阿苯达唑干扰糖酵解对耐顺铂卵巢癌细胞耐药性的影响研究.docx

阿苯达嗖干扰糖酵解对耐顺粕卵巢癌细胞耐药性的影响研究何迎盈】，刘娜娜】，罗治彬2",李少林】(1.重庆医科大学基础医学院核医学教研室.4016:2.电庆市合川区人民医院肿摘曲液科,401520)摘要目的：研究阿苯达理(a1.bendazo1.e.ABZ)抑制人耐顺钳卵巢癌SKoVnDDP细胞糖醉解对其耐药性的影响。方法，根据前期ABZ抑制SKOVM)DP细胞糖酵解的研究，将细胞分为对照组、IC25组、IC50组和IC75组,每组对应的ABZ浓度分别为0.0,1.5,8.0.50.0mo1.1.o将不同浓度的顺车白(cisp1.atin.DDP表阿霉素(epirubicinrEPI)、5氟尿啸嚏5-f1.uorouraci1.,5-Fu)按照分组联合和序贯ABZ处理细胞后，采用漠化二甲嗓嚏二苯四氨哇(MTT)比色法检测SKOVnDDP细胞体外增殖情况。按组用ABZ处理细胞，在12h、24h、36h分别用流式细胞仪检测各组细胞表面P-糖蛋白(P-g1.ycoproteitP-gp)的表达。结果：联合和序贯ABZ.均能使降低DDP、EP1.和5-Fu对SKoVgDDP细胞的作用浓度，呈浓度和时间依赖性，另外联合作用优于序贯作用。ABZ作用SKOVyDDP细胞后使P-gp表达下降，有浓度和时间依赖性结论I结合前期研究发现，ABZ能在体外通过干扰SKoV-歹DDP细胞糖酵解提高细胞对DDP、EPI、5-Fu的敏感性，并能逆转细胞的耐药性。ABZ能够有效下调P-gp的表达。关键词：耐药卯巢癌阿苯达嘎糖醇解EffectofA1.bendazo1.eGoReyersesChemoresistanceOfCiSPIatin-resistantOVarianCanCerCeHSbvInhibitiengG1.yee1.ysis-P*vcoproteinEXPreSSiOneCiSPIatin-resistant-Ovandn_Cancer_GeU¾_带格式的1.字体：小四AbstractObjective:Toinvestigatetheeffectofa1.bendazo1.e一(ABZ)Onthe一一1错格式的：字体：小四chemoresistancebyinhibitingg1.yco1.ysisofhumancisp1.atin-resistantovariancancer带格式的：不体：小四带格式的：产体:带格式的：产体：小四 错格式的：字体：小四 带格式的：字体:一而 带格式的：字体;""祠 带格式的：7体7"丽 带格式的：7体:Km 带格式的：字体一疝combinedregimen .was better than Ihat OfJeqUeneeVa1. OneJfter treatment With /- -f 带格式的：字体：小四SKOVyDDPce1.1.s.Method:Basedonthepi1.otstudyofABZinhibitionofg1.yco1.ysisofSKOVyDDPce1.1.s,wedividedce1.1.sinto4groupscontro1.group>IC25group%IC50group、IC75group,_andtheCOrreSPOndinRConCentratiOnOfeachfoutxoGFeepo科din田concentFat>nRroupwere0.0,.1.5,-8.0,-50.0mo1.1.respective1.y.Methy1.thiazo1.y1.tetrazo1.ium(MTT)Co1.OrimetrVWaSemp1.oyedtodetectTthepro1.iferationofSKoV歹DDPce1.1.swasdetectedbymethy1.thiazo1.y1.tetrazo1.ium(MTT)co1.orimetryaftertreatmentwithABZincombinedand-Sequeneetia1.fashionwithDDP、EPk5-Fu.TheP-H1.VCoPrPtein(PYP)expressionOfeachgroupWaSdeterminedbyf1.owcytometry.Resu1.ts：BothcombinedandSeQUenceseuentia1.regimensWithABZcandecreaseactioneffective.concentrationOfDDP、EP1.and5-Fu如SKOVyDDPce1.1.Sy-_jnadose-andtime-dependentmannerx7ffijyjpreover,JheeffectOf带格式的：字体：小四带格式的：字化:Ki 带格式的：字体：一而 带格式的：字体：小四 带格式的：了体：小四 借格式的：字体:而i 带格式的：工体：小四 带格式的：?#：""丽 稽格式的：体：函 带格式的：字体-丽 带格式的：了侬：小四 带格式的：字体：小四 带格式的：字化一而 带格式的：字体：小四ABZ,theexpressionofP-gpdecreasedinadose-andtime-dependentmanner.Conc1.usion:承ased-on-the-eaFtieJSwdyTWWefpdthatABZCeH1.dincreasethesensitivityOfSKOV歹DDPce1.1.stoDDPEPk5-Fu,andreversethetchemoresistance.N1.OrecNerFUrthermOr巳-ABZced0Qd。WnMegU1.atetheexpressionOfP-gpexpression.Keyword：a1.bendazo1.e,Cisp1.atin-resistantOvarianCancer,g1.uco1.ysiszP-R1.yeOPrOteiAA通讯作者.罗治彬,Te1.:.E-mai1.：卵巢癌是病死率最高的妇科肿瘤，且发病率和病死率逐年上升1.虽然手术与化疗的进展使卵巢癌五年生存率提高，但耐药仍是其治疗所面临的难题2,且常表现为多药耐药（mu1.tidrugresistance.MDR）。卵巢癌耐药，机制复杂,但多数学者认为耐药的卵巢癌细胞高表达P糖蛋白（P-g1.ycoprotein,P-gp）i,介导了卵巢癌的多要MDRnP-gp由MDR1.和MDR3基因指导，定位于细胞膜，是依赖ATP的药物外排泵，它通过将药物泵出胞膜外而降低胞内药物浓度而导致耐药5。卵巢癌细胞获取能量主要依靠糖醉解6。活跃的糖酵解代谢对P-gp的功能有促进作用7。前期研究发现，阿苯达噗能够抑制SKoV歹DDP细胞轴酵解酹活性，下调糖醉解相关基因的表达，因此我们大胆假设抑制SKoVTDDP细胞的糖醉解，能对其耐药性产生影响，从而展开了此课题的研究.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞系人耐顺伯卵巢癌SKOv-VDDP细胞株购买于中国医学科学院肿瘤细胞库。1.1.2 主要试剂及仪器胎牛血清和RMPI1640培养基购自Gibco公司。ABZ购自AccuStandard公司，纯度为97.5%。MTT和二甲基亚碉（DMSo）购白Sigma公司。顺的（CiSPIatin,DDP）注射液购自南京制药厂。氟尿嗜嚏注射液（f1.uorouraci1.,5-Fu）购自上海旭东海普药业。盐酸表柔比星（epirubicin,EPI）购自浙江海正药业。dgp抗体（货号：557003）,同型异构体（货号：555743）购白BD公司，FACSCa1.ibUr流式细胞仪为美国BD公司产品。1.2 方法1.2.1 分组根据前期ABZ干扰SKoVM）DP细胞糖酵解的研究,仍分为对照组、IC25组JC50组、IC75组，所对应的ABZ作用浓度分别为：0.0、1.5、8.0、50.0mo1.1.1.2.2 ABZ对SKOV歹DDP细胞对DDP、EPI.5-Fu敏感性的影响1.2.2.1 样本准备将生长状态良好的SKOV目DDP细胞接种于96孔板,接种密度为IXW4/孔，同时设阴性对照孔和调零孔。边缘孔充以无菌PBS溶液，其余孔加含10%FBS的1640培养基（以下称为培养液）在37C、5%CO2的细胞培养箱（以下培养条件相同）里孵育直至贴壁。1.2.2.2 药物处理将DDP、EPk5-Fu分别溶于含0、1.5、8.0、50.0MmO1./1.ABZ的培养液中,使DDP和5-Fu终浓度为5、IOs20、40、80、160、320、640mo1.1.,EPI终浓度为3.5、7,14、28、56、112、224、448UmoI/1.,小心吸去孔内培养基，按照分组，将配好的药液加到试验孔内，每个浓度设3个熨孔C阴性对照孔和调零孔仅加培养液。1.2.2.3 MTT法测定药物处理24h后，每孔加入5mgm1.MTT20U1/孔，37避光孵育4h后，小心吸去孔内液体，再加入DMSo150U1./孔,低速笈荡IOmin,施标仪在49Onm处测定其吸光值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=1-（实验孔OD值一阴性对照孔OD值）/（阴性对照孔OD值一调零孔OD值）×100%.1.2.3 ABZ逆转SKoV-歹DDP细胞对DDP、EPk5-Fu的耐药1.2.3.1 样本准备在检测ABZ对SKoV歹DDP细胞对DDP、EPk5-Fu敏感性影响的同时，按上述方法，将SKOv-VDDP细胞接种于96孔板内n1.2.3.2 药物处理按照分组，分别加入含0.0、1.5、8.0、50.0UmO1./1.ABZ的10%FBS血清培养基200W/孔，阴性对照孔和调零孔仅加培养液。培养12h后，小心吸去孔内培养基，用无菌PBS轻洗两遍，然后每孔加入10%FBS血清培养基200U1.培养24h,小心吸去孔内培养基，按组分别加入含DDP.EPkS-Fu的10%FBS培养基。DDP和S-Fu的终浓度为5、10、20、40、80、160、320、640mo1.1.,EPI终浓度为3.5、7、14、28、56、112、224、448mo1.1.o每个浓度设3个复孔。阴性对照孔和调零孔仅加含培养液，1.2.3.3 MTT法测定药物处理24h后，每孔力口入5mgm1.MTT20U1/孔，孵育4h,小心吸去孔内液体，再加入DMSOI50孔，的标仪在49Onm处测定其吸光值，计算细胞增殖抑制率.1.2.4 流式细胞术测SKOV-歹DDP细胞表面P-gp的表达将SKOV-yDDP细胞接种J-6孔板，接种密度为IXIO6/孔，加入培养基孵育过夜。待细胞贴壁后，按组分别加入含0.0、1.5、8.0、50.0UmOI/1.ABZ的培养液。加药处理后12h、24h、36h分别用胰前消化并收集细胞，PBS轻洗2次，最后室温IOOOrcp离心3min,弃去上清液。避光条件下，空白孔加入201.PBS,同型对照孔加入同型对照抗体201.,对照组和实验组均加入P-gp抗体201.避光室温孵育Ih,每隔20min,轻轻震荡Imin.然后加入PBS至300I,上机检测。1.3 统计学方法以上步骤均重更三次，所得数据采用SPSS18.0软件进行分析，结果采用口出s表示，样本均数差别的多重比较采用单因素多水平1.SD法方差分析，以PVO.05为差异有统计学意义。2结果2.1 ABZ提高SKOV-/DDP细胞敏感性利用SPSS18.0进行回归分析，求得DDP、EP1.和5-Fu联合ABZ对SKOVVDDP细胞体外抑制率分别为25%、50%、75%所对应的DDP、EPI和5-Fu的浓度，以IC25-xxx,IC50-x×XsIC75-xxx表示（表1.）IC25、IC50和IC75的ABZ联合DDP、EP1.和5-Fu作用细胞后，实验组与对照组比较的P值均为0.000,统计学差异明显：且各实验组间比较的P值均V0Q5,有明显的统计学差异（表2）。结果说明，ABZ能够降低DDP、EPI和5-FuSKOv-VDDP细胞的作用浓度，即提高了SKoVmDDP细胞对DDP,EPI和5-Fu的敏感性，且效应依赖于ABZ的浓度（图1）。表1ABZ对SKOVVDDP细胞对DDP,EP1.S-Fu敏感性的影响(G壬s,mo1.1.)药物浓度(mo1.1.)对照组IC25组ICSO组IC75组DDPIC2533.55+2.053.49+0.IOab0.38+0.06abo.±o.abIC50363.50±18.6268.02±3.13ab7.39+0.66ab0.05±0.01abIC753938.57+162.711329.07±140.51a,b144.43+3.91a,b9.81±0.50a'bEPIIC2545.17±2.259.95+0.73ab0.14+0.00ab0.±0.abIC50625.03+43.84205.73±5.73ab4.04±0.08a'b0.07±0.01a'bIC758650.78+785.414282.63+536.47a,b115.38±2.44a,b8.18±0.823b5-FuIC25107.78+2.3757.82±2.99a'b8.30±0.20a'b0.02±0.013IC502534.20±112.481162.51±93.93ab63.42±1.45a,b0.81±0.13abIC7559607.69+3993.7223388.75+2592.36a,b484.32+11.01a,b39.94±1.63a,b（a、与相应的对照组比较的P值VOQ5,有统计学差异；b、不同浓度的ABZ对SKOV邛DDP细胞药物敏感性影响比较的P值V0Q5,即ABZ对细胞敏感性的影响具有浓度依赖性。）2.2 ABZ逆转SKOV-VDDp细胞的耐药性利用SPSSI8.0进行回归分析，求得DDP、EP1.和5-Fu序贯ABZXtSKOVyDDP细胞体外抑制率分别为25%、50%、75%所时应的DDP、EPI和5-Fu的浓度,以IC25-xxxIC50-xxxIC75xxx'表示（表3）。IC25、IC50和IC75的ABZ序货DDP、EP1.和5-Fu作用细胞后，实验组与对照组比较的P值均为0.000,统计学差异明显：且各实验组间比较的P值均为0900,有明显的统计学差异（表4）。结果说明，ABZ能够逆转SKoV歹DDP细胞对DDP、EP1.和5Fu的耐药性且效应依赖于ABZ的浓度（图2）。表3ABZ逆传SKoV歹DDP细胞对DDP、EPk5-Fu耐药性(口±s,mo1.1.)药物浓度(mo1.1.)对照组IC25组IC50组IC75组DDPIC2533.03±1.0812.93±0.99ab2.12+0.83ab0.51±0.05abIC50365.41±16.6095.86±3.49ab38.85±2.03ab10.±0.61a,bIC754043.08±238.10711.56+4.76ab618.03±55.51a,b196.90±7.65a,bEPIIC2544.86+2.0321.03±0.47ab8.24±0.28ab0.08±0.01a'bIC50627.29±38.71290.42+14.81ab79.18+1.77ab2.922±0.20a,bIC758772.55+687.894012.34+319.87a,b762.25±61.10a,b103.28+2.53a,b5-FuIC25105.5±92.1782.97±1.84ab16.97±0.77ab0.39±0.04a'bIC502479.65+108.701471.12±70.05ab141.79+8.78a,b9.17+0.40abIC7558290.49+4638.5126125.32±2418.85a,b1185.00+94.57a,b214.68+14.34a,b(a、与相应的对照组比较的P值V0.05,有统计学差异：b、不同浓度的ABZ逆转SKoV歹DDP细胞药物耐药性影响比较的P值0.05,即ABZ对逆转细胞耐药性的影响具有浓度依赖性。）2.3增敏和逆转效应比较将DDP、EPI、5-Fu联合ABZ时在抑制率分别为25%、50%、75%所对应的浓度与ABZ序贯DDPsEPk5-Fu相时应的浓度进行ANOVA分析，得出以下结果（表5）o结果显示，除IC25的ABZ对EPI的IC75和对5-Fu的IC50及IC75,联合和序贯比较的P值0.05,无明显统计学差别外，其余比较都V0.05,统计学差别明显，可以认为，ABZ增敏效应优于逆转效应。表5增敏和逆转效应统计学比较结果DDPEPI5-FUIC25ICSOIC75IC25IC50IC75IC25IC50IC75K25F值2683371Q5J77SZ880487.1758S304OSffiIajeO208111787组P值Q00nQanOOOOQOO1.0495QOoOaICSoF值132336532312173122497518536SOG33S91357S74232457162472组P值0022aoooQOOOOOOOQOOOOOOOQoooQOOO0000IC75F值2XMB9797.6781789XM6147.160SS.7303835S223065011164.14148a2S4组P值QDooQoooQOOOQOOOQOOOQOOOQOOOQOOOQOOO2.4 SKOVyDDP细胞膜上P-gp表达经过CeIIQuest软件分析得出各组细胞膜上P-gp的表达，再用SPSS18.0软件分析，得出以下结果（表6），并从浓度依赖性和时间依赖性两方面分析ABZ对P-gp表达的影响。IC25,IC50和IC75的ABZ分别作用SKOV邛DDP细胞后12h、24h、36h后，实验组的P-gp表达与对照组比较P值均V0.000,统计学差异明显。但在IC25和IC50的ABZ对P-gp的影响比较P值0.05,无明显统计学差异，在其他时间，实验组间的比较P值均V005（表7）。结果说明，ABZ能够明显抑制SKoV歹DDP细胞膜上P-gp的表达，在24h和36h抑制作用有浓度依赖性（图3、4、5）。在IC25组、ICSO组、IC75组内，各时间点比较的P值均为0.000.统计学差异明显（表8）,结果说明，ABZ对SKOV歹DDP细胞膜上P-gp表达的抑制效应有时间依赖性。表6ABZ对SKoVyDDP细胞膜：P-gp表达的影响（0±5,%）12h(%)24h(%)36h(%)对照组94.46±3.2295.26±4.0994.40±1.83IC25组88.04士53.16±20.95±2.612.55a'c3.5OahCa,b.cIC50组83.34±3.7632.47±1.7110.52±1.48a,ca,b,ca,b.cIC75a61.26±3.2218.83±2.354.42±0.62atca,b,cazb.c（a、与相应的对照组比较的P值VOQ5,有统计学差异；b、相同作用时间下，不同浓度的ABZ对SKoVTDDP细胞表面P-gp表达影响比较的P值Vo.05,即ABZ对P-gp表达的影响具有浓度依赖性；C、同一浓度的ABZ作用不同时间对5KOV）DDP细胞表面Pgp表达影响比较的P值V0.05,即ABZ对P-gp的影响具有时间依赖性。）图3ABZ作用12h后各组细胞的P-gp表达,°,P般PE,°3,°4息0Osi§OsX1VS1.一三二二而So1.§SvSK01PXE图4ABZ作用24h后各组细胞的P-gp表达Osi§ Sv § 58IC754图5ABZ作用36h后各组细胞的P-gp表达08-08 OS OBT Os 0 ItoSS(Juv36h10310OS-OS OS Sv 0O3OosOs 03 09 0 Xds1008 03亨 OoZo H-XS3讨论阿苯达哩是临床常用的抗寄生虫药物，通过抑制寄生虫肠壁细胞胞浆微管系统聚合，阻断其对多种营养和葡萄糖摄取吸收，抑制糖酵解相关酶活性，阻止三磷酸腺昔产生，使虫体无法生存和繁殖8。近年国外研窕证实阿苯达哇有抗肿瘤作用，目前确定的机制包括抑制微管蛋白聚合,介导以CaSPaSe和CytC释放的凋亡，抑制乏氧诱导因子(hypoxia-inducib1.efactor-1,HIF-D和血管内皮生在因子(vascu1.arendothe1.ia1.growthfactor>VEGF)”的表达等。在我们的前期研究发现，阿苯达嘎在体外明显抑制了SKoVmDDP细胞糖酵解主要的相关酣一HK、PK和1.DH活性，并下调了与糖酵解相关的原癌基因Akt和MyC的表达，阻碍了肿瘤细胞的能量供应，诱导了细胞凋亡和冏期阻滞。顺伯是卵巢癌化疗的一线用药，疗效明显且价格便宜。但是治疔后期，可产生耐药】2,常为MDR.目前研究认为，耐药产生和P-gp卷表达有密切关系，另外，P-gp高表达可能也影响细胞的凋亡】3。我们发现，ABZ不仅可以提高SKoV)DDP细胞对DDP、EPK5-Fu的敏感性，还能逆转细胞对三种药物的耐药性。经ABZ处理的细胞，膜上P-gp表达较对照组明显降低，且呈时间和浓度依赖性。这从另个角度证明了糖酵解和耐药的关系“°抑制糖酵解，即切断肿瘤的能量来源，可以改善耐药。阿苯达陛作为经济有效低毒的临床用药，在肿瘤基础研究中，发现了其诱导凋亡和改善耐药的新用途，希望经过深入研究后，能够为肿瘤化疗新方案的开辟奠定了一定基础。1 RebeccaSiege1.DeepaNaishadham,AhmedinJema1.CancerStatistics,2012,CACANCERJC1.IN2012;62:10-292 RobertC.Bast,Jr,BryanHennessy.GordonB.Mi1.1.s.Thebio1.ogyofovariancancer:newopportunitiesfortrans1.ation,NatureReviewsCancer9,June2009：415-4283 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