般步骤,分离制备细胞,活化细胞,封闭细胞表面的Fc 受体,固定和渗透,细胞内细胞因子染色,流式细胞仪检测和结果分析,(三）细胞功能检测,吞噬功能 氧代谢水平 过氧化物水平 超氧离因子水平 谷光甘肽水平 细胞膜电位检测,1、活性氧（ROS)的检测,用2，7二氯氢化荧光素二脂（DNFH-DA)作为检测细胞内活性氧含量的荧光探针,方法：收集细胞,用Hanks液洗涤细胞2次,加入终浓度为10molL的DCFH-DA400L,充分混匀,在37条件下避光反应50min,用Hanks液洗涤细胞3次以去除细胞外荧光剂,用500LHanks液重悬细胞,37条件下水浴10分钟，上机检测。,2、线粒体膜电位的检测,线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodideDiOC6（3）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。,方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123（1mM）或终浓度为DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37C平衡30min，流式细胞计检测细胞的荧光强度。,注意事项：1 始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。2 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。,阴性对照,72小时,流式细胞术的展望,