嵌合抗原受体-T细胞免疫治疗桥接异基因造血干细胞移植患者的免疫重建.docx

嵌合抗原受体-T细胞免疫治疗桥接异基因造血干细胞移植患者的免疫重建异基因造血干细胞移植是治疗血液系统恶性肿瘤的最有效方法之一，但对于难治易复发的B急性淋巴细胞白血病(refractoryorreIapsedB-1ineageacuteIymphobIasticleukaemia,RR-B-A1.1.)即使高强度化疗及移植复发率依然很高，随着嵌合抗原受体(ChimeriCantigenreceptor,CAR)-T特异性靶向肿瘤细胞的应用，国内外很多研究共同表明1,2,3在RR-B-A1.1.患者移植前使用CAR-T细胞免疫治疗用于清除残存的肿瘤细胞，从而减少了此类患者的移植后复发率，改变了RR-B-A1.1.患者预后。然而免疫功能重建与移植预后、感染及移植物抗宿主病等移植相关并发症密切相关，是移植后患者共同面对的问题。本研究对比描述CAR-T细胞免疫治疗与常规治疗的非CAR-T细胞免疫治疗患者病例特征及在移植前后多时间点免疫细胞亚群的差异性，进而探讨维持CAR-T治疗桥接移植后患者免疫功能状态正向重建的影响因素。资料与方法一、对象回顾性分析2018年8月至2021年12月期间在北京陆道培医院接受CAR-T细胞桥接异基因造血干细胞移植(alIogeneichematopoieticstemceIItranspIantation,alIo-HSCT)治疗的所有急性B淋巴细胞白血病(B-A1.1.)患者61例病历资料，其中行自体CD19-CAR-T细胞免疫治疗患者32例，非CAR-T细胞免疫治疗患者29例。随访截至2022年1月31日，采用电话随访或查阅门诊/住院病历方式获得患者生存信息。入组患者均已签署知情同意书，本项目已通过陆道培医疗伦理委员会批准(DPEC202108)。二、移植类型与预处理均选用清髓性预处理，其中全身照射(totalbodyirradiation,TBI)/CY方案52例(TBl200CGY义5次；CY1.518gm2,-5至-4d),BU/CY方案9例(BU0.81.2mg/kgQ6,-9至-6d;CY1.51.8gm2,-5至-4d)。兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(rabbitanti-humanthymocyteimmunoglobulin,ATG)57.5mg/kg,于-5至-2d分次给药。三、造血干细胞来源和回输采用重组人粒细胞集落刺激因子动员后骨髓联合外周血干细胞输注，重组人粒细胞集落刺激因子剂量为7.510.0gkg,患者回输前34d开始应用至采集结束。四、移植物抗宿主病预防采用环抱素+霉酚酸酯+短疗程甲氨蝶吟方案。从预处理-9d开始应用环抱素(起始剂量为每日1.252.5mg/kg,静脉谷浓度维持IOol50ngml）及霉酚酸酯（用量为每日30mgkg,口服）。无移植物抗宿主病（graft-versus-hostdisease,GVHD）患者1个月内霉酚酸酯减停，1个月后环抱素改为口服（谷浓度维持100ngml）o短疗程甲氨蝶吟指第1天15mgm2,第3、6、11天分别为10mgm2,次日亚叶酸钙6mgX2次解救甲氮蝶吟。五、入组标准及相关疾病诊断标准1 .急性B淋巴细胞白血病：依照EGI1.1995诊断积分系统4结合WHO2016诊断分型标准5。2 .CAR-T细胞免疫治疗：纳入标准为（1）诊断为难治性/复发性急性B淋巴细胞白血病，即难治指诱导治疗未能取得微小残留阴性的完全缓解；复发指完全缓解后外周血或骨髓任一肿瘤负荷25%,或微小残留阳性，或出现新发髓外病灶；（2）流式细胞术检查肿瘤细胞表达CDI9。排除标准为（1）合并其他进展期的恶性肿瘤。（2）合并严重/持续感染且未得到有效控制。（3）存在症状性的中枢神经系统紊乱，如痴呆、癫痫等。3 .移植物抗宿主病：根据2020年版NCCN临床实践指南，造血细胞移植-移植前受者评估以及移植物抗宿主病的管理方法定义6。4 .病毒激活与转阴：应用PCR方法检测血浆中人巨细胞病毒、EB病毒DNA定量500拷贝/ml,定义为病毒激活。六、标本采集及上机前处理移植物骨髓标本为采髓术后经乙二胺四乙酸二钾抗凝的骨髓血24ml,外周标本为重组人粒细胞集落刺激因子动员后进入外周循环的单个核细胞。在患者接受造血干细胞移植术后第1、2、3、6、8、10、12个月，采集受者肝素抗凝静脉血5ml行流式检测。所有样本按照厂家说明书推荐方法进行标记。胞膜管为：每管样本中按照细胞计数加入样本,保证加入2义106个细胞数量，按照说明书在每支试管中加入520I不同荧光素标记的抗体，充分混匀后常温避光孵育15min,加入3mlBDFACS1.ysingSolution溶血素，混匀后室温避光孵育10min,300Xg离心5min去上清，加入3ml磷酸盐缓冲液混匀后离心洗涤1次，加入0.5ml磷酸盐缓冲液上机检测。七、主要仪器及试剂流式细胞术试剂组合方案，第1管为CD3FITC/CD56PECD45PerCPCy5.5CD4PECY7CD19APCCD8APCCY7,第2管为CD4FITCCD127PECD3PerCPCy5.5CD25APCo第3管为CD45FITC/CD34PE/7-AAD。淋巴细胞亚群抗体为旷博公司产品，CD34检测试剂（SCE）为美国BectonDickinson公司产品。溶血素为美国BectonDickinson公司产品。流式细胞仪为美国BectonDiCkinSon公司3激光10色BD1.yric流式细胞仪，获取软件为BDFACSiite,每样本管获取30万个活细胞，分析软件为BDDiva8.O.2o八、统计学分析用SPSS23.0统计软件进行数据分析。首先对所有计量资料行正态性检验，符合正态分布的计量资料以±S表示,2组均数比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以M(Q1,Q3)表示，比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以百分数表示，两组间比较采用2检验。不同结局下各单因素的生存曲线采用Kaplan-Meier法，1.og-rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。结果对比2组患者临床特征，结果发现CAR-T组患者移植前病史长，预处理方案中ATG用量低，移植物CD34+细胞回输剂量高，移植后环匏素应用时间短。而移植前疾病状态，受供者性别/血型是否相合，TBl预处理，移植后巨细胞、EB血症及GVHD发生率，总生存率(overaIIsurvival,OS)均差异无统计学意义，见表1图1。CAR-T组较非CAR-T组患者移植前血清IgA、IgG、IgM及外周血总淋巴细胞、T淋巴细胞(CD3+T)、辅助性T细胞(CD4+T)、细胞毒性T细胞(CD8+T)、B淋巴细胞绝对计数低，见表2。2组患者移植后监测时间点上述各免疫细胞亚群细胞绝对计数差异均无统计学意义(P>0.05)见表3。表161例RR-B-A1.牌者病历资料.6.4飘州0病例特征mtCAR-T细胞治疗组（29例）CAR-T堀88洽行组（32«）统计值梅物S-生科死亡（例）27/225/7/3.2240.073毒杳性别美/女（例）19/1020/12无无受供者性疑不合（制）1912/=3.3460.067受供含血益不管（制）1313-0.3880.610移的族居融（例）2629K=O.0221.000诊素距诙移植天数d,Q.Q）854.00(327.25.1228.75)604.00(223.00.1244.00)(/-263.0000.004惠舍格植葭免望塔里三（g1.）2G矶"(0Q)】6.78(5.27.9.26)5.54(4.04.7.09)29,5000.017IaAloX,M(Q1,Q3)1.03(0.63.1.56)0.18(0.06.0.49)3103.500<0,001Mg1.,(,()0.40(0.26.0.71)0.18(0.05.0.30)-166.000<0,001全身幽预处理方案（CGY）2428-02720.724ATG长遵剂量mg/kg,0.Q)7(5.7.5)5(5.7.5)(288.5000.018移植吻834+叵贰剂量（×106kg）4.51(4.00,5.93)5.91(4.23.6.02)=291.00.012急性移植吻抗君王鼎（例）16190.1100.799建性移植物杭有主轲（的）119=0.6640.586环旭索应用时长d./Q,0）197.00(102.50.450.50)167.00(119.25.299.50)-421.0000.001巨日抱我备血役（例）1318/-0.7940.446EBfm（例）46"02730.735注：RR-BA1.1.为送8易昼急性淞血病,CAR-T为云合护源受体Teg.ATG为免抗人闷蝉爆免疫黑第3q未CART0.2/CART后P=O.0730200400600800100012001400生存时间（d）注：MSVHD为急性移植物抗宿主病,CGVHD为慢住移植物抗痞切图161例患者GVHD及生存曲线表261例患者移植前外周血淋巴细胞亚群绝对计数个,"(Q,G)CAR-T如胞沿行淋巴侬gCD3+TCD4+TCD8+TB淋巴!8CD4/CD8目杀伤烟胞Treg1052.00860.00162.50478.0033.000.25115.005.00无(545.75.1(391.00.1(66.00.(143.50,(8.00.(0.15.(50.00.(3.00.812.50)419.75)384.75)992.25)220.00)0.43)223.00)9.00)833.00686.146.00343.22.000.25115.004.50有(335.00*1(233.00,1(40.50.(56.50.924.00)(6.00,(0.15.(50.00.(3.50.727.50)307.00)327.50)186.00)0.54)217.00)7.50)6®404.0406.0494.0483.5498.0798.5618.5520.0PS<0.001<0.0010.0020.0010.0020.8050.0550.295注：CAR-T为故管抗原受体BiS.Treg为丽性TasS表361例思者移植后不同月份外周血淋巴细胞亚群绝对计数项目CAR-T1个月2个月淋巴酶("W,0.0)】元296.00(106.00,550,00)668.00(319.50.1154.00)有238.00(93.50,377.75)634.00(287.00,1440.00)CD3+T个*"(Q.0)1无214.00(52.50,404.50)214.00(52.50,404,50)f3238.00(93.50.377.75)634.00(287.00,1440.)CD4+T个J,"(0,0)无27.00(7.00.74.00)62.00(3750.155.50)有5.00(1.00.34.75)61.00(29.00.127.00)C+T个*"(Q.0)无177.00(35.00.227.50)380.00(177.00679.00)有51.00(1.25.184.75)299.00(189.00,675.00)B淞巴班8个川."(0.6)1无5.00(1.50,13,00)8.(6.00,18.50)有7.00(4.25.13,25)6.00(3.00.18.00)OWCDe塞.”(0.0)无0.21(0.15.030)0.20(0.10.0.28)有0.17(0.07.052)0.20(0.10.0.29)自然天窗与Sl个/W."(0.0)】无61.00(27.50.94.50)92.00(44.00.170.50)S74.00(22.00.212,25)149.00(57.00.221.)Treg(l,f(1.3)无0.00(0.00,0.00)0.00(0.00.2.00)有0.00(0.00.0.00)0.00(0.00.1.00)项目CAR-T8个月IO个月12个月淋巴您SI个U,"(Q.Q)无1627.00(899.00.2427.50)1671.00(1017.25,2165.50)2172.00(1168.00.3941.00)驾1196.50(556.50.2110.50)1641.00(1290.25,2855.25)1576.00(759.00,2869.50)CD3F4%”(0,0)无1627.00(899.00.2427.50)1671.50(1017.00.2165.50)2172.00(1168.00,3941.00)有1196.50(556.50,2110.50)1641.00(1290.25,2855.25)1976.00(1012.50,3813.50)CM+T(个/U,"(Q.Q)无213.00(108.50.390.25)277.50(145.00,425.25)363.00(184.00,644.00)有179.00(74.75,433,25)355.50(180.25,513.25)315.00(181.50,939.00)CDeF个/%附(Q,Q)无976.50(450.25,1711.75)783.50(520.25,1338.00)974.00(528.,1825.00)有625.00(254.50.1126.25)994.50(465.50,1544.25)9S4.00(480.00,143430)B淋吸81个."(Q.6)无89.50(14.25,254.50)132.50(41.00.409.50)312.00(27.00.594.00)有108.00(13.50,288.50)178.00(19.25,452.00)280.00(109.50,576.00)CD4CD奉,"(0.0)无0.24(0.12.0.33)0.26(0.19,0.42)0.33(0.16.0.52)0.33(0.17.0.53)0.40(0.22.0.93)0.46(0.30.0.85)U然和承a88【个/M."(0，0)】无146.00(72.25,251,50)175.50(108.25,274.25.)184.00(89.00,430.00)e132.00(44.00.270.00)125.00(71.50,254.25)168.(107.00359.50)Treo(个/W,0，6)无15.00(5.50.24,00)17.00(8.50,27,00)26.00(6.00.37.00)打17.00(4.50,22.00)20.00(6.,31.)32.(5.50.41.00)注：CAR-T组与非CAR-T是毒含多植后不角月份外匿由淞巴限8各亚群比皎,差异均无培计学意义(40.05)讨论靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗为难治性易复发的急性B淋巴细胞白血病的治疗带来巨大的进展,在行aIIo-HSCT前使用CAR-T治疗特异性杀伤肿瘤细胞，降低患者alIo-HSCT后的复发率，将生存率从20%30%提高到70%90%1,7o研究表明，CAR-T细胞免疫治疗常伴有免疫相关不良事件，如白细胞减少、细胞因子释放，如果在28d内不能恢复则会进一步引起感染、神经症状及溶细胞综合征等8,Fried等9的团队报道中性粒细胞减少症、血小板减少症、神经毒性、感染和细胞因子释放综合征3级或3级以上不良事件的发生率分别为38%、23%、18%、29%和19%。并且他们的研究表明，回输第30d时有58.8%患者发生了低丙种球蛋白血症，在治疗过程中74.1%发生了新的低丙种球蛋白血症。故CAR-T细胞免疫治疗后机体免疫的恢复也是国内外共同关注的问题，尤其是在桥接移植之后如何诱导免疫耐受的同时又保留移植物抗白血病效应，是能否解决移植后感染、复发等并发症的根本途径，更是影响患者生存的关键因素。我们的研究表明移植前CAR-T细胞免疫治疗患者较非CAR-T治疗患者血清中IgA、IgG、IgM水平低，且外周血中总淋巴细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞计数也低，自然杀伤(naturaIkiIler,NK)细胞及Treg细胞差异无统计学意义。提示CAR-T细胞免疫治疗患者在造血干细胞移植前存在更差的免疫状态，这可能与CAR-T患者移植前化学治疗病史长(899d>203.5d),第一次缓解期患者比例低(31%<65%),CAR-T细胞免疫治疗毒性相关，这与国际的研究结果一致9o造血干细胞移植后影响免疫重建因素主要包括，患者年龄，干细胞来源、供受者H1.A不相容性、供者移植物去T细胞应用、GVHD,用于预防和治疗GVHD的免疫抑制剂的使用等10o供者淋巴细胞在移植后早期活化，产生移植物抗白血病效应来清除肿瘤细胞，预防复发，同时伴随着移植物抗宿主病。而这一过程主要是依靠抗原提呈细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞、B细胞和自然杀伤细胞之间复杂的相互作用11。AIIo-HSCT后CD8+T细胞在移植后早期恢复，而CD4+T细胞要在移植后12年完成免疫重建12,13,这导致了部分患者在移植后1年内CD4+T/CD8+T持续处于倒置状态14oCD4+T、CD8+T恢复情况与预处理方案、患者年龄，移植物CD34+T输注剂量，移植类型相关12,13oATG为选择性T淋巴细胞免疫抑制剂，在应用后早期就会出现总淋巴细胞降低，治疗开始的2周后所有T淋巴细胞亚群绝对计数断崖式下降，40%患者在应用后3个月淋巴细胞计数才能恢复至50%以上。故在本研究中，当CAR-T患者移植前外周血总淋巴细胞计数1000个/uI时，尝试适当减量了ATG以减少对淋巴细胞进一步的杀伤。由于ATG不会造成浆母细胞分化，故对B细胞计数影响不明显15,16o而环抱素通过对Thl细胞亚群的抑制，减少白介素2的产生，从而阻断T抑制细胞的激活。虽然延长对患者环抱素使用时间可以更持久解除T淋巴细胞对于造血的负调控，但对于T淋巴细胞亚群的恢复不利16O所以对于应用更低ATG剂量的CAR-T患者，我们在移植后3个月内将环抱素血药浓度维持偏高，6个月后逐渐减停，减少急性GVHD发生几率的同时尽快促进免疫重建的恢复。此外研究表明移植后第3个月CD4+T细胞绝对计数200X1061.,CD8+T细胞绝对细胞375个I的患者，有更低的感染发生率及移植相关死亡率，有更高的OS13,17o在我们的统计数据中，2组患者CD8+T细胞绝对计数早在移植后1个月就达到正常范围下限，2个月500个/uI。CD4+T细胞绝对计数在移植后10个月才逐渐恢复，截至12个月随访终点仍徘徊于低限范围，CD4+T/CD8+T比例持续倒置。这与国外报道数据相似12,13,只是2组患者CD4+T细胞绝对计数更快，推测可能与我们提高了CD34+细胞输注剂量相关。NK细胞是机体重要的免疫细胞，来源于CD34+造血干细胞，在骨髓内发育成熟。大多数文献表明NK细胞在全相合造血干细胞移植后1个月即可达到供者水平18o本研究中虽然移植前非CAR-T组患者NK细胞数值较高，但移植后早期1、2、3个月CAR-T组NK细胞重建得更快，6个月后2组持平。移植后3个月内2组GVHD、EB病毒、巨细胞病毒血症无差别。与既往研究结果相一致，即NK细胞移植后1个月恢复至正常水平，回输高CD34+干细胞剂量的CAR-T组更有助于NK细胞亚群重建18oAlIo-HSCT后第12个月内外周血B细胞数量极低甚至检测不到，后逐渐恢复至移植后1年达到正常水平，慢性GVHD患者B细胞数量恢复更延迟。B细胞功能恢复依赖于T细胞的重建，尤其是CD4+T细胞19o无论是CAR-T细胞免疫治疗患者还是非CAR-T细胞免疫治疗患者，移植后前3个月内B淋巴细胞绝对计数均在个位数，6个月逐渐恢复正常，较文献报道中恢复迅速，这可能依赖于本研究中同时相对较快的CD4+T细胞恢复。我们的研究发现，虽然与传统经化疗桥接移植的非CAR-T细胞免疫治疗患者相比，CAR-T细胞免疫治疗的RR-B-A1.1.患者移植前免疫功能状态更差，但经过减低预处理中ATG剂量，增加移植物CD34+输注剂量，并在移植后定期随访免疫细胞亚群绝对计数，观测免疫重建障碍时较早停用环胞素，未增加GVHD发生几率的基础上，使其达到与非CAR-T细胞免疫治疗患者相似的免疫重建时间和质量，差异无统计学意义的OS,极大程度上改善了RR-B-A1.1.患者的预后。异基因造血干细胞移植，最根本的是造血系统与免疫系统的双重重建。尽管CAR-T细胞免疫治疗桥接异基因造血干细胞移植后免疫重建过程尚未完全清楚，但根据既往移植免疫重建规律与经验，移植后定期检测外周血免疫细胞亚群，有助于了解免疫重建过程，对临床诊疗提供依据。