重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9对小鼠胚胎肝脏干细胞诱导分化影响的体外研究.docx

重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9对小鼠胚胎肝脏干细胞诱导分化影响的体外研究陈聪,罗庆，毕扬，陈肯，田雯，迭小红，曹光彪，周建武，康权(400014重庆，儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室、儿科学重庆市重点实验室、重庆市(儿童发育重大疾病诊治与预防)国际科技合作基地，m庆医科大学附属儿童医院)摘要目的探讨重组腺病毒介导的小鼠骨形态发生蛋白-9(AdV-InBMp9)诱导小鼠胚胎肝干细胞向成熟肝细胞定向分化的影响。方法将已构建的表达小鼠BMP-9、肝细胞生长因子(HGF)和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒，分别感染小鼠胚胎肝干细胞，诱导其分化，然后采用半定量PCR,Real-timePCR.细胞免疫荧光、荧光素酶报告基因检测等方法检测甲胎蛋白(AFP).白蛋白(A1.B)和细胞角蛋白18(CK18)等肝细胞标志物的表达。结果半定量及Real-timePCR检测，与对照组相比，诱导7d后的BMP-9组、HGF组的AFP表达下降(P<0,05),A1.B的表达明显升高(P<0,05):细胞免疫荧光染色，诱导7d后的细胞胞浆内表达肝细胞特有的A1.B、CK18等蛋白，而对照组几乎无表达：荧光素酶报告基因检测，诱导Id、4d、7d的肝干细胞的A1.B表达较对照组明显升高(P<0.05)结论BMP9有诱导小鼠胚胎肝脏干细胞向成熟肝细胞样细胞分化的作用，并且BVP9对小鼠胚胎肝干细胞的诱导分化作用强于传统的肝干细胞诱导分化因子HGF。关键词骨形态发生蛋白9：小鼠胚胎肝干细胞；分化；重组腺病毒中图法分类号文献标志码ADifferentiationofmousefetalliverstemcellsinducedbyAdenovirus-mediatedmousebonemorphogeneticproteins-9invitroChenCong,1.uoQing,BiYang,ChenKen.TianWen，DieXiaohong,CaoGuangbiao,ZhouJianwu.KangQuan(MinistrjrofEducationKey1.aboratoryofChildDevelopmentandDisorders,Key1.aboratoryofPediatricsinChongqing,ChongqingInternationalScienceandTechnologyCperationCenterforChildDevelopmentandDisorders,Children'sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing.40014.China.)AbstractObjectiveTbexplorethedifferentialregulationofmousefetalliverstemcellstomaturehepatocytesafterinducedbyrecombinantadenovirus-mediatedmousebonemorphogeneticproteins9(Adv-mBMP9).MethodsThemousefetalliverstemcellsinfectedbytheconstructedrecombinantadenovirusexpressingBMP9、HepatocyteGrowthFactor(HGF)、andgreenfluorescentprotein(GFP).Toinvestigatetheregulationofstemcellsdifferentiation,alphafetoprotein(AFP),albumin(A1.B)andcellkeratin18(CK18)weretestedbyhalfquantitativePCR,Real-timePCR,cellularimmunefluorescenceandfluorescentelementenzymegenereport.ResultsComparedtotheGFPcontrolgroup,theexpressionofAFPinducedwithBMP9andHGF7dayslaterwasdecreasedtestedbyhalfquantitativePCRandReal-TimePCR(P<0,05).Onthecontrary,theexpressionofA1.Bwasincreased(P<0.05).Thespecificmarkerofmaturehepatocyte,A1.BandCK18havestrongexpressionafter7daysinductionwhichweretestedbycellularimmunefluorescenceassay,andthenegativeresultwereobservedwiththeGFPcontrolgroup.TheexpressionofA1.BafterId,4dand7dinductionwithBMP9andHGFinstemcellswassignificantlyincreasedcomparedtoGFPcontrolgrouptestedbyfluorescentelementenzymegenereport(P<0,05).ConclusionBMP9canpromotethemousefetalliverstemcellsdifferentialprocedureandinduceittothematurehepatocytes.Furthermore,thisfunctionisevenstrongerthanthetraditionalroleoflivercelldifferentiationfactorHGEKeywordsBMP9;mousefetalliverstemcells：differentiation;recombinantadenovirusSupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina().theNaturalScienceFoundationofChongqing(CSTC2OO8BB539O),theNaturalScienceFoundationofChongqing(CSTC2009BB5408)andKeysubjectofChongqingMedicalUniversity.(XBZD20I015).Cwcspondingauthor：KangQuan.Tel:86-23-,E-mail：基金项目国家自然科学基金()；重庆市自然科学基金(CSTC2008BB5390)：重庆市自然科学基金(CSTC2009BB5408)：重医校际重点课题(XBZD201015)通信作者康权，电话(023),E-mail：肝细胞移植在先天性肝病、终末期肝硬化的治疗中具有广阔的应用前景，但由于肝细胞在体外不能大量扩增且传代后不能保持其原有特性而难以推广应用，相反肝脏干细胞具有长时间持续增生的能力，能在体外扩增获得足够数量肝干细胞，但如何优化稳定成熟诱导体系使肝干细胞向肝细胞定向分化，是目前国内外研究的难点。如能在获得足够数量肝脏干细胞的基础上，采用某种方法进行干细胞修饰，定向诱导肝脏干细胞分化为成熟肝细胞，则该修饰后的肝干细胞必将在治疗各种急慢性肝病所致肝硬化、肝衰竭中发挥巨大的作用。近年来有文献报道BMP在肝脏重建再生方面”及抗肝纤维化的作用咒本课题组前期已经对BMP做了大量的基础工作3,并通过对BMP2-15的筛选，发现BMP9对骨髓间充质干细胞的定向诱导分化作用。本实验目的在于探讨重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白-9对小鼠肝干细胞的诱导分化作用，以探讨小鼠胚胎肝干细胞体外培养的最佳诱导因素，从而建立有效的诱导肝干细胞定向分化为肝细胞的体外培养体系，为临床.肝细胞移植打4基础。1材料与方法1. 1主要材料试剂小鼠胚胎肝干细胞细胞株HP14-19（美国芝加哥大学医学分子肿瘤实验室合作分离鉴定）、DMEM培养基、胎牛血清（GBICO公司）、Trizol试剂（Invitrogen公司）、RT-PCR试剂（Promege公司）、PCR试剂（北京天根生物公司）、Real-timePCR试剂（北京百泰克公司）、1.UmiFleXGIUC检测试剂盒（NEB公司）、POIybrene（SIGMA公司）、白蛋白抗体、CK-18抗体及二抗（SantaCruz公司）重组腺病毒介导的小鼠骨形态发生蛋白-9、重组腺病毒介导的小鼠肝细胞生长因子的构建由本课题组完成、保存，测序工作由芝加哥大学分子实验中心完成，dv-mBMP9.Adv-mHGF和Adv-GFP带GFP标签蛋白，可以在荧光显微镜下观察病毒的感染情况。Primer3.0软件设计引物，引物由深圳华大基因公司合成，引物序列见表1。表1RT-PCR引物序列基因引物序列（5,至3，）扩增片段（bp）A1.B上游：Ccagacattccccaatgc122bp下游：CaagttccgccctgtcatAFP上游：Acgaggaaagcccctcag125bp下游：GccattccctcaccacagCK18上游：Ctgggctctgtgcgaact125bp下游：AcagagccaccccagacaBMP9上游：Cgcagccttaacctcagc120bp下游：GttggaggcaggcgtagaHGF上游：Ttcccagctggtctatggtc237bp下游：TggtgctgactgcatttctcGAPDH上游：Acccagaagactgtggatgg171bp下游：Cacattgggggtaggaacac1.2 细胞培养及实验分组HP14-19细胞常规培养于含10%的胎牛血清的DMEM中，37、5%CO2的条件下培养于培养箱中，间隔48h左右，0.25%胰酶消化传代，备用。本实验分3组，AdV-mBMP9组;AdV-InHGF组;Adv-GFP对照组，每组设置复孔，于腺病毒感染后不同时间段观察、检测各项指标。1.3 病毒感染HP14-19细胞滴度的确定将HP14-19细胞按细胞密度20%左右接种于24孔板中，待细胞贴壁后密度达到40%左右，在相同细胞培养条件下，各组分别加入不同浓度梯度的Adv-mBMP9>Adv-mHGF>Adv-GFP,并且同时加入5lPolybrene试剂,摇匀后放入培养箱培养，并于腺病毒感染48h后，在荧光显微镜下通过感染细胞的萤光量来确定病毒的最合适感染滴度。1.4 检测重组腺病毒介导的BMP9在感染诱导HP14-19细胞后BMP-9的表达情况确定出上述各组不同浓度梯度下感染腺病毒的最佳感染滴度后，按上述条件接种于6孔板后按相同条件感染HP14-19细胞，并于诱导分化后7d提取细胞总RNA进行逆转录，按照试剂说明书操作，逆转录完成后分别以CDNA为模版扩增BMP9、HGF基因，并设置GAPDH为内参对照。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，分析条带，检测重组腺病毒感染HP14-19细胞后BMP-9、HGF基因是否成功表达。1.5 RT-PCR.Real-timePCR检测A1.B.AFP等肝细胞特征性标志物将HP14-19细胞细胞接种于6孔板中，当细胞密度达到40席左右后，每组分别加入适宜浓度的Adv-mBMP9>Adv-mHGF、Adv-GFP,同时加入10lPolybrene试剂，感染7d后，各组细胞分别加入ImlTriZOI试剂，按RNA提取试剂说明书提取细胞的总RNA,检测提取的浓度以及(260)/0(280)值，取lg进行逆转录,逆转录后的CDNA进行PCR反应,检测A1.B、AFP及CK18等肝细胞特征蛋白的mRNA表达水平，并设置GAPDH为内参对照。取扩增产物8l于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶成像系统成像并对电泳条带进行观察并照相，设置三个复孔，重复实验。1.6 细胞免疫荧光检测A1.B、CK78的表达将状态良好的HP14-19细胞传代接种于12孔培养板中，至40%左右密度时按各组预设条件处理后继续培养7d。细胞用PBS清洗23次，4%的多聚甲醛固定20min,含TritOnXTOO洗涤液漂洗3次后血清封闭，A1.B一抗37孵育4h,漂洗3次后标记二抗37°C孵育2h,相同条件孵育CK-18及其二抗，漂洗3次后DAPl染核5min,漂洗3次，抗荧光泯灭封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察荧光染色情况。1.7 荧光素酶报告基因检测A1.B-GIUC表达情况将携带Alb-Gluc报告基因的HP14-19细胞传代培养后，接种于24孔板中，接种密度约30%左右，待细胞贴壁后，各组分别加入适宜浓度的Adv-mBMP9>Adv-mHGF.Adv-GFP,同时加入5lPoIybrene试剂，摇匀后培养，分别在感染腺病毒后1、4、7d天取上清液，通过萤光素酶的活性检测培养上清液中的A1.B表达水平，设置三个复孔，重复实验，并进行比较分析。1.8 统计学分析采用SPSS13.0统计软件分析，计量数据以表示，组间比较运用单因素方差分析。2结果2. 1Adv-mBMP9>Adv-mHGF.AdV-GFP对HP1479细胞的感染Adv-mBMP9>Adv-mHGFAdv-GFP经包装细胞293细胞扩增纯化后，再加入5lPOIybrene试剂，可以有效的感染HPI4-19细胞。在倒置荧光显微镜下，通过观察病毒感染细胞后的萤光量的多少以及细胞形态变化，以确认病毒的最合适感染滴度。如图所示：图为感染病毒48h后荧光显微镜下感染细胞的萤光量对比，可以看出三组病毒感染滴度近似，为后续试诱导分化实验病毒感染量的均一性和可比性做准备(图1)。A:Adv-mBMP9诱导组；B:Adv-mHGF诱导组；UAdv-GFP对照组图1倒置荧光显微镜下观察Adv-mBMP9Adv-mHGF和AdV-GFP腺病毒有效感染HP14T9细胞48h后的感染情况(x100)2. 2重组腺病毒感染诱导HP14-19细胞后BMP-9基因的表达情况各组细胞分别加入ACIv-mBMP9、dv-mHGF.AClV-GFP感染处理7d后，取细胞提取总mRNA,RT-PCR后，电泳条带结果如图所示：在相同条件的处理下，GFP对照组BMP9、HGF均呈弱表达甚至无表达，而dv-mBMP9组、dv-mHGF组诱导后BMP-9、HGF均有表达，说明在未加入表达BMP-9和HGF的病毒感染前，HP14T9细胞中BMP9、HGF均呈弱表达甚至无表达；在病毒成功感染后，BMP-9、HGF基因在HP14-19细胞高表达,为实验的进一步进行提供依据（图2）OBMP9HGFGAPDH237bp120bp171bpA:AdV-DIBMP9诱导组;B:AdVFHGF诱导组；C:AdV-GFP对照组图2PCR检测AdVFBMP9、Adv-mHGF和AdV-GFP腺病毒有效感染HP14T9细胞7d后BMP9、HGFmRNA表达情况2.3腺病毒介导的BMP-9感染诱导HP14-19细胞后A1.B.AFP等mRNA的表达情况PCR凝胶电泳结果示：三组细胞分别加入Adv-mBMP9Adv-mHGF和Adv-GFP腺病毒诱导7d后，在实验诱导条件相同的情况下，Adv-mBMP9组、Adv-mHGF组的A1.B和CK18mRNA的表达明显高于GFP对照组，而Adv-mBMP9组和Adv-mHGF组AFP的表达情况均低于GFP对照组。Real-timePCR定量进一步检测，重复三次实验结果显示，组间对比可以看出，Adv-mBMP9组A1.B和CK18mRNA的表达明显高于对照组，甚至高于Adv-mHGF组，二者存在差异性，而Adv-mBMP9组和Adv-mHGF组AFP的表达情况均低于对照组（火0.05）（图3A、B）。幅l÷<zttE1：Adv-mBMP9诱导组;2：AdVFHGF诱导组；3：AdV-GFP对照组A:PCR分析结果B:RT-PCR分析结果a：P<0.05,与GFP对照组比较图3：Ad1.mBMP9、AdV-mHGF和AdV-GFP腺病毒有效感染HP14-19细胞7d后A1.B、CK18和AFP的mRNA表达情况2.4 腺病毒介导的BMP-9感染诱导HP14-19细胞后免疫荧光染色A1.B、CK18的表达情况细胞免疫荧光结果显示,在荧光显微镜下可见，对照组GFP红色荧光几乎无表达；提示对照组的几乎无肝细胞特征性标志物A1.B.CK18的表达；而在Adv-BMP9诱导组、Adv-mHGF诱导组中，两组均出现了明显的红色荧光，如图4所示Adv-mBMP9诱导组、Adv-mHGF诱导组均表达肝细胞特征性标志物A1.B>CK18,提示BMP-9、HGF均可诱导肝干细胞向肝细胞样细胞分化，其中BMP-9的诱导作用甚至强于HGF的作用（图4）。ABCA：AdV-GFP对照组B：AdVFHGF诱导组C：AdV-BMP9诱导组图4倒置荧光显微镜下观察Adv-mBMP9、AdvniHGF和AdvGFP腺病毒有效感染HP14-19细胞7d后各组A1.B和CK18的免疫荧光的表达（x200）2.5 荧光素酶报告基因检测感染诱导HP14-19细胞后A1.B的表达情况荧光素酶报告基因检测，重复三次实验读数结果如图显示，随着诱导时间的延长，诱导后的三组组内HP14-19细胞培养上清中A1.B-Gluc表达水平都逐渐升高，细胞荧光显示A1.B的表达水平也逐渐升高，与A1.B-Gluc的增高趋势一致。三组组间对比可发现，Adv-mBMP9组、Adv-mHGF组较对照组存在差异性。三组组间在第1天没有明显差异，随着时间的延长，差异性较对照组越来越明显，并且Adv-mBMP9组萤光素酶的三次实验结果读数高于Adv-mHGF组，说明Adv-mBMP9组的A1.B表达高于Adv-mHGF组，二者存在差异性（W0.05）图5A、B）o图5观察Adv-mBMP9、AdVFHGF和Adv-GFP腺病毒有效感染HP1479细胞第1d、4d、7d时间段A1.B-GIuc萤光素酶A值的表达及荧光表达(x200)3讨论自从UriSt1956年首先发现骨形态发生蛋白以来，其功能早已超越了早期人们所认识的功能作用，骨形态发生蛋白为一包括多个基因的家族，其功能从促进骨生成扩展为涉及胚胎发育、骨骼发生、神经发育和修复、造血发生、精子发生及胎盘形成、促进肝细胞的增殖分化及等多个重要领域。课题组前期开发了新型的腺病毒载体刀，并成功将BMP-9基因克隆并构建入重组腺病毒载体中，获得了重组腺病毒高滴度的病毒表达，BMP-9为骨形态发生蛋白家族的一员，我们前期实验已经发现BMP-9在成骨方面的巨大作用咒对于其在肝干细胞的诱导分化作用，最新文献报道，Sosa等,研究总结肝损伤后肝再生机制时，提出BYP-9可能在肝脏的再生方面有一定的作用，成为了我们实验研究的兴趣点，并且由于BMP-9为重组腺病毒载体介导，该基因不会整合入宿主染色体中，因此BMP-9促进肝细胞的增生分化作用不会长期存在，避免了肝脏干细胞无限增生导致肿瘤形成等可能，使用上具有安全性。肝干细胞因为其分化潜能，一直是科研工作者的研究热点.而近年来的研究显示，肝脏干细胞对肝病的治疗具有重要的临床应用价值,为肝脏疾病如终末期肝硬化等的治疗提供了新的思路。目前对于肝脏干细胞来源的界定还比较有争议，但较为一致的观点是肝卵圆细胞*、小肝细胞佃、胚胎源性肝干细胞等是被比较认可的肝干细胞。已有实验研究”“证明表明大鼠胚龄9.515d、小鼠胚龄8.515d间的肝脏细胞，大部分被认为是肝干细胞。本实验采用的是采用胶原酶消化法从胎龄14d的小鼠胚胎肝脏中分离提取的细胞,经鉴定为小鼠胚胎肝干细胞，作为我们的实验研究的细胞。HGF由COOPer等于80年代一经发现就引起广泛关注，至今它仍被认为是最强有力的致分裂增殖子网，HGF能有效诱导肝细胞的成熟分化四，是最早被认识在肝再生过程中起重要作用的细胞因子之一,其作用机制是通过与受体C2-mel相互作用而对多种细胞产生促有丝分裂作用及促形态形成作用,在肝脏的发育成熟和再生过程中发挥重要作用"OAFP为目前反映小鼠胚胎肝干细胞增殖分化的良好指标之一，在细胞增殖分化期AFP合成量多,而在成熟的肝细胞中合成量减少。而A1.B、CKI8为反映小鼠胚胎肝干细胞向成熟肝细胞样细胞分化的活性和功能的良好指标,成熟的肝细胞表达A1.B.CK18o研究报道BMP-9在肝脏中大量表达网，具有刺激肝细胞增值的作用，本实验创新性的选取了重组腺病毒介导的小鼠骨形态发生蛋白-9作为细胞诱导剂，去感染诱导小鼠胚胎肝脏干细胞，通过RT-PCR、细胞免疫荧光和A1.B-G1.uc报告基因荧光素酶读数检测等方法，检测A1.B、AFP和CK18等和成熟肝细胞相关的特征性标志物的表达情况，发现BMP-9可以定向诱导小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞样细胞，与之前文献报道存在相关性，丰富了BMP-9在在肝脏再生方面的理论，同时选择了国内外目前认为诱导作用最强的HGF作为参照,发现BMP-9的诱导作用甚至强于传统的肝细胞诱导因子HGF,这一点目前国内外尚未见相关报道，可能BMP-9为诱导肝脏干细胞分化的重要信号分子,至于BMP-9与HGF的协同作用及其在诱导过程中的信号传递途径将是我们下一步实验的研究重点。参考文献：1 KanNG,JunghansD,IzpisuaBelmonteJC.CompensatorygrowthmechanismsregulatedbyBMPandFGFsignalingmediateliverregenerationinzebrafishafterpartialhepatectomyJ.FASEBJ.2009:23(10):3516-25.2 武鹏宇，戴立里，唐静，等.骨形态发生蛋白-7对人肝星状细胞转化生长因子B信号转导的影响J.第三军医大学学报，2010,32(13)：1433-1437.3 QuanKang,SunMH,HongweiChengetal.Characterizationofthedistinctorthotopicboneformingactivityof14BMPsusingrecombinantadenovirus-mediatedgenedeliveryJ.GeneTherapy.2004,11(17):1312-1320.4 UristMR,BoneiformationbyautoinductionJ.Science,1965Nov12;150(3698):893-839.5 ArdnzazuS6nchez,IsabelFabregat»Growthfactor-andcytokine-drivenpathwaysgoverningliversternnessanddifferentiationJ.WorldJGastroenterol2010November7：16(41):5148-5161.6 ThenappanA,1.iY,KitisinK,etal.RoleoftransforminggrowthfactorbetasignalingandexpansionofprogenitorcellsinregeneratingliverJ.Hepatology2010;51:1373-1382.7 TONG-CHUANHE*,SHlBINZHOU*etal.AsimplifiedsystemforgeneratingrecombinantadenovirusesJ.MedicalSciences1998March;2509-2514.8 PengY,KangQ,ChengH,etal.Transcriptionalcharacterizationofbonemorphogeneticproteins(BMPs)-mediatedosteogenicsignalingJ.JCellBiochem.2003,15:90(6):1149-65.9 1.utherG,WagnerER,KangQ,etal.BMP_9inducedosteogenicdifferentiationofmesenchymalstemcells:molecularmechanismandtherapeuticpotentialJ.CurrGeneTher.2011Jun1:11(3):229-240.10 SosaI,Cvijanovic0,CelicT,etal.Hepatoregenerativeroleofbonemorphogeneticprotein-9J.MedSciMonit.2011Dec1;17(12):HY33-35.11 Pi1.,DingX,JorgensonM.etal.ConnectivetissuefactorwithanovelfibronectinbindingsitepromotescelladhesionandmignonduringratovalcellacfivationJ.Hepatology,2008,47(3)：9961004.12 金世龙；刘宝华；刘宏鸣等.大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究J.第三军医大学学报，2006,28(22):2259-2262.13 ChenQ,KonJ,OoeH,etal.Selectiveproliferationofrathepatocyteprogenitorcellsinserum-freecultureJ.NatProtoe,2007,2(5)：11971205.14 苏娟，姚玉成，王中华，等.干细胞样肝原始细胞的分离与鉴定J.癌变畸变突变，2000,12(4)：200201.15 ForteG,MinieriM,CossaP,etal.Hepatocytegrowthfactoreffectsonmesenchymalstemcells:proliferation,migration,anddifferentiationJ.StemCells,2006,24(1):23-33.16 NISHINOM.IIMUROY»1.1EKIT»elal.HepatocytegrowthfactorimprovessurvivalafterpartialhepatetomyinCirrhoticratssuppressingapoptosisofhepatocytesJ.Surgery»2008>144(3)：374-384.17 1.eeBS,ParkM,ChaHY,ocytegrowthfactorinducesdelayedSTAT3phosphorylationthroughinterleukin-6expressionJICellSignal,2009,21(3):419-427.18 ChivuM,DimaSO,StancuCI,etal.Invitrohepaticdifferentiationofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsunderdifferentialexposuretoliver-specificfactorsJ.TranslRes,2009,154(3):122-132.19 AaronF.Miller,StephenA.K.Harvey,R.ScottThies,etal.Bonemorphogeneticprotein-9.Anautocrine/paracrinecytokineintheliver.JBiolChern.2000Jun16:275(24):17937-45.