3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量.docx

试验五3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量一：目的了解3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的原理驾驭总糖定量测定的操作方法二：原理还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖）。它们在碱性条件下，可变成特别活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原实力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。HC-OHO=C-OHIlIC-OHHC-OH还原糖(碱)A(HC-OH)n(HC-OH)nH2C-OHH2C-OH3,5-二硝基水杨酸（黄色）3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色）黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在肯定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为54Onnl处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1-里=0.9）,即得比较接近实际的样品中总糖含量。180H：试验材料及设备1、材料：面粉2、仪器：分光光度计电子天平沸水浴3、器材：刻度试管：25m1.×8容量瓶：100m1.X2锥形瓶：100nl1.Xl移液管：Im1.X22m1.×2IOm1.X2烧杯：25OnI1.Xl50m1.Xl滴管：2洗耳球：2滤纸：Hcm坐标纸漏斗、洗瓶、白瓷板、试管架、移液管架、试管夹、玻棒：各1四：试剂的配制1、葡萄糖标准液（lmgm1.）预先将分析纯葡萄糖置80烘箱内约12小时。精确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸僧水溶解后，移至500m1.容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4C保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。2、3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）将5.Og3,5-二硝基水杨酸溶于200m1.2NNaOH溶液中（不相宜用高温促溶），接着加入50Om1.含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000m1.。暗处保存备用。3、碘液称取5g碘和IOg碘化钾，溶于100m1.水中。4、酚配指示剂称取OJg酚酿，溶于25OnI1.70%（V/V）的乙醇中。5、HCI溶液(6N)取50Om1.I2NHC1,用水稀释至100OIn1.。6、NaoH溶液(6N)取24OgNaOH,加水溶解，定容至100Onl1.。五：操作步骤1、样品中总糖的提取(1)取材：称取0.7g面粉，精确记录实际质量(W),放入100m1.锥形瓶中。(2)溶解：先用几滴蒸储水调成糊状；加入15m1.蒸储水；再加入IOm1.6NHCl,搅匀。(3)水解：置于沸水浴中水解30分钟。用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中，加1滴碘液，检查淀粉水解程度。如显蓝色，表明未水解完全，应接着水解。如已水解完全，则不显蓝色，可以取出沸水浴中的锥形瓶，冷却。(4)中和：加1滴酚指示剂，加入IOm1.6NNaOH中和至微红色。(5)定容：将溶液转移至100m1.容量瓶(B1)中，定容。(6)过滤：用滤纸过滤。(留意，滤纸不能用蒸储水潮湿。)(7)稀释：精确吸取滤液IOm1.,移入另一个100m1.容量瓶(B2)中，定容。(B2)液作为总糖待测液备用。2、标准曲线制作及样品测定取8支25m1.刻度试管，按下表所示依次操作。反应各管混匀，沸水浴5分钟管号操作空白标准葡萄糖浓度梯度样品012345III葡萄糖标准液(初)0.20.40.6().81.0样品待测液(矶)1.()1.0蒸馆水(m1.)2.01.81.61.41.21.01.01.0DNS试剂(m1.)各2.0定容冷却；分别用蒸储水定容至25m1.比色以。号管为空白参比，测定二54Onm处的吸光度记录吸光度(As,。)六：结果处理：1 .由O5号管的数据，以葡萄糖含量(ITlg)为横坐标，ASK)为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；2 .求两个样品管A”。的平均值754°3 .由不须从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量(mg)；4 .计算你所取的生物材料中总糖的百分含量。