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常见组蛋白修饰调控滋养层细胞谱系分化的研究进展2024摘要胎盘是决定妊娠建立及维持胎儿正常生长发育的重要器官，其介导了母胎间的复杂对话。滋养层细胞是执行胎盘功能的一类重要细胞类型，在胎盘发育过程中，滋养层干细胞可分化为多种滋养层细胞亚型，从而维持胎盘的结构和功能。组蛋白修饰可通过调控染色质的结构及基因转录参与滋养层细胞谱系的建立和维持。本文系统性总结了重要组蛋白甲基化及乙酰化修饰调控滋养层干细胞分化及胎盘发育的复杂作用及机制。【关键词】胎盘；组蛋白修饰；滋养层干细胞滋养层细胞是执行胎盘功能的特化上皮细胞类型，参与了子宫螺旋动脉重塑、母胎血液循环建立、营养物质交换、激素分泌等重要生理过程1-2。在胎盘发育过程中，滋养层干细胞分化形成不同的滋养层细胞亚型，以维持胎盘结构完整性及功能多样性2。滋养层干细胞可通过自我更新维持一定的分化潜能，其干性缺失及后期分化异常可导致胎盘结构及功能障碍，与子痫前期、宫内生长受限、流产等不良妊娠结局密切相关3-7。现有研究表明，组蛋白修饰作为一种重要表观遗传调控方式，可通过调节滋养层细胞谱系分化过程中特异基因的时空表达参与滋养层细胞干性的维持及命运决定8。本文主要针对代表性组蛋白甲基化及乙酰化修饰在滋养层干细胞分化中的作用进行综述。一.,滋养层细胞分化与胎盘发育在人类胚胎发育早期，受精卵通过卵裂逐步形成由外周的滋养外胚层(trophectoderm,TE)及内侧的内细胞团(innercellmassJCM)组成的囊胚，从而构成胚胎植入及后续胎盘发育的起点9。所有胎盘滋养层细胞亚型均来自于滋养外胚层细胞，主要包括细胞滋养层细胞(cytotrophoblast,CTB)、合胞体滋养层细胞(Syncytiotrophoblast,STB)及绒毛外滋养层细胞(extravilloustrophoblast,EVT)等10-11。在胚胎植入过程中，与子宫内膜上皮细胞接触的滋养层细胞发生初级合体化形成初级合体滋养层细胞，介导胚胎侵入子宫内膜上皮12。CTB具有高度自我更新及分化潜能，可通过细胞融合分化为多核结构的STB13o植入后,胎盘逐步形成初级绒毛结构，随后在此基础上不断发出小分支，形成树状绒毛小叶。在妊娠第17天左右，胚外中胚层嵌入胎盘绒毛结构内部形成绒毛间质，此时绒毛称为二级绒毛；随着绒毛中毛细血管及造血干细胞的出现，胎盘成熟的三级绒毛结构成功建立12,14胎盘绒毛分为锚定绒毛和漂浮绒毛，漂浮绒毛直接浸泡在母体血中，主要发挥物质交换作用，而锚定绒毛则将胎盘锚定到子宫中。锚定绒毛中生长旺盛的CTB可向母体蜕膜方向生长形成细胞滋养层细胞根columncytotrophoblastcells,CCCs),其末端的CTB离开CCCs分化成绒毛外间质滋养层细胞(interstitialEVT,iEVT)和血管内滋养层细胞(endovasculaEVT,eEVT)iEVT浸润子宫蜕膜深层，将胎盘绒毛牢固地锚定于母体子宫；eEVT侵入母体子宫螺旋动脉，将其改造成低阻抗、高通量血管，建立丰富的母胎血液循环供给15。上述滋养层细胞亚型与其他类型细胞进行复杂互作，是构筑母-胎界面上胎盘功能模块的重要细胞生物学基础。小鼠胎盘主要由迷路层和连接层组成16在胚胎4.5d(embryoday4.5,E4.5)时内细胞团对侧的壁滋养外胚层细胞分化为初级滋养层巨细胞，与ICM紧密接触的极滋养外胚层细胞分化为胚外外胚层(extroembryonicectoderm,ExE)和夕卜胎盘锥(ectoplacentacone,EPC)oExE进一步分化为绒毛膜滋养细胞层，最终发育为母胎物质交换的主要场所迷路层17。EPC则分化为次级滋养层巨细胞、海绵滋养层细胞和糖原滋养层细胞，执行内分泌及侵袭等多种功能18-19。小鼠和人胎盘结构虽然存在差异，但同属血绒毛膜胎盘，且在功能发挥及发育调控机制上较为相似，因此小鼠是目前研究滋养层细胞分化最常用的动物模型。二.组蛋白修饰表观遗传修饰是在不改变基因序列的前提下，通过DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA等方式调控基因表达的机制20o组蛋白是真核生物染色体的结构蛋白，由HkH2A、H2B、H3、H4组成，其中H2A、H2B、H3、H4构成八聚体并同缠绕的DNA形成核小体21。组蛋白修饰主要发生在组蛋白N端的赖氨酸和精氨酸残基上，包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，这些修饰通过特异性影响染色质的开放状态进而参与基因的表达调控22。现有研究表明多种组蛋白修饰在胎盘发育和功能维持过程中扮演重要角色，参与染色质结构改变及基因的转录调控，使基因按特定时序选择性地转录并表达相关蛋白，介导滋养层细胞谱系建立、维持和分化过程（图1）,进而调控胎盘结构建立及功能发挥过程。组蛋白修饰调控胎盘发育的作用总结于表1。三.组蛋白甲基化与滋养层细胞分化组蛋白甲基化是在H3和H4的N端赖氨酸或精氨酸残基上添加一个或多个甲基，此过程由Writer.Eraser.Reader等分子严格调控，参与胚胎发育、细胞分化、X染色体失活等生理过程39-40o在合子形成过程中，父源和母源基因组都需进行大规模组蛋白重编程，促使卵母细胞和精子结合后形成全能性胚胎；重编程紊乱可引起胚胎基因组激活异常，进而影响胚胎的正常发育过程41。组蛋白甲基转移酶作为Writer可催化组蛋白特定位点发生甲基化。不同位点的组蛋白甲基化对基因的表达调控呈现巨大差异，例如H3K9、H3K27、H4K20位点的甲基化与异染色质形成及转录沉默有关，在发育过程中对关键转录因子的抑制至关重要；而H3K4、H3K36、H3K79位点的甲基化主要在活跃基因编码区富集并促进转录42-43。此外，作用相反的两种组蛋白甲基化修饰(例如H3K4me3和H3K27me3)可同时定位在同一个基因的启动子区域上形成二价修饰，使基因处于待转录状态从而响应特定的发育信号并快速转录激活44。组蛋白去甲基化酶作为EraSer可去除甲基化修饰，包括赖氨酸特异性去甲基化酶(Lysine-specificdemethylase,LSD)和含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶(JmjCdomain-containingprotein,JMJD)两个家族。1.SD家族主要通过黄素腺苗酸二核苗酸依赖的胺氧化反应进行去甲基45,JMJD家族则依赖铁和-酮戊二酸的双加氧酶反应实现特定位点甲基的擦除46。下面我们针对在胎盘发育过程中发挥重要作用的典型组蛋白甲基化修饰进行阐述。1. H3K9甲基化与滋养层细胞干性维持：H3K9甲基化主要由甲基转移酶SUV39Hl/2、SETDBkG9a及去甲基化酶LSD、JMJD家族协同调控。滋养层细胞谱系分化的关键转录因子上存在动态H3K9甲基化修饰,H3K9甲基化修饰改变可造成滋养层细胞分化异常进而引起胚胎致死表型23,47。赖氨酸甲基转移酶SUV39亚家族的SUV39H1和SUV39H2催化组成型异染色质区域的H3K9me3修饰23,470过表达Suv39h1可导致胚胎中与多能性相关基因MycxKlf4及谱系决定基因PdgfraxOCt4、Tead4、Gata6表达下调，在囊胚阶段滋养外胚层错误表达NANOG,从而导致细胞命运决定紊乱23o此外在小鼠滋养层干细胞(mousetrophoblaststemcellfmTSC)中敲降Suv39h1可导致CdX2、EomesxGata3等mTSC标志物丢失，诱导小鼠滋养层细胞分化相关标志物PH和Tpbpa表达，提示Suv39h1在mTSC的自我更新中尤为重要24oSUV39H2在滋养层干细胞中高表达，其可直接催化滋养层细胞分化相关基因Foxo4sCited2、Adm上的H3K9me3,从而抑制mTSC分化;在mTSC中敲降Suv39h2可引起mTSC干性标志物Cdx2和Bmp4表达下调,滋养层巨细胞分化标志物R113d1表达上调，促使mTSC分化为TGC25o另一种组蛋白甲基转移酶SETDB1通过H3K9甲基化修饰，促进染色质压缩进而抑制基因转录48。在正常胚胎发育过程中ICM来源的小鼠胚胎干细胞(mouseembryonicstemcellzmESC)通常无法分化为滋养层细胞，但是Setdbl缺失的mESC中CdX2、Tcfap2a和Handl的H3K9甲基化减少，TGC标志物PHxPI2和PIf表达上调，并呈现滋养层巨细胞形态，表明在早期胚胎发生过程中Setdbl缺失可促进mESC向滋养层谱系发育26。虽然Setdbl缺失的mESC可分化为滋养层细胞，但是无法从该mESC中分化获得mTSCf推测mTSC干性维持可能需要Setdbl的参与。在mTSC中敲降Setdbl可导致mTSC标志物减少,而海绵滋养层细胞和滋养层巨细胞标志性分子表达增加且呈现出滋养层巨细胞的形态，表明Setdbl在mTSC干性状态维持过程中不可或缺27。组蛋白H3K9甲基化修饰水平不仅受到组蛋白甲基转移酶的影响，同时还需组蛋白去甲基化酶协同调节。组蛋白去甲基化酶LSD1可去除H3K9的单甲基化和二甲基化修饰促进基因的转录激活49。Lsdl全身敲除小鼠胚胎出现早期致死。Lsdl缺失的mTSC中干性标志物Cdx2和Eomes的转录水平迅速下降，E-钙黏蛋白、B连接素等与细胞紧密连接相关基因表达减少，提前出现分化特征，提示Lsdl缺失可降低分化起始阈值28。此外，Lsdl缺失可诱发mTSC分化路径错误：促进细胞融合形成合胞体滋养层细胞，损害mTSC既定体外分化为海绵滋养层细胞和TGC的能力。与小鼠不同的是，在人滋养层细胞分化过程中LSD1激活分化相关基因，LSD1可以催化ERVW1、CGA和CGB启动子区域的H3K9me2去甲基化并与转录因子GATA2相互作用促进RNA聚合酶II募集从而激活基因转录，调控滋养层细胞分化形成合体滋养层细胞50。综上所述，组蛋白H3K9甲基化修饰可以动态平衡多能性转录因子及分化决定基因的表达水平，从而参与滋养层细胞干性维持及谱系建立过程。2. H3K27甲基化与滋养层细胞功能亚型的分化:H3K27甲基化主要由多梳蛋白复合物2(polycombrepressivecomplex2,PRC2)催化，PRC2的催化亚基EZH1/2与调节亚基EED、SUZ12形成多聚体，催化H3K27甲基化从而抑制基因转录51-52oEzh12和Suzl2缺失引起小鼠绒毛膜尿囊融合障碍，导致小鼠胚胎致死29-30oEED是ICM及TE谱系中H3K27甲基化的关键调控因子,在TE中异位表达Eed可增加Cdx2和Gata3的H3K27me3修饰水平，导致囊胚植入障碍31。EED在ICM谱系中高表达,mESC中敲降Eed可导致Cd×2和Gata3表达增多促进mESC向mTSC的错误分化31;Wang等32构建的Eed部分失活胚胎可以正常植入但是在E11.5时出现胚胎致死。Eed突变体的EPC末端高表达Mash2(Mash2可促使EPC向海绵滋养层细胞分化)从而抑制细胞分化成TGC,说明Eed可以调控Mash2从而影响滋养层细胞正确分化。H3K27me3可与H3K4me3同时修饰基因的启动子区域，使二价基因处于待激活状态,H3K27me3修饰可使分化相关的二价基因处于抑制状态从而维持胚胎干细胞的多能性，H3K27me3修饰的去除可导致二价基因激活，促使细胞启动分化进程53。在人原始多能干细胞向滋养层细胞分化的过程中，PRC2介导H3K27me3修饰发挥决定性调控作用54通过PRC2抑制齐IJUNU999去除人原始多能干细胞中的H3K27me3修饰，引起GATA2、GATA3、KRT7以及VGLL1滋养层基因激活，促使人原始多能干细胞获得类似人滋养层细胞的形态，并进一步分化为细胞滋养层和成熟的绒毛外滋养层，提示PRC2可限制人原始多能干细胞向滋养层细胞系的分化，抑制PRC2可促进多能干细胞向滋养层细胞命运的转换55o此外PRC2可与牛磺酸上调基因1(taurineUpregulatedgene1,TUG1)相互作用并调节NodalALK7信号通路从而调控人滋养层细胞迁移侵袭。PRC2与TUG1互作受损可导致Nodal启动子处H3K27me3水平下降，促进Nodal转录并激活下游ALK7z导致基质金属蛋白酶2表达降低，损害滋养层细胞侵袭能力56。综上，组蛋白H3K27甲基化修饰对于滋养层细胞的早期命运决定以及滋养层细胞功能亚型的分化均具有重要调控作用，H3K27me3水平的异常及缺失可能与胚外组织发育异常导致的早期胚胎丢失密切相关。3.其他组蛋白甲基化修饰与滋养层细胞分化：H3K4me3在近端启动子和转录起始位点附近富集并促进基因激活57。在子痫前期胎盘中缺氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor,HIF)相关IncRNA-HEIPP启动子上H3K4me3修饰增多从而上调IncRNA-HEIPP表达水平，导致滋养层细胞侵袭力降低，促进子痫前期的发生发展58。H3K4me3的修饰水平与胚外组织发育密切相关，H3K4me3去甲基化酶KDM5B的缺失不仅可导致囊胚中滋养外胚层细胞数量减少，引起胚胎植入障碍；还可导致ExE中胚胎发育相关基因的H3K4me3修饰增多,胎盘呈现迷路层变薄而海绵滋养层增厚现象59o止匕外，组蛋白精氨酸甲基化也可调节滋养层细胞分化，组蛋白精氨酸甲基转移酶PRMTs催化精氨酸形成单甲基精氨酸、对称二甲基精氨酸及不对称二甲基精氨酸60。Prmtl缺失引起EPC组织发育障碍，导致胚胎在E6.5时死亡33-34o4.间接调节滋养层细胞分化的组蛋白甲基化修饰：在胎盘发育过程中，组蛋白修饰可通过影响母-胎界面多细胞互作来间接影响滋养层细胞分化。组蛋白甲基转移酶EHMT2(G9a)催化H3K9me12,抑制基因转录；G9a全身敲除小鼠胚胎在E9.5时TGC凋亡增多,绒毛膜尿囊融合不完全，在E12.5前致死35-36。有报道称，G9a可通过影响胎盘内皮细胞基因表达从而间接引起滋养层分化紊乱，内皮细胞特异性敲除G9a的小鼠呈现出胎盘内皮细胞增殖和迁移受损，迷路层变薄、血管延伸和扩张缺陷，海绵滋养层过度生长并侵入迷路层，胚胎在E16.5时死亡；此外，内皮特异性敲除G9a可导致胎盘Notch信号通路下游的Rbpj等效应因子表达下调，提示G9a可激活Notch信号通路，平衡内皮细胞和滋养层细胞的增殖分化，促进胎盘血管成熟61。值得注意的是，越来越多的研究证据表明组蛋白修饰酶分子也存在不依赖于表观修饰的作用机制，因此还需进一步明确上述基因缺陷小鼠胎盘发育异常的表型是否完全由表观修饰紊乱所致。四.组蛋白乙酰化与滋养层细胞分化组蛋白乙酰化是继组蛋白甲基化修饰之外，另一个备受关注的组蛋白修饰，由组蛋白乙酰转移酶(histoneacetyltransferase,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDACs)协同调控。HATs将乙酰辅酶A的乙酰基转移到核心组蛋白赖氨酸残基的氨基上,中和组蛋白N末端带正电荷的赖氨酸残基，降低组蛋白对DNA的亲和力，使末端核小体移位，引起染色质开放并增加转录因子的可及性，从而促进基因转录62-63。组蛋白乙酰化修饰是动态可逆的过程，其去乙酰化主要由HDACs执行64oHDACs通过增加核心组蛋白N端的正电荷密度，加强组蛋白与DNA的相互作用，从而阻断转录因子结合DNA65组蛋白去乙酰化酶主要包括Zn2+依赖的经典HDAC家族和NAD+依赖的Sirtuin家族羟典的HDACs家族可分为三类：第一类与RPD3同源，位于细胞核中，主要包括HDAC1-3,8;第二类可在细胞核和细胞质间穿梭，主要包括HDAC4-7,9,10;第三类则只有HDAC1166-67oHATs和HDACs之间的动态平衡控制染色质结构和基因表达。1 .组蛋白乙酰化与滋养层细胞融合：小鼠滋养层干细胞分化过程中，H2AK5、H2BK5、H2BK12sH4K8、H3K9的乙酰化水平发生明显改变38用典型HDACs抑制剂曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)处理mTSC可引起日f5、EomesxGata3等mTSC特异性基因下调及CdX1、Cebpa.Kitl等滋养层谱系基因上调，mTSC失去细胞紧密连接，提示HDACs缺失可能促进mTSC分化68omTSC在体外培养过程中倾向于向滋养层巨细胞(trophoblastgiantcellJGC)和海绵滋养层细胞分化,HDACs的抑制造成mTSC合体滋养层细胞标记分子Tfeb高表达，而几乎检测不到mTGC以及海绵滋养层细胞经典分子PlhTpbpa的表达，这表明HDACS对于滋养层细胞谱系命运决定尤为重要68oARNT作为HIF的亚基参与HDACs的活性调控过程，mTSC中Arnt的缺失导致HDACs核定位信号减少及酶活性降低，引起组蛋白乙酰化修饰增加，促进mTSC向合胞体滋养层细胞分化提示HDACS与HlF共同维持滋养层细胞正常的谱系分化69o细胞滋养层细胞融合分化为合胞体滋养层细胞是人胎盘发育过程中的关键事件，此过程伴随合体滋养层发育及功能相关基因中H3组蛋白乙酰化修饰水平的改变。TSA处理人胎盘绒毛膜癌细胞BeWo,诱导其分化48h后，发现合体化相关基因ERVW1、ERVFRD1及0V0L1表达水平下降提示抑制HDACS活性可阻碍滋养层细胞的合体化70o研究表明Hdad和Hdac2同时敲降可导致人合体滋养层细胞数量减少，表现为CGB分泌减少、E-钙黏蛋白表达增多及细胞滋养层干细胞标志分子TP63持续表达;但单独敲降Hdad或Hdac2,并不影响细胞合体化的发生，表明Hdad和Hdac2需共同作用调控滋养层细胞的分化融合进程70o此外HDAC2还可介导HTR-8/SVneo细胞中microRNA-183启动子区域的H4去乙酰化，通过miR-183FOXA1IL8作用轴促进细胞的增殖、迁移和侵袭71oHDAC5是11类HDACs家族成员，在BeWo细胞中HDAC5可以调控非组蛋白GCM1的乙酰化水平，抑制其转录活性，进而阻碍BeWo细胞合体化进程。而CAMP可激活EpacVRapVCaMKI信号通路并磷酸化HDAC5第256和第498位丝氨酸，使其出核从而阻碍其与GCM1的相互作用，促使细胞分化进行72o上述结果提示,HDAC家族可以通过组蛋白及非组蛋白乙酰化修饰的方式调控滋养层细胞分化。NAD+依赖性去乙酰化酶SIRT1在小鼠胎盘中广泛表达,Sirtl缺失导致E13.5胎盘变小、迷路层发育异常以及海绵层变薄37oSirtl缺失造成mTSC干性下调,经典的干性标志物ESrrb、Cdx2表达降低，诱导细胞过早分化。这可能是由于Sirtl缺失引起TGF0ACtiVin信号通路下游的Smad23表达减少所导致的星然敲除Sirtl可促进mTSC分化，但是迷路层标志物GCm1、SynA和海绵层标志物Tpbpa、PI2表达减少，mTSC分化速度变慢，这可能与Stat3和PPARYB号通路下调有关73-74o2 .组蛋白乙酰化与滋养层细胞上皮间质转换：在胎盘发育过程中，滋养层细胞经过上皮间质转换（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）从而获得迁移侵袭能力，Vimentin在emt中发挥重要作用75,sirti可通过蛋白质互作使滋养层中的Vimentin去乙酰化从而维持EMTzHTR8SVneo细胞中SIRT1缺失可引起VIMENTIN的乙酰化修饰显著增加，E-钙黏蛋白的表达水平上调，阻碍EMT进程并损害滋养细胞的侵袭和迁移76。CBPp300是腺病毒ElA结合蛋白，主要作为核蛋白的辅助转录因子发挥作用，其可充当支架蛋白介导DNA结合的转录因子与转录复合物的连接从而导致转录共激活77。此外，CBPp3OO还具有组蛋白乙酰转移酶HAT活性，通过乙酰化组蛋白赖氨酸残基使染色质开放程度增加从而促进转录78o在去除成纤维细胞生长因子4诱导分化的培养条件下，mTSC中H2AK5、H2BK5/12/15,H3K9及H4K8的乙酰化水平下降，提示组蛋白去乙酰化可能参与mTSC的干性维持。在mTSC中Cbp缺失引起H2A和H2B乙酰化修饰减少,导致mTSC形成具有侵袭特性的类间充质细胞，表明Cbp参与mTSC上皮状态的维持过程38o此外，CBP可与DNA结合蛋白Rel的启动子和预测增强子区域结合并建立乙酰化修饰。在mTSC中降低CBP介导的乙酰化可抑制Rel的表达，导致EMT诱导因子Slug和Twist表达增多，mTSC出现间质细胞形态79。由此可见，组蛋白去乙酰化主要参与滋养层细胞上皮间质转换过程，对EVT的谱系分化路径具有重要意义。五总结及展望胎盘是维持胎儿正常生长发育的重要器官，滋养层细胞是胎盘中主要执行功能的细胞。滋养层细胞命运决定、谱系分化及功能发挥等进程涉及复杂的基因表达网络，组蛋白修饰可调控滋养层谱系特异性基因及分化相关基因的表达，在维持滋养层细胞干性及谱系命运决定过程中发挥重要作用。目前越来越多的研究也表明表观修饰在滋养层分化中至关重要。由于获取人类早期胎盘样本存在伦理等各种条件限制，使得探究人滋养层谱系分化极具困难性及挑战性。研究组蛋白修饰对滋养层细胞命运决定的影响，需要优化多尺度及多模型的研究策略，综合利用细胞培养、动物模型及临床样本等体内外研究体系进行系统性分析。近年来人滋养层干细胞体外培养体系、3D胎盘类器官、单细胞测序、多组学分析等新模型及新方法的不断运用，为我们深入探究表观修饰对滋养细胞谱系分化过程的动态调控提供了强有力的技术支持。然而现有研究主要聚焦于滋养层谱系分化过程中单个表观修饰调控因子的功能探究，未从全局角度出发综合分析基因组的修饰特征及表观修饰的远距离相互作用，缺乏对滋养层细胞特异性表观修饰特征的全景式解析。滋养层谱系分化异常是许多妊娠相关疾病的重要诱因，可导致子痫前期、胎儿宫内生长受限、复发性流产等妊娠不良结局。越来越多的证据表明，子痫前期等疾病胎盘存在表观修饰异常特征。因此，探究滋养层谱系分化异常的表观遗传修饰改变，有利于深入对胎盘源性妊娠疾病致病机理的理解，并为妊娠疾病的预防和治疗提供新的思路和策略。