5.3血红蛋白的提取和分离教案.docx

课题5.3血红蛋白的提取和分别教学目标：1、尝试从血液中提取和分别血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分别生物大分子的基本原理教学重点：凝胶色谱法的原理和方法教学难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填教材分析：教学过程：(一)引入蛋白质是生命活动的主要担当者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的探讨有助于人们对生命过程的相识和理解。所以须要从细胞中提取蛋白质进行探讨。怎样提取蛋白质呢？(二)新课1 .基础学问蛋白质的相关学问回忆：蛋白质的物化理性质：形态、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分别各种蛋白质。1. 1凝胶色谱法(安排色谱法)：(1)原理：(见课件图)分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流淌快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流淌慢。(2)凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。(3)分别过程：混合物上柱一洗脱一大分子流淌快、小分子流淌慢一收集大分子一收集小分子*洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流淌。1. 2凝胶电泳法：(1)原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形态和大小不同,在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。(2)分别方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。(3)分别过程：在肯定PH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS,形成“蛋白质一SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。2. 3缓冲溶液(1)原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成(如H2CO3-NaHCO3,HC-NaC,NaH2P4Na2HP(等),调整酸和盐的用量，可配制不同PH的缓冲液。(2)缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液PH的干扰而保持PH稳定。3. 试验设计1 .1蛋白质的提取和分别一般分为哪些基本步骤？样品处理、粗分别、纯化、纯度鉴定。思索：是否全部种类的蛋白质的提取和分别都是这样的？为什么？不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分别方法差别很大。哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。下列Ii血液由和两部分组成。血细胞中细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是O该化合物是由和构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和C02结合的基团。2 .3从红细胞中分别出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分别血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分别纯化。水7缓慢搅拌IOminf低速短时离心一吸出上清液-反复洗涤直至上清液无黄色思索：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？思索：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？质加入蒸储水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。补充：加入蒸储水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的思索：如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。PE透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子思索：为何运用pH=7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶好液量？哧维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。依据教材图519,说出制作色谱柱须要的材料,橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。色谱柱的制作过程：打算材料一加工橡皮塞一安装色谱柱下面进行其次步一一凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：色谱柱的装填过程。步骤操作要求操作要求色谱柱垂直固定在支架上:计算称量凝胶依据色谱柱体积计算凝胶用量(配制悬浮液凝胶颗粒+蒸储水i充分溶胀凝胶颗粒+洗脱液i沸水浴装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打:缓冲液洗涤平衡立即用磷酸缓冲液洗涤平衡12h样品加入和洗脱。其基本过程是：调整缓冲液面一加入蛋白质样品一调整缓冲液面一洗脱一收集分装蛋白质至此，血红蛋白即可得到粗分别。在整个操作过程中，应当留意以下事项：(1)红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。(2)凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡(3)色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。（4）色谱柱胜利标记：红色区带匀称一样地移动。（三）课堂总结、点评（四）实例探究例1利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（）A.相对分子质量大的B.溶解度高的C.相对分子量小的D.所代电荷多的解析：凝集色谱法使依据相对分子质量的大小分别蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。答案：A例2蛋白质提取和分别分为哪几步（）A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化C.样品处理、粗分别、纯化、纯度鉴定D.样品处理、纯化、粗分别、纯度鉴定解析：蛋白质的提取和分别分为样品处理、粗分别、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳为试验操作过程中的技术答案：C例3用凝胶色谱法分别蛋白质时，分子量大的蛋白质（）A路程较长，移动速度较慢B路程较长，移动速度较快C路程较短，移动速度较慢D路程较短，移动速度较快解析：在小球体内部有很多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质简单进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。答案：D（五）巩固练习1 .凝胶色谱法分别蛋白质的依据是（）A.对其他分子的亲和力B.溶解度C.所带电荷多少D.相对分子质量的大小2 .凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（）A.糖类化合物B.脂质C,蛋白质D.核酸3 .选用红细胞作为分别蛋白质的试验材料，有何好处（）A.血红蛋白是有色蛋白B.红细胞无细胞核C.红细胞蛋白质含量高D.红细胞DNA含量高4 .将搅拌好的混合液离心来分别血红蛋白溶液时，其次层是（）A.甲苯B.血红蛋白水溶液C.脂溶性物质的沉淀层D.其他杂质的沉淀5 .血红蛋白因含有（）而呈红色A.02B.COC.C02D.血红素6 .下列操作正确的是（）A.分别红细胞时采纳低速长时间离心B.红细胞释放出血红蛋白只须要加入蒸储水就可C.分别血红蛋白溶液是低速短时间离心D.透析时要用20mmoll的磷酸缓冲液，透析12h7 .样品的加入和洗脱的叙述正确的是（）A.先加入Iml透析后的样品B.加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出C.假如红色带匀称一样的移动，说明色谱柱制作胜利D.洗脱时可以用缓冲液也可以用清水8 .下列有关提取和分别血红蛋白的程度叙述错误的是（）A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液8 .通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化D.可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度9 .凝胶色谱法操作正确的是（）A.将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴B.将橡皮塞下部切出凹穴C.插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面D.将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片10 .样品的加入和洗脱的操作不正确的是（）A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D.用吸管当心的将InlI透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶教后小记