CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型肝小叶内卵圆细胞总体积与轮廓数密度变化的体视学分析.docx

肝纤维化及肝硬化DOI:10.12449/JCH240113CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型肝小叶内卵圆细胞总体积与轮廓数密度变化的体视学分析王JII林L刘全明2,杨霞2,杨正伟3,梅小平I,彭彬31川北医学院附属医院感染科，四川南充6370002川北医学院临床医学系,四川南充6370003川北医学院基础医学与法医学研究所，四川南充637000IK言储：蹄,340255492(ORQD:00-0002-6947-2570)摘要：目的定量研究CCL诱导的肝纤维化大鼠肝小叶内卵圆细胞(HoC)总体积和轮廓数密度的变化。方法将11只雄性健康SD大鼠随机分为对照组(。=5)、肝纤维化组(。=6),每周2次皮下注射CQ,与橄榄油混悬液，每次3mlkg.在肝纤维化造模5周后取材，从每只大鼠肝脏随机抽选5个大小约1mnr?的肝组织块分别制作1张EPOn812环氧树脂包埋超薄切片，运用体视学方法结合透射电子显微镜技术，对大鼠肝小叶内的HoC总体积和轮廓数密度进行定量研究，另从每只大鼠剩余肝脏等距随机抽选4个2mm厚的肝组织块并分别制作2张石蜡包埋的Masson染色切片，按照肝纤维化Metavir分期标准定性评估每只大鼠的肝纤维化程度。计量资料两组间比较采用成组，检验。结果体视学定量研究显示，对照组肝小叶内HOC总体积为(15.40±7.63)mm3,肝纤维化组肝小叶内HOC总体积为(146.80±114.00)mm与对照组匕傲，肝纤维化组大鼠肝小叶内HC)C总体积显著增加了8.53倍(f=-2.551,P=O.031);对照组肝小叶内He)C轮廓数密度为(56.20±40.40),肝纤维化组肝小叶内Hc)C轮廓数密度为(566.50±317.00),与对照组比较，肝纤维化组大鼠肝小叶内轮廓数密度显著增加了9.08倍(t=-3.539,P=O.006):定性嫄研究结果显示，肝纤维化大鼠肝纤维化分期按照MetaVir评分标准达11I11期，大鼠案周隙内肝星状细胞增生部位周围伴随着HOC的大量增生。结论Cd4诱导肝纤维化大鼠肝小叶内Hc)C显著增生。关键词：肝纤维化；大鼠,Sprague-Dawley;肝卵圆细胞；肝星状细胞基金项目：川北医学院2021年度校级科研发展计划项目(CBY21-QA14)；南充市2020年市校科技战略合作专项(20SXQT0304)Changesinthetotalvolumeandcontourdensityofovalcellsinhepaticlobulesofratswithcarbontetrachloride-inducedhepaticfibrosis:AStereologicalstudyWANGChuanlin1,LIUQuanminc,YANGXi,YANGZhengweP,MEIXiaoping1,PENGBirr,.(1.DepartmentofInfectiousDiseases,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China;2.DepartmentofClinicalMedicine,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China;3.InstituteofBasicMedicineandForensicMedicine,NorthSichuanMedicalCollegelNanchong,Sichuan637000,China)Correspondingauthor:PENGBin,340255492(ORCID:0000-0002-6947-2570)Abstract:ObjectiveToquantitativelyinvestigatethechangesinthetotalvolumeandcontourdensityofhepaticovalcells(HOC)inhepaticlobulesofratswithcarbontetrachloride(CCI4)-inducedhepaticfibrosis.MethodsAtotalof11healthymaleSprague-Dawieyratswererandomlydividedintocontrolgroupwith5ratsandhepaticfibrosisgroupwith6rats,andCaanddiveoilsuspensionwereinjectedsubcutaneouslytwiceaweek,3mLkgeachtime.Afterfiveweeksofhepaticfibrosismodeling,fivelivertissueblockswithasizeofabout1mm3wererandomlyselectedfromtheliverofeachrattoprepareoneEpon812epoxyresin-embeddedultrathinsection,andtheStereologicalmethodandtransmissionelectronmioscopywereusedforthequantitativeanalysisofthetotalvolumeandcontrdensityofHOCinthehepaticlobulesofrats.Inaddition,fourlivertissueblockswithathicknessof2mmwererandomlyselectedfromtheremainingliverofeachrattopreparetwoparaffirvembeddedMassonstainingsections,andthedegreeofliverfibrosisineachratwasqualitativelyevaluatedaccordingtotheMetavirstagingcriteriaforliverfibrosis.Theindependent-samplesttestwasusedforcomparisonofcontinuousdatabetweengroups.ResultsThequantitativeStereologicalanalysisshowedthatthetotalvolumeofHOCinhepaticlobuleswas15.40±7.63mm3intheControlgroupand146B0±114.00mm3intheliverfibrosisgroup,andcomparedwiththecontrolgroup,thetotalvolumeofHOCinhepaticlobulesofratsintheliverfibrosisgroupwassignificantlyincreasedby8.53times(t=-2551,P=Q031);thecontourdensityofHOCinhepaticlobuleswas5620±40.40inthecontrolgroupand56650±317.00intheliverfibrosisgroup,andcomparedwiththecontrolgroup,thecontourdensityofHOCinhepaticlobulesofratsintheliverfibrosisgroupwassignificantlyineasedby9.08times(V-3539,P=0.006).Qualitativeobservationshowedthatliverfibrosisstageofratsreachedstage11-IHaccordingtotheMetavirscoringcriteria,andmassiveproliferationofHOCwasobservedaroundtheproliferationsiteofhepaticstellatecellsintheperisinusoidalspaceofrats.ConclusionCCI4inducessignificantproliferationofHOCinhepaticlobulesofratswithliverfibrosis.Keywords:HepaticFibrosis;Rats,Sprague-Davdey;HepaticOvalCells;HepaticStellateCellsResearchfunding:NorthSichuanMedicalCollege2021Schl-LevelScientificResearchDevelopmentPlanProject(CBY21-QA14);NanchongSpecialProjectforMunicipalandUniversityScienceandTechnologyStrategicCooperationin2020(20SXQT0304)肝纤维化和终末期肝硬化是严重的全球医疗问题，的方法电镜下HOC形态学特征为胞体近似圆形或卵但肝纤维化发生机制目前仍未完全阐释清楚。肝星状细胞（HSC）活化被认为是肝纤维化的关键环节fl31本课题组前期采用体视学方法结合电镜技术研究了CCI4所致肝纤维化大鼠肝组织超微结构的改变，发现肝纤维化大鼠夏周隙内HSC数量显著增加si。同时，还在大鼠肝小叶内（主要是卖周隙以及肝细胞间）观察到了大量增生的幼稚细胞。通过直阅文献，根据这种幼稚细胞电镜下的形态学特征、位置，判断这种幼稚细胞可能是肝脏干细胞中的卵圆细胞（hepaticovalcell,HOC）%）.HOC是一类具有多向分化潜能的肝脏干细胞，研究表明，HOC也参与了肝纤维化的过程，但是HOC在肝纤维化过程中所起的作用目前尚存争议.有研究（71报道，HOC在HSC活化过程中通过合成结缔组织生长因子，促进HSC的增殖和细胞外基质（ECM）的分泌，加重肝纤维化但也有研究【8】发现体外诱导人胚胎干细胞分化为HOC,将其移植入CCI4诱导的肝纤维化大鼠体内，能有效减轻肝纤维化。HOC在CCI4诱导的肝纤维化大鼠模型中扮演什么样的角色，究竟是加重肝纤维化还是改善肝纤维化，值得进一步思考。由于HOC在正常肝脏中数量极少，仅占正常肝细胞的1%3%,且HOC体积很小，光镜下很难被辨认。另外目前HOC的表面标志物如胆管上皮角蛋白CK7、CK8、CKI8、CKI9、OV6、c-metHE/V125和HepPariW乏特异性，不同亚群及不同发育阶段的HOC所表达的标志物也不尽相同，HOC的分子鉴定研究也存在一定困难1"°）.因此电镜研究HoC被认为是最可靠和最有价值圆形，胞核大，胞浆相对较少，核质匕嘀，核仁明显，胞质内细胞器较少，含少量粗面内质网与缔体l5-6为明确CCL1诱导的肝纤维化大鼠是否伴有肝小叶内HOC总体积与轮廓数密度的变化，进一步探讨HOC在肝纤维化进程中的作用，本课题组采用体视学方法结合透射电镜技术测量了CCL1诱导的肝纤维化大鼠肝小叶内HOC的总体积与轮廓数密度，以期为HOC在肝纤维化中的作用提供形态定量证据。1材料与方法1.1实验动物与分组11只3月龄健康雄性SD大鼠r体质量160180g,购买于川北医学院动物实验中心，SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为2组：对照组（/7=5）、肝纤隹化组（"=6）.1.2动物模型建立1.2.1肝纤维化组模型制备将橄榄油（国药集团化学试剂有限公司）与CCI4（国药集团化学试剂有限公司）按体积比2:3配成40%橄榄油与CCI4混悬液，在大鼠背部皮下注射3mLkg的橄憎由与CQ.混悬液，每周注射2次，建立大鼠肝纤维化模型，造模5周后取材。本研究模型组的6只大鼠是从15只建模大鼠中选取的按肝纤维化MetaVir分期标准成功达到11In期肝纤维化大鼠。从造模开始的第2、3、4、5周，分S!）三15只模型大鼠中随机选取1只取材判断肝组织的病理变化情况，并在第5周观察到肝组织出现了11期肝纤维化病理改变，即对剩下的大鼠全部取材，并选取其中6只达到肝纤维化1I11期病理改变的大鼠纳入实验组111.1.2.2对照组模型制备在大鼠背部皮下注射3mLkg的生理盐水，每周2次，造模5周后取材。1.3 肝脏密度与体积测量方法采用电子天平（精度0.1mg）称量大鼠肝脏质量，并用已知密度的不同浓度的蔗糖或乙醇溶液测量肝脏密度，用大鼠肝脏质量除以肝脏密度，即可得到大鼠肝脏体积。1.4 肝组织处理与切片制备予以大鼠3%戊巴比妥（50mg/kg）腹腔注射进行麻醉随机剪取一小块肝组织切成1mr放入2.5%戊二醛固定，用于制作电镜超薄切片。剩余肝组织放入4%的多聚甲醛（成都市科龙化工试剂厂）浸润固定48h后用于制备石蜡包埋切片。1.4.1石蜡切片制备从每只大鼠肝脏按照等距随机抽样抽选4个2mm厚的组织块行石蜡包埋，每个肝组织块用半自动石蜡切片机切取2张14m厚的石蜡切片，按照Masson三色染色试剂盒（福州迈新生物技术公司）说明书上的MaSSon染色方法染色肝组织切片，以显示胶原纤维0光镜下观察大鼠肝纤维化造模效果。1.4.2电镜超薄切片制备肝组织块经2.5%戊二醛固定4h后，从每只大鼠中随机抽选5个肝组织块制作电镜超薄切片，具体方法如下：首先在4温度下1%OsO4中固定2h,乙醇和丙酮梯度脱水，环氧树脂812（SPI-CHEM,美国）渗透、包埋。利用超薄切片机（德国L日CAEMUC7）从每个组织块切取70nm厚的连续超薄切片放置在铜网上。用乙酸双氧铀（SPI-CHEM,美国）和柠檬酸铅（中国成都科龙化学试剂厂）染色后在透射电子显微镜下观察。1.5体视学分析1.5.1 计算肝HoC总体积在透射电子显微镜（HT7700）下观察肝组织超薄切片，发现放大倍数为1200倍时刚好能对一个圆形铜网内的组织结构随机抽选视野拍照，当在放大1200倍下分辨不清组织结构时，将放大倍数放大更高后拍照以准确地辨认结构，平均每只大鼠约获得25张照片o在AdobePhotoshopCS6软件里将每雌镜照片（1200倍）上随机叠加7x7个测点，分另IlH级在HOC上的测点数以及落在肝组织上的总测点数。HOC的体积分数为该大鼠肝脏所有照片落在Hc）C的测点数之和除以该大鼠肝脏所有照片肝组织上的总测点数之和，将HOC体积分数乘以肝脏的总体积,即可得到HOC总体积。1. 5.2计算肝HOC的轮廓数密度用PhOtoShOP软件在已获得的电镜照片（xl200倍）上，叠加无偏计数框（图1）,体视框面积为2354.45m2,按照禁线法则抽选并计数位于计数框内或与计数线相交，且不与禁线相交的HOC的数量。单位面积内HOC轮廓的数量（轮廓数密度，Na）为组内所有体视框所计数HOC的总数除以每个体视框面积与体视框数量的乘积。注：黑色箭头示肝HOC;红色箭头示肝细胞.体视框面积为2354.45m2,红线为禁线，绿线为计数线，计数落在体视框内、或与绿线相交的肝HOC1落在红线上的肝HoC不计数.图1体视框计数肝卵圆细胞数密度Figure1Contournumberdensityofhepaticovalcellscountedbystereoscopicframe1.6统计学方法采用SPSS27.0统计软件进行数据分析。计量资料以f±s表示，两组间比较采用成组f检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2. 1光镜下定性观察CCI4所致肝纤维化大鼠肝组织的主要病理改变对照组大鼠肝细胞胞质内偶可见13个脂滴，肝组织内胶原纤维主要分布在门管区与窦周隙，中央静脉周围可见极少量胶原纤维.与对照组比较，肝纤维化组大鼠肝细胞体积明显增大，肝细胞出现了大量气球样变性、脂肪变性甚至坏死，肝细胞胞质内脂滴明显增多。汇管区胶原纤维大量增生，增生的纤维间隔向邻近肝小叶延伸，部分大鼠少数纤维间隔形成，部分大鼠多数纤维间隔形成，所有大鼠按照肝纤维化分期MetaVir评分标准达到1111I期。肝组织内妻周隙和中央静脉周围可见明显增厚的胶原纤维束，肝血窦变窄（图2）。2.2电镜下观察CCI4所致肝纤维化大鼠肝组织超微结构的主要病理改变在对照组，大鼠肝细胞呈不规则六边形，肝窦周隙内可见少量胶原纤维，窦周隙内偶可见极对照姐肝奸最化”注：胶原纤维;中央献；汇管区；肝细胞；肝血案.图2 MaSSOn染色的肝组织结构Figure 2 Histological structure of liver by Masson staining个别HSC与HOCeHOC的胞体近似圆形或卵圆形，其胞感大，胞质极少,部分HOC整个胞体几乎为细胞核，胞质内细胞器较少，主要为线粒体与粗面内质网。与对照组比较，肝纤维化组大鼠肝细胞部分脂肪变，部分细胞器溶解坏死，姿周隙显著增宽，其内胶原纤维明显增生，血窦腔明显变窄甚至塌陷。窦周隙内HSC大量增生，HSC胞体增大，胞质内脂滴明显增多窦周隙内与肝细胞间HOC大量增生，窦周隙内增生的HOC主要位于HSC拗近（图3、4）.2.3体视学形态定量研究结果与对照组比较，肝纤维化组大鼠肝小叶内Hoc总体积显著增加了8.53倍，其轮廓数密度显著增加了9.08倍（P<0.05）（表1）。3讨论HOC是肝脏中一种多潜能干细胞，在肝组织受到严重或慢性损伤时，能分化为肝细颗口胆管上皮细胞，修复组织损伤肝纤维化是一种以ECM过度积聚的创伤修复反应113M】。HOCT肝2干组也程，但HOC加舌究竟是加重肝纤维化还是改善纤维化，各学者的观点并不一致。目前关于HOC在肝纤维化中活化增殖的研究主要是采用定性或半定量研究方法，对HOC增殖的定量研究缺乏实验数据。本研究电镜下观察发现，HOC的胞体近似圆形或卵圆形，其胞核较大，胞质极少，部分HOC整个Figure 3对照媚肝纤维化也HOC ;肝细胞;肝血姿;肝星状细胞;窦周源.图3 电镜下肝组织超微结构Ultrastructure of liver tissue under electron microscope注：肝卵圆细胞;胶原纤维；线粒体；粗面内质网。图4电镜下HOC超微结构（7000）Figure4Ultrastructureofhepaticovalcellunderelectronmicroscope（×7000）项目减物（n=5）肝纤维化组（=6）!值P值肝卵圆细胞轮廓数密度56.20±40.40566.50±317,-3. 5390.006肝卵圆细胞总体积（mm3）15.40±7. 63146. 80±114.-2 5510.031表1各组大鼠肝小叶内肝HoC总体积与轮廓数密度(每m细胞数量)变化Table 1 Changes in total volume (mm3) and contour number density (number of cells per mm2) of hepatic oval cells in hepatic lobules of rats in each group胞体几乎为细胞核，胞质内细胞器较少，主要为线粒体与粗面内质网。这与Lotowska等与deVoS网等报道的HOC形态学特征近似，体视学定量研究结果显示：与对照组比较，肝纤维化组大鼠肝小叶内HOC总体积显著增加了8.53倍，其轮廓数密度显著增加了9.08倍本研究观察发现，单个HOC细胞的体积并未显著增加，因此肝小叶内HOC总体积的增加主要与HOC数量的增加有关。该研究结果从形态学定量角度证实了CCl4所致肝纤维化过程中伴随着大鼠HOC的大量增生。本研究结果为HOC在肝纤维化过程中的增生提供了可靠的形态学定量证据。HOC在肝纤维化中的作用尚存在争议,Awan等(通过将骨髓间充质干细胞诱导分化的HOC移植入肝纤维化小鼠中，发现其能靛嘘肝纤维化。Yang等"6)将TGF-1处理WB-F344HOC12h后发现，可通过上调人纤溶酶原激活抑制剂的表达抑制HSC活化，从而减轻肝纤维化。也有报道称，在肝纤维化动物模型和人肝纤维化组织中，HOC数量与肝纤维化程度呈正相关。邱德凯等通过对慢性肝病患者肝组织病理分析发现，HOC数量随着肝纤维化程度的加重而显著增高。本研究发现，与对照组比较，肝纤维化组窦周隙内胶原纤维大量增生，同时窦周隙内增生的胶原周围伴随着HSC与HOC大量增生.由此推测HOC可能与肝纤维化形成有关，其原因可能与HOC促进HSC增殖与活化有关。本课题组前期研究川证实CCL致肝纤维化大鼠窦周隙中胶原纤维总体积、HSC的总体积与数量显著增加。本实验中发现，在肝纤维化大鼠窦周隙内HSC增生的部位周围伴随着大量HoC增生.HSC活化转变成肌成纤维细胞分泌大量ECM是肝纤维化的中心环节9】。研究2”表明，在HSC就舌的过程中，HOC能够通过合成IL-6、血小板衍生因子、结缔组织生长因子、血管内皮生长因子与TGF-l等，促进HSC的活化与增殖，分泌ECM,加重肝纤维化。HOC除了能分化为肝细胞和胆管细胞外，还可以分化为HSC或肌纤维母细胞，直接参与ECM的沉积oWang等)用TGF-l处理肝纤维化小鼠模型中分离的HOC,能使其表达HSC标志物肌间线蛋白和胶质纤维酸性蛋白，分化为HSC,并上调ECM相关基因的表达。由此推测，在CCL诱导的大鼠肝纤维化过程中，CuI可能通过促进HOC增殖，激活HSC分泌大量ECM,从而参与肝纤维化形成。本研究认为HOC的大量增生可能与肝纤维形成有关。不同学者对HoC在肝脏分布的位置有不同的观点。FakIOr等【刈认为，HOC来源于Hcring管(又被称为微胆管或终末胆管)和肝门周小胆管；而BUrkC等124】研究认为，HOC存在于肝门周区和肝实质内本研究发现，在正常大鼠肝组织窦周隙内偶可见HOCz在肝纤维化组大鼠,HOC主要位于充满胶原纤维的窦周隙内与肝细胞间，本研究支持HOC位于肝实质即肝小叶内的观点。本课题组前期通过体视学方法结合光镜研究结果表明，大鼠小叶间(包括汇管区)占肝脏总体积的比例仅有0.4%(正常组)和2.7%(肝纤维化组)，由此说明，无论是在大鼠正常肝组织还是纤维化肝组织汇管区占整个肝脏的比例非常低，加之尽管透射电镜的高放大倍数能准确分辨出HOC,但由于其视野很小，本实验随机取得的电镜标本制作观察到汇管区的概率极低，而体视学定量研究需要的样本量较大，因此本实验未分析汇管区HOC的增生情况。本实验的另外一个局限性在于未做新生幼稚细胞的免疫组化染色进一步确定其为HOCe在下一步实验中本课题组将在光镜下采用免疫组化标记HOC,并对肝小叶间(包括汇管区)和小叶内的HOC进行定量研究。肝纤维化的治疗仍是医学界难题，本研究结果显示肝纤维化过程中HOC大量增生，随着对HOC生物学特性以及在肝纤维化进展中作用的深入研究，相信在未来针对HOC的靶向干预有望成为肝纤维化防治的有效措施。伦理学声明：本研究方案于2021年12月24日经由川北医学院实验动物伦理委员会审批，批号：2021119。利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。作者贡献声明：彭彬、杨正伟、梅小平负责设计研究方案并提供指导性支持；王川林、刘全明、杨霞负责数据收集、整理与分析；王川林、彭彬负责论文撰写与修改。参考文献：IIROEHLENN.CROUCHETB,BaumertTF.LiVerfibrosis:mcchanisticconceptsandtherapeuticPCrSPCCIiVCSJJ.Cells.2020,9(4):875-918.DOI:10.3390cclls9040875.2 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