伤寒、副伤寒实验诊断方法.docx

附录A伤寒、副伤寒实验诊断方法A.1病原学检测方法A.1.1标本采集A.1.1.1血液标本宜在病程的第1周第2周采集。成人无菌采集静脉血5m1.-10m1.或按照血培养瓶说明书采集全血进行全血培养；婴幼儿及儿童采血量不应超过患者总血量的1%（-一般3m1.5m1.）,具体采血量参考血培养瓶说明书。己用抗生素者可直接全血做培养（使用有抗生素吸附剂的血培养瓶进行细菌培养），血液凝固者可取血凝块搅碎后做培养。为提高检测阳性率，可使用双相血培养瓶手工或者自动化培养，双位点（无菌采集病人两个位置静脉血）双瓶培养（需氧+厌氧培养）。A.1.1.2粪便标本宜在病程的第3周第4周采集患者新鲜粪便2g3g或肛拭子立即送检。如不能在2h内送检，可用卡里-布莱尔（CarTy-Blair）运送保存培养基，在冷藏条件下48h内送检。为提高培养阳性率，也可视病人病程并结合临床症状（如第2周第3周）采集血液与粪便同时进行培养。A.1.1.3骨髓标本整个病程均可采集。已使用抗生素、其他标本培养阴性的疑似伤寒、副伤寒患者可做骨髓培养。A.1.1.4尿液标本宜在病程的第1周第2周采集，留取中段尿IOnl1.于无菌容器中及时送检。如不能在2h内送检，在冷藏条件下保存不超过8hoA.1.1.5胆汁标本利用十二指肠引流法或胆囊穿刺法或手术直接法无菌采集胆汁10m1.,直接注入血培养瓶中，血培养瓶于室温下尽快送检。A.1.2分离培养A.1.2.1血液标本手工培养时，按1:10加入血液增菌培养基或葡萄糖胆盐肉汤培养基，置于36°C±1°C孵育，分别于1d,2d,7d转种血平板或营养琼脂平板，置36°C±1C培养24h48h。自动化培养时，仪器信号报警提示有细菌生长时，取培养瓶内增菌液接种于血平板或营养琼脂平板，置36°C±1C培养24h48h；自动化细菌培养时间一般为5d,对于已培养5d的阴性瓶，一般不需常规盲传或终点转种，但临床诊断疑似伤寒感染者应常规盲传或终点转种，避免漏诊。A.1.2.2粪便标本取新鲜粪便标本直接接种于沙门菌科玛嘉显色平板和麦康凯（MaC）琼脂平板上，置36±1培养18h24ho直接接种同时应进行增菌培养。A.1.2.2.2增菌培养取新鲜粪便标本1g或肛拭子接种于9In1.亚硒酸氢钠增菌培养基（SF）或者亚硒酸盐煌绿增菌培养基（SBG）,置36°C±1°C培养18h24h后，接种到沙门菌科玛嘉显色平板和MaC琼脂平板上，置36°C±1°C培养18h24h。A.1.2.3骨髓标本取骨髓液做直接分离或增菌分离培养，方法同血液标本，见A.1.2.1。A.1.2.4尿液标本将中段尿离心后取沉渣，加入7m1.亚硒酸氢钠增菌培养基（SF）或者亚硒酸盐煌绿增菌培养基（SBG）,置36°C±1°C培养18h24h后，接种到沙门菌科玛嘉显色平板上，置36°C士1培养18h24hoA.1.2.5胆汁标本将胆汁注入血培养瓶进行增菌分离培养，方法同血液标本，见A.1.2.1。A.1.3鉴定A.1.3.1菌落形态在血平板和MaC培养基上形成中等大小、无色半透明、表面光滑的菌落，菌落边缘整齐。在沙门菌科玛嘉培养基上形成中等大小、紫红色、表面光滑、边缘整齐的菌落。A.1.3.2形态染色为革兰阴性短杆菌。A.1.3.3初步生化鉴定从分离培养平板上挑取3个5个可疑菌落，分别转种到以下培养基：双糖铁斜面（KlA）或三糖铁斜面（TSl）和动力-靛基质-尿素半固体（MIU）各一支，36°C±1°C培养18h24h,观察生化反应（见表A.1）。表A.1伤寒、副伤寒沙门菌初步生化鉴别表菌种KIA/TSIMIU斜面/底层产气H2S动力靛基质尿素大肠埃希菌A/A-+/-志贺菌属K/A-+/-伤寒沙门菌K/A-+/-甲型副伤寒沙门菌K/A-乙型副伤寒沙门菌K/A-丙型副伤寒沙门菌K/A-注：A产酸（黄色）；K不产酸（红色）：+阳性；-阴性：+/-多数阳性；-/+多数阴性。A.1.3.4系统生化鉴定肠杆菌科细菌各属之间，在生化方面有类似之处，抗原方面也可有交叉反应，有时可出现不典型的菌株，因此，仅做一般生化反应和血清学鉴定，不能做出正确的结论，应进一步做系统的生化反应鉴定。可采用商品化的系统生化鉴定板条进行鉴定。伤寒、副伤寒沙门菌的主要生化特性见表A.2。系统生化不能区分乙型与丙型副伤寒沙门菌，仍应使用传统血清分型或分子血清分型方法确认。A.1.3.5质谱鉴定除生化鉴定外，可疑菌落可进行质谱鉴定。质谱鉴定能够鉴定沙门菌属，但不能区分血清型。血清型鉴定仍应使用传统血清凝集试验或分子血清分型方法确定。质谱鉴定步骤严格按照厂家说明书进行。表A.2伤寒、副伤寒沙门菌主要生化特性菌型动力葡的糖乳糖麦芽糖甘露醇蔗糖硫化氢靛基质尿素甲基红VP枸椽酸盐卫茅醇木胶阿拉伯糖赖氨酸脱竣酶鸟氨酸脱皎酶伤寒沙门菌-V-甲型副伤寒菌-/+-乙型副伤寒菌-+/-丙型副伤寒菌-注：-阴性（不产酸）；+阳性（产酸）；产酸产气；+/-多数阳性，少数阴性：-/+多数阴性，少数A.1.3.6分子生物学鉴定除生化鉴定及质谱鉴定外，可疑菌落可利用分子生物学检测进行鉴定。分子生物学检测能够区分沙门菌属、伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌。具体方法见A.1.4。A.1.3.7血清玻片凝集符合伤寒、副伤寒沙门菌生化反应或质谱、分子生物学鉴定为沙门菌的菌落，转种至营养琼脂36°C±1C孵育18h24h后做玻片凝集试验，并设生理盐水对照。方法：挑取营养琼脂培养物，先用O多价血清玻片凝集，凝集者，再选用02、。4、。6.7和09因子血清凝集（伤寒和丙型副伤寒沙门菌的Vi抗原能阻碍O抗原凝集，必要时制成菌悬液经100水浴30min破坏Vi抗原后，取沉淀物再进行O血清凝集）。O抗原确定后，将菌株点种于诱导琼脂或软琼脂平板上，36°C±1C培养8h16h后，用H因子血清凝集（见表A.3）o若未获得II相因子（若有），则使用对应的I相诱导血清因子进行软琼脂反相诱导，取琼脂边缘生长菌苔进行血清凝集试验确定II相因子。沙门菌血清玻片凝集是传统血清分型方法，分子血清分型方法可作为补充，但需经过验证评估后使用。表A.3伤寒、副伤寒沙门菌血清凝集反应菌型O抗原H抗原Vi相II相伤寒沙门菌d-甲型副伤寒沙门菌a-乙型副伤寒沙门菌b-丙型副伤寒沙门菌C注：（）表示该抗原可能缺失。A.1.4分子生物学检测A.1.4.1核酸制备血液、骨髓、胆汁样本增菌液11111.离心集菌，取菌沉淀用1001.TE悬菌后，经100水浴Iomin后离心，取上清，用做PCR反应模板。可疑单菌落悬于1001.无菌纯水中，采用相同方法制备模板。也可使用商品化试剂盒按厂家说明书进行核酸制备。A.1.4.2荧光PCR引物引物序列见表A.4,引物纯度宜为PAGE或HP1.C级别。表A.4沙门菌荧光PCR引物及反应条件弓序列(55-3,)1循环,tI潴弓而修I弓移1C30s；然后95C5s,抠1C25s,共40个循环T-男相11刃3形11渤弓影抠UT-lII-IVI1;濯彩救创I-A.1.4.3荧光PCR反应体系PCR反应体系及组成见表A.5。可使用商品化试剂盒，按操作说明书进行操作。表A.5沙门菌荧光PCR反应体系组分体积1.1X荧光PCR预混液上游引物（10mol1.）下游引物(10mol1.)T"探针(10mol1.)模板1I-T-总体积T-A.1.4.4结果判定A.1.4.4.1增菌液结果判定伤寒沙门菌阳性：沙门菌属荧光PCR和伤寒沙门菌荧光PCR同时阳性（即Ct值均W33）。甲型副伤寒沙门菌阳性：沙门菌属荧光PCR和甲型副伤寒沙门菌荧光PCR同时阳性（即值均W33）O沙门菌阳性：仅沙门菌属荧光PCR阳性（Ct值W33）。A.1.4.4.2菌落结果判定伤寒沙门菌阳性：沙门菌属荧光PCR和伤寒沙门菌荧光PCR同时阳性（即Ct值均W30）。甲型副伤寒沙门菌阳性：沙门菌属荧光PCR和甲型副伤寒沙门菌荧光PCR同时阳性（即值均W30）。沙门菌阳性：仅沙门菌属荧光PCR阳性（Ct值W30）。A.1.5菌株管理建立菌株保存档案，详细记录菌株的来源、分离的时间和地点、取材患者的基本信息及流行形式（暴发、散发等）。各级医疗机构所分离的菌株送辖区疾病预防控制机构进行复核鉴定。菌株保存、运输、管理按相关要求进行。A.1.6质量控制实验室所用的培养基、试剂、诊断血清及实验过程等均要进行质量控制。A.2肥达反应A.2.1标本采集宜在急性期和恢复期各采集一次血清，进行肥达反应试验。A.2.2原理用标准伤寒及甲、乙、丙型副伤寒沙门菌0、H抗原菌液（诊断菌液）与稀释的待检血清反应，根据凝集效价判断血清中有无相应抗体。常用于辅助诊断。A.2.3试剂伤寒及甲、乙、丙型副伤寒沙门菌诊断菌液。A.2.4方法试管或凹塑板管外稀释法。或按照厂家说明书进行.A.2.5操作步骤A.2.5.1试剂制备取伤寒及甲、乙、丙型副伤寒沙门菌诊断菌液，用生理盐水稀释成含菌1.OX10"m1.悬液备用。A.2.5.2待检血清稀释准备6支大试管，标明稀释度。第1管：取9.5m1.生理盐水，加入0.5m1.待检血清，混匀，制成1:20血清稀释液。第2管：取第1管血清稀释液5m1.,力115m1.生理盐水，混匀，再取5m1.加至第3管。第3管第6管：同上步骤稀释。此时第1管第6管，稀释度分别为1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640（每次稀释时应更换吸头）。A.2.5.3分装待检血清稀释液准备8排小试管，每排7支，或4X8凹塑板2个，标明稀释度及抗原。各排第1管（孔）：每管（孔）加第1管血清稀释液0.5m1.。各排第2管（孔）：每管（孔）加第2管血清稀释液0.5m1.。各排第5管（孔）第6管（孔）：同上步骤分装。第7管（孔）：只加生理盐水作空白对照。A.2.5.4加抗原将相应抗原（TO、TH、AO、AH、BO、BH、CO、CH）加入每排各稀释度管（孔）中，每管（孔）0.5m1.。最终血清稀释度分别为1:40,1:80,1:160,1:320,1:640,1:1280。或按照厂家说明书进行相应抗原的稀释。A.2.5.5孵育将已加好血清稀释液和抗原的试管（凹塑板）振摇混匀后，置36°C±IC温箱或水浴孵育过夜，次日观察结果。A.2.6结果观察轻轻取出试管或凹塑板，观察管（J1.）底凝集物的多少及性状。阳性结果表现为液体澄清，颗粒均匀平摊于整个管（孔）底；阴性菌体集中一点，沉积于孔底，与空白对照相同。以出现50%（+）凝集的血清最高稀释倍数作为该血清的凝集效价。A.3标本检验程序见图A3由液.骨*1液骨值曲汁*倒液£达反应血液增胸端奔液IId.2d.WMK冷IIf板业MMVN的(SF)遗(sbg>m36X±ITIehYhWcCJ1ITM步室化,富IlClATSKM1U>IiIiJ不产,或层产酸或产声4V】16用n味用界系统生化或履通吱分f生,学笠定第域生化矍定拨告绐果图A.1伤寒、副伤寒沙门菌检验程序A.4结果报告A.4.1病原学结果报告根据生化试验或质谱或分子生物学鉴定和血清凝集结果，符合伤寒或副伤寒沙门菌的，报告“检出伤寒沙门菌”或“检出X型副伤寒沙门菌”。粪便、尿液、胆汁标本经分离培养后，如无可疑菌，报告”未分离出伤寒、副伤寒沙门菌”；血、骨髓标本培养至5d或7d如无细菌生长，报告“经5d或7d培养无菌生长”。无菌体液（血、骨髓、胆汁）中伤寒或副伤寒沙门菌核酸检测阳性，报告“XX标本伤寒沙门菌核酸阳性”或“XX标本X型副伤寒沙门菌核酸阳性”或“XX标本沙门菌核酸阳性”。A.4.2血清学结果报告报告被检血清对伤寒沙门菌O抗原、伤寒沙门菌H抗原、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌的凝集度。如果第1孔（管）无凝集，报告“Vl:40"；第6孔（管）呈“+”或更强凝集，报告“21:1280”。