霍乱弧菌的分离与鉴定、霍乱诊断的相关实验技术、鉴别诊断.docx

附录A（规范性）霍乱弧菌的分离与鉴定A.1标本的采集患者的粪便、呕吐物或（和）肛拭子为适宜采集的标本。水样便或呕吐物采样量般为1m1.3m1.,成形便采取指甲大小的粪量；肛拭子可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3cm5cm（幼儿约2Cm3cm）处旋转后取出，以看到棉拭子上沾有粪便为佳。也可采集患者日常生活物品的涂抹拭子标本和家居环境的样本。A.2标本的送检采得的标本应立即接种于培养基，不能立即接种的，应放入pH8.49.2的碱性蛋白陈水或文腊二氏保存液或插入Cary-Blail半固体保存培养基中，放置于冷藏箱内保存、送检。粪便或呕吐物等标本与运送培养基或增菌液的比例约为1:10,肛拭子应插入5m1.运送培养基或增菌液中。A.3分离培养A.3.1直接分离培养对急性期患者水样便标本在进行增菌培养的同时，可取接种环或用肛拭子直接划线接种强、弱选择性平板各一个，置37C培养18h24h。A.3.2增菌分离培养标本接种于pH8.49.2的碱性蛋白陈水中置37增菌6hTh后，从菌膜下表层取一接种环培养物，划线接种于强、弱选择性平板各一个，置37C培养18h24h。必要时可取0.1m1.一次增菌的表层培养物于5m1.的新鲜碱性蛋白陈水中进行二次增菌培养。也可选用分离效果较好的弧菌显色琼脂。A.3.3选择性培养基常用强选择性培养基包括庆大霉素琼脂、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖（TCBS）琼脂和四号琼脂等。弱选择性培养基一般使用碱性营养琼脂等。A.3.4霍乱弧菌菌落特征A.3.4.1碱性营养琼脂霍乱弧菌在碱性营养琼脂上37°C培养18h24h后为无色、圆形、透明或半透明、表面光滑、润湿、扁平或稍凸起、边缘整齐的菌落，菌落直径一般约为2mm。A.3.4.2庆大霉素琼脂和四号琼脂霍乱弧菌在庆大霉素琼脂和四号琼脂上的菌落大小和形态特征与碱性营养琼脂上的菌落特征相似,但透明性略差，多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深。A.3.4.3TCBS琼脂霍乱弧菌在TCBS琼脂上生长呈现为黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐的菌落。A.3.4.4弧菌显色琼脂霍乱弧菌在弧菌显色琼脂上生长菌落呈现特征性的颜色，不同品牌的弧菌显色琼脂菌落颜色不同，具体参考厂家说明。A.4菌株鉴定A.4.1菌株初筛A.4.1.1玻片凝集试验从选择性平板上挑取疑似菌落接种于普通营养琼脂，37°C培养18h24h后取纯培养物与霍乱弧菌Ol群多价血清和0139群血清做玻片凝集，进行Ol群和0139群霍乱弧菌的初筛。在1min内出现肉眼可见的明显凝集颗粒，但在生理盐水中不产生凝集者为阳性，在Imin内不出现凝集颗粒者判为凝集阴性。01群菌株应进一步用小川和稻叶血清型特异性的诊断血清做玻片凝集确定血清型别。玻片凝集试验中需要注意以下方面：a）使用的血清效价范围及结果判定参考厂家说明书；b）碱性营养琼脂、庆大霉素琼脂及四号琼脂上的疑似菌落如足够大，可直接挑取疑似菌落进行玻片凝集试验。但TCBS培养基上的疑似菌落常因培养基中蔗糖的影响造成难以乳化，不宜直接进行玻片凝集试验，应挑取可疑菌落，先接种普通琼脂纯培养后再作玻片凝集；c）同一标本存在01群和0139群霍乱弧菌混合感染的可能，每份标本挑选不低于5个的疑似菌落逐一进行鉴定。干粉血清也可以配制01群和0139群混合多价进行初筛。A.4.1.2氧化酶试验用粕金环或牙签取生长在普通琼脂或其他无碳水化合物成份的非选择性培养基上的新鲜培养物涂抹在清洁的滤纸上，然后滴加2滴3滴1%盐酸四甲基对苯二胺水溶液或商品化试剂，如培养物在20s内出现紫红或紫蓝色，有的呈紫黑色，判断为氧化酶试验阳性，不显色判为阴性。A.4.1.3产毒株检测通过检测CT毒素的编码基因CH48来确认是否为产毒株，按附录B。A.4.2菌株保存和上送菌株运送和保存应符合国家有关规定。经初筛阳性或可疑阳性的菌株,在发出初步鉴定报告的同时，应尽快送当地疾病预防控制中心进行密核鉴定。复核结果符合01群或0139群霍乱弧菌产毒株的菌株，按菌株管理的要求进行保存与上送；如复核结果出现疑问，应尽快将菌株上送省级或省级以上疾病预防控制中心（参比实验室）进行确认分析。A. 4.3菌株复核菌株的复核鉴定应以纯培养物为基础，至少应包括以下项目：革兰染色、黏丝试验、氧化酶试验、血清分型、动力试验、CT毒素基因检测（按附录B）,也可选择生化鉴定条或全自动微生物生化鉴定系统。凝集反应不典型或者怀疑为彦岛型的菌株应增做试管凝集试验。菌株血清群的鉴定也可用聚合酹链式反应（PCR）方法扩增01群和0139血清群脂多糖特异性基因力来确定（按附录B）。A.5霍乱弧菌系统生化鉴定霍乱弧菌的系统生化鉴定按表A.1进行。表A.1部分弧菌科细菌的系统生化鉴定项目乱菌霍孤拟态弧菌副溶血弧菌创伤弧菌藻菌溶弧河弧菌弗尼斯弧菌海鱼弧菌霍利斯弧菌麦氏弧菌辛辛那提弧菌娑鱼弧菌最适生长温度/°C373737373737372525,363725,3537氧化酶+-+黏丝实验+/-+/-+/-+硝酸盐还原+靛基质+-+/-+/-+V-P试验+/-+/-+-+/-尿素酶-/+-+-赖氨酸+-+/-/+1.鸟氨酸+/-+/-1.-精氨酸-+/-葡萄糖产气-+-/+-项目乱菌霍弧拟态弧菌副溶血弧菌创伤弧菌溶藻弧菌河弧菌弗尼斯弧菌海鱼弧菌霍利斯弧菌麦氏弧菌辛辛那提弧菌鲨鱼弧菌乳糖-÷+/-+-÷-麦芽糖+D-甘露醉+/-+-+-+/-蔗糖+-/+-+/-1.-阿拉伯糖-+-+-+-+-纤维二糖-+-/+-/+-+-水杨素-+-+-明月交素+-不盐陈中长验在同量水生试0%NaCl+-3%NaCl+6%NaCl+/-+/-+/-+/-+/-+8%NaCl-+-+/-+/-10%NaCl-+/-0/129敏感性IoHgSaSRSRRRSRSRR150gSaSSSSSSSSSSS注：S敏感；R抗性。a部分0139群霍乱弧菌为抗性Ro附录B(规范性)霍乱诊断的相关实验技术B.1霍乱弧菌特异性核酸PCR检测8.1.1 检测靶标基因CT毒素是霍乱弧菌的主要致病因子，对其编码基因的检测可用于对霍乱弧菌产程株的确认。菌株血清群的检测也可用PCR方法扩增Ol群和0139群霍乱弧菌脂多糖特异性基因力来确定。种特异性基因位点的PCR扩增也可纳入霍乱弧菌的检测鉴定中。检测应在符合PCR检测要求的实验室中进行，实时荧光PCR方法较普通PCR操作更简便，可避免交叉污染。8.1.2 样品核酸制备8. 1.2.1粪便、呕吐物或肛拭子标本用商品化的核酸提取试剂盒提取粪便、呕吐物或肛拭子标本中的细菌核酸作为PCR检测模板，标本前处理和核酸提取操作方法参照相应试剂盒说明书。B. 1.2.2疑似菌落挑取庆大霉素等选择性琼脂或普通营养琼脂等平板上的1个2个可疑菌落，以Im1.生理盐水稀释后，用核酸提取试剂盒提取DNA作为PCR检测模板。另一个替代方法是将1个2个可疑菌落于2001.纯水中煮沸IOmin,冰浴5min,100Oormin12000r/min4C离心5min,取21.31.上清液作为检测模板。B.1.2.3碱性蛋白月东水增菌培养液从增菌培养液液体表面菌膜下缘处取1m1.2m1.的培养液，10OOOiVmin12()()0r/min离心3min,弃上清，沉淀用Im1.纯水重悬，用核酸提取试剂盒提取DNA作为PCR检测模板。另一个替代方法是沉淀用Im1.纯水重悬、再离心、洗涤2次后，加1001.2001.纯水重悬煮沸Iomin,冰浴5min,100OOrZmin-12000r/min4离心5min,取上清液作为检测的模板。B.1.3普通PCR检测B.1.3.1CT毒素基因检测检测CT毒素基因ar48的参照引物序列见表B.1,扩增参数：预变性94°C,5min；94,30s,60,30s,72C,30s,30个循环；最后72C延伸7min。B.1.3.201/0139群霍乱弧菌脂多糖特异性rfb基因检测扩增01/0139群霍乱弧菌脂多糖特异性侬基因的参照引物序列见表B.1,扩增参数：预变性94°C,5min；94,30s,55,30s,72,45s,30个循环；最后72°C延伸5min。B1.3.3霍乱弧菌种特异性hlyA基因检测扩增霍乱弧菌种特异性/办A基因序列的参照引物序列见表B.1,扩增参数:预变性94°C,5min;94C,30s,55C,30s,72,45s,30个循环；最后72延伸5min。表B.1霍乱弧菌普通PCR检测参照引物检测基因引物名称核甘酸序列(5,-3O产物大小ZbpCtxABClxA-PlCtcagacgggatttgttaggcacg302clxA-P2TctatctctgtagcccctattacgOrfbOlrfb-PlGtttcactgaacagatggg192Olrfb-P2Ggtcatctgtaagtacaac检测基因引物名称核甘酸序列(5,-3,)产物大小Zbp0139OI39rfb-P1Agcctctttattacgggtgg449O139rfb-P2GtcaaacccgatcgtaaagghlyAhlyA-PlGcaaacagcgaaacaaatacc497hlyA-P2TccaccccaccagtcaccB.1.4实时荧光PCR检测B.1.4.1商品化实时PCR检测试剂盒选择使用经国家药品监督管理机构批准的商品化实时荧光PCR检测试剂盒。B.1.4.2CT毒素基因、01/0139群特异性基因和种特异性基因实时荧光PCR检测霍乱弧菌CT毒素基因5A3、01/0139血清群脂多糖特异性力基因和种特异性MWW基因的TaqMan实时荧光PCR检测参照引物和探针序列见表B.2。扩增循环条件为：95,30s；95C,5s,60,20s,循环40次，在退火阶段检测荧光。Ol群和0139群特异性出基因可用作双重检测。表B.2霍乱弧菌实时荧光PCR检测参照引物和探针序列检测基因引物和探针名称核甘酸序列(5*-30CtxABCtx-FCttccctccaagctctatgctcCtx-RTacatcgtaataggggctacagagCtx-PFam-Acctgccaatccataaccatctgctgctg-BhqiOl小Olrfb-FGgaataactcaaggcgatgaagtgOlrfb-RTagagactcaccttcgatttcagcOlrfb-PFam-Aaacgggtaacgcaccacactggact-Biiqi01393O139rfb-FCgatggcgtgttcattagaaggO139rfb-RTccctttccacctcggtatttcO139rfb-PHex-Cggcaaactggcagcaaactcagca-BhqiompWompW-FTtgctgctaacgttggctttgOmpW-RCtgctttgtaggttgccgttgompW-PFam-Tgctcaatgatagctggttcctcaacgc-BhqiB.2霍乱弧菌快速辅助检测B.2.1胶体金免疫层析法目前可使用的霍乱弧菌胶体金快速免疫层析检测条较多，该方法主要检测Ol群和0139群霍乱弧菌抗原成分。胶体金免疫层析法的检出限一般为每毫升样本中1()5个菌体，轻型病例及带菌者调查中存在漏检的可能，需要进行增菌培养后检测，以提高检出率。B.2.2霍乱弧菌动力-制动试验在玻片的两侧各加1滴急性期病人的水样便，使用暗视野或相差显微镜镜检观察视野内是否有快速穿梭运动的细菌，若有即判断为动力试验阳性，否则判断为阴性。动力试验阳性的标本进行如下实验操作：分别加入1滴2滴霍乱弧菌01群或0139群特异性诊断血清，镜检观察若细菌运动停止，凝集成块，即制动试验阳性，否则为阴性。霍乱弧菌感染的诊断以加入特异性血清后的制动试验结果进行判断。这种特殊的动力-制动试验，可在儿分钟之内辅助做出初步诊断。该试验使用的特异性免疫诊断血清不加防腐剂，血清效价范围参考厂家说明书。附录C（资料性）霍乱的鉴别诊断C.1副溶血弧菌性肠炎多数起病急骤，有进食海（水）产品和（或）不洁食物史，潜伏期2h4d,常先吐后泻，常为水样或类似痢疾样脓血便，个别重型患者大便可有清水样或洗肉水样，排便前有肠鸣音，伴阵发性腹部剧痛。早期常有发热和其他中毒症状。大便培养检出副溶血弧菌。C.2大肠埃希菌性肠炎C.2.1肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）性肠炎潜伏期4h24h,有发热、恶心呕吐及腹部绞痛，腹泻呈黄水或清水样便，无脓血便,严重腹泻者亦可产生重度脱水，婴幼患儿常因此而危及生命。C.2.2肠致病性大肠埃希菌（EPEC）性肠炎主要症状为腹泻，大便为黄色和黄绿色蛋花样稀水便，量较多，常有特殊腥臭味，重症者可有脱水等全身症状。两者粪便培养均可获得相应的大肠杆菌。C.3沙门菌性肠炎由非伤寒沙门菌感染引起的以腹泻为主的肠道感染，人群普遍易感，婴幼儿（尤其1岁以内）更为易感。全年均可发病，夏秋季常见。潜伏期多为6h24h,急性起病，伴恶心、呕吐、腹痛、腹泻、发热或不伴发热。新生儿病情尤为严重，较易发生脱水和电解质紊乱。婴幼儿粪便多为黄色或绿色稀水便，亦可带有黏液和鲜血，大便培养可获得非伤寒沙门菌，常见的感染血清型有鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌等。C.4弯曲菌性肠炎弯曲菌可侵袭空肠及结肠引起病变。现已证实本菌亦可产生肠毒素而致病，潜伏期3d5d,起病初期有发热或有乏力、头痛及肌痛等症状，继而腹痛腹泻，大便为水样、黏液状、稀便或呈血性。严重病例可有重度脱水及循环衰竭。个别患者还可表现为急腹症。本类肠炎常对头胞菌素治疗无效。一般典型病例不难与霍乱鉴别，大便培养可检出弯曲菌。C.5病毒性胃肠炎常见病原体为人轮状病毒和诺如病毒，全年散发，秋冬季为高发季节，可呈流行性。其他如腺病毒、冠状病毒、星状病毒等亦可引起腹泻，鉴别主要依赖实验室检测。A组轮状病毒主要感染5岁以下婴幼儿，季节性明显，主要症状为发热伴水样腹泻和呕吐，部分患儿伴有呼吸道症状，严重者可伴脱水及代谢性酸中毒。本病在发病机制上与霍乱均属分泌型腹泻，在低年龄儿童多为水样便或蛋花汤样便，便量大，易出现脱水，粪便培养霍乱弧菌阴性，轮状病揖检测阳性。诺如病毒感染在各年龄人群普遍易感，可引起暴发流行，是成人病毒性腹泻的首位病原体。临床症状主要以腹泻和呕吐为主，水样便或稀便多见，可伴有腹痛、恶心、纳差、乏力、低至中度发热等。粪便标本诺如病毒检测阳性。C.6急性细菌性痢疾由志贺菌引起，潜伏期Id2d,起病急，以发热、腹痛、腹泻、里急后重、脓血便为主要特征，有全身感染中毒症状。重症患者可伴有头痛、全身肌肉酸痛甚至惊厥，可出现脱水和电解质紊乱相关症状。不典型的急性细菌性痢疾以婴儿多见，多无全身中毒症状、不发热或低热，腹痛较轻，粪便呈水样或稀糊样，含少量黏液，左下腹可有压痛，应注意鉴别。急性中毒性细菌性痢疾可出现高热，在儿童患者早期即可出现烦躁、谐妄、惊厥等，发病初期肠道症状不明显。成人患者主要表现为黏液脓血便频繁，呈里急后重。从粪便或肛拭标本等检出志贺菌可确诊。