金黄色葡萄球菌检验.ppt.ppt
金黄色葡萄球菌检验,一、生物学特性 菌体形态及培养特征,革兰氏阳性球菌，直径为0.5-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群，如葡萄状，故称为葡萄球菌。,大多数菌株产生类胡罗卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌。,生物学特性 菌体形态及培养特征,大多数菌株最适生长温度30-37，最适pH为7.0-7.5；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；可在15%氯化钠和40%胆汁中生长。一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增菌或7.5%氯化钠肉汤增菌。,生物学特性 菌体形态及培养特征,所有的毒株产生血浆凝固酶，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂肪酶和溶菌酶等，大多数菌株可水解天然的动物蛋白并释放脂肪酸。在BP平板产生磷脂环。,生物学特性 致 病 性,金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a.溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环。b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。d.脱氧核糖核酸酶（DNA酶）e.肠毒素：引起急性胃肠炎。,金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。,生物学特性 致 病 性,葡萄球菌皮肤感染,生物学特性 致 病 性,葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。,二、检验程序与操作方法,根据中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准：食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 GB 4789.10-2010 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 验,检样25g(ml)+225ml 75氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤,国标：金黄色葡萄球菌检验程序,血平板，Baird-parker,涂片染色,观察溶血,血浆凝固酶试验,BHI肉汤和营养琼脂小斜面,36 1,血平板 18h24hrBaird-parker 18h 24h 或45h 48h,36 1,18h 24h,检验程序 增菌培养,利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐受15%的氯化钠），用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤（见P65）或7.5%氯化钠肉汤增菌。置37摄氏度培养箱培养24小时。,检验程序 分离培养,血平板：金黄色葡萄球菌可以产生溶血素，因此在血平板上产生明显的溶血环。典型菌落：呈金黄色，有时也为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环。,大而突起，圆形，不透明，表面光滑，有溶血环,血平板制作：,成分：豆粉琼脂（或营养琼脂）100mL，脱纤维羊血（或兔血）5-10mL。制法：加热融化琼脂，冷至50，以无菌操作加入脱纤维羊血或兔血，摇匀，倾注平板。或分装灭菌试管，摆成斜面。,检验程序 分离培养,BP（贝尔德-帕克）平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、维生素和矿物元素丙酮酸钠是一种生长促进剂亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。,检验程序 分离培养,在BP平板上典型菌落为：灰色到黑玉色，圆形，光滑突起，湿润，直径2-3mm，边缘常为淡色（米黄色或灰色），周围为一混浊带，在其外缘常有一透明圈。用接种针接触菌落似有黄油树胶的粘稠感。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落，其黑色常较典型菌落淡些，且外观可能粗燥，质地较干燥。,B-P平板,检验程序 鉴定之革兰氏染色镜检,革兰氏阳性，球形，组成葡萄状,检验程序 鉴定之凝固酶试验,金黄色葡萄球菌可以产生血浆凝固酶，因此对其鉴别的主要试验是测定其凝固酶。方法一：试管法 挑取B-P平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，放361恒温箱培养18h24h。,取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入 BHI 培养物0.2mL0.3mL，振荡摇匀，置361温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，361培养 18h48h，重复试验。,试管法,阳性反应,阴性反应,不凝固,少量、零散凝固,明显的块状凝固,巨大块凝固,完全凝固，倒置不流动,方法二：玻片法在一张洁净玻片中央加1滴生理盐水，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经1020s内无自凝现象发生，则加入人或兔新鲜血浆1环（不用稀释），与菌悬液混合，观察结果。也可按P53方法。,有凝块,血浆,均匀混浊,生理盐水,兔血浆制备：成分：柠檬酸钠0.106 mol/L（31.3g Na3C6H5O72H2O溶于1L蒸馏水中）制法：一份加兔血9份混合后离心2000rpm，10min吸取上清液即为兔血浆。,25g样品+225ml 生理盐水,选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥的BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）,平板计数（分别记录每种类型的菌落数）,36 1 48hr,血浆凝固酶试验,报告结果 金葡菌数/g(mL),B-P平板计数,梯度稀释,第三法 金黄色葡萄球菌MPN计数,器材准备,准备的器材规格名称数量1、250ml三角瓶 1个2、10100mm试管 6支3、1ml移液管 2支4、10ml移液管 2 支5、直径为90mm平皿 8套6、250ml量筒 1支,第一天,（一）样品处理：鱼干、腊肉（二）增菌培养,第二天 接种选择性平板进行分离培养,（一）接种选择性平板取增菌液1环，划线接种于血平板或BP平板。（三）培养 放于361培养24h。,第三天 观察分离结果、镜检和血浆凝固酶试验接种,第四天 血浆凝固酶试验（试管法）、实验报告,
