苦丁茶中熊果酸的大孔树脂分离纯化工艺研究.docx

摘要：以苦丁茶为研究对象，采用大孔吸附树脂对苦丁茶中熊果酸的粗提取物进行分离纯化。对4种不同型号的大孔吸附树脂进行静态实验考察，筛选出最佳树脂，并以该树脂对苦丁茶中的熊果酸进行动态吸附及洗脱性能的研究，优化大孔树脂分离熊果酸的工艺参数。实验筛选出了以HZ-816型树脂为上样树脂，该树脂纯化熊果酸的优化工艺条件为：吸附流速4BVh,上样浓度1.40mgm1.,上样体积225m1.,树脂吸附量可达18.697mg/g；以90%乙醇为洗脱剂，洗脱流速4BVh,洗脱剂用量10BV,解吸率可达58.57%,再减压浓缩解吸液得干膏，纯度为48.26%o关键词：苦丁茶；熊果酸；大孔树脂；分离纯化；吸附；解吸0引言苦丁茶，别称茶丁、富丁茶。苦丁茶中含有多种活性成分，如维生素、氨基酸、挥发油、黄酮类化合物、微量元素以及多酚类物质等。其味苦、性凉，具有生津止渴、清热消暑、抑癌防癌、活化血脉等多种生物学效应。熊果酸(UA),又名乌苏酸，属于五环三菇类化合物。在自然界中分布较广，如在女贞、熊果、枇杷和毛泡桐等天然植物中均有一定含量存在。熊果酸纯品为白色或类白色针状晶体或结晶粉末。熊果酸本身具有多种很强的开发价值，比如具备抑制肿瘤、抗炎镇静、保护肝脏损伤、抗糖尿病、抑制细菌活性、抗病毒传播等药理作用。目前，广泛应用于熊果酸分离纯化的方法有：硅胶柱色谱吸附及分步洗脱法和有机溶剂萃取法。然而，上述方法均存在工艺流程复杂、收率低，且使用的有机溶剂有毒有害等问题。大孔树脂分离技术，具有工作效率高、吸附容量大、可再生等诸多优点，且采用乙醇作为溶剂进行梯度洗脱，所得产物绿色环保，安全性高，已逐步在中药制药工艺中得到应用。1 材料与方法1.1 实验材料与试剂实验材料与试剂如表1所示。«1实验材料后试名称，奴格生产厂家。苦丁茶药材50“袋，产自海南五指山，黑果酸标唐品标准品（98%>P上海同田生物技术有限公司。AR（分析凭）“国药具团化学试用有限公司。高氯酸AR（分析死）国药奥团化学ilWH有限公三P/整酸AR（分析纯AH2-806.HZ-816.HZ-818.上海凌嶂化学试总育网公司，大孔吸附树脂,HZ-826上海华震科技有网公司，潮乙小AR（分析笠），国药集团化学试制有限公司无水乙创2AR（分析兜）。国药妥团化学试出育网公司。'1.2 实验仪器与设备实验仪器与设备如表2所示。表2实验仪器与设备，名称型号Q生产厂家，玻璃层析柱C20mm×300jhm上海传玻玻璃仪器厂电子天平/A1.l0“中国电子器件工业总公司天平JPTT2江苏常熟衡器厂*旋转蒸发器PRE-52AA上海振捷实蛤设备有限公司“紫夕Z分光光度计"UV1900PC÷1上海亚奴电子C循环水真空泵SHB-Ul型，巩义市茶鞋华仪器厂“1.3 分析方法本实验参照2015版中国药典记载的熊果酸含量测定方法，以熊果酸标准品为对照品，应用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法，以紫外-可见分光光度法为分析手段，测定熊果酸含量。1.3.1检测波长的确定精密称取熊果酸标准品，配成质量浓度为0.1mg/m1.的熊果酸标准品溶液。分别吸取一定量的熊果酸标准品溶液和苦丁茶提取液，置于20m1.具塞刻度试管中，于105下挥发溶剂后，准确加入5%香草醛-冰醋酸溶液2001.,振荡摇匀；再加入高氯酸试液8001.,摇匀，置于60水浴中加热15min,用冰醋酸定容至5m1.,并置于紫外-可见分光光度计中进行波长扫描，得到熊果酸的检测波长为548n11o1.3.2标准曲线的建立精密吸取各对照品溶液01.>100u1.、2001.、3001.、4001.、500u1.、6001.,分别置于20血，具塞刻度试管中，按1.3.1项操作，在548nm波长处测定熊果酸溶液吸光度，得标准曲线方程：ao.04236÷0.0036,线性浓度范围012gm1.,*二0.9993。表明在该浓度范围内，熊果酸浓度C与吸光度值力具有良好的线性关系。1.4分离方法1.4 .1树脂预处理（1）用去离子水冲洗树脂，以去除其表面的盐和无效物质；（2）使用95%乙醇浸泡树脂24h；（3）过滤除去浸泡用的乙醇溶液后再进行醇洗，直到树脂与去离子水以1:3混合不显浑浊为止;(4)用蒸储水洗至树脂无乙醇气味；(5)用5%的HCl过柱，浸泡树脂3h左右，水洗至中性；(6)用2%的NaOH过柱，浸泡树脂3h左右，水洗至中性后备用。1.4.2树脂性能参数本实验使用4种不同型号的大孔吸附树脂对苦丁茶中的熊果酸进行纯化性能研究，其主要性能指标如表3所示。表3实验所用大孔吸附树脂的性能指标“组号"树脂类型一比表面积/(三7g)p孔径/A*极性。1÷,HZ-806c300400e90中极性32"HZ-816p850600弱极性j3pHZ-81890090非极性一4”HZ-82641800/“弱极性。1.4.3静态筛选实验分别精确称取经过预处理后的HZ-806、HZ-8分、HZ-8分、HZ-826这4种大孔树脂1.0g,转移至100m1.的三角烧瓶中，向三角烧瓶中加入50IIl1.浓度为1.OO2mg/m1.的苦丁茶熊果酸提取液进行吸附，每隔IOmin振摇30s,持续2h,静置24h,使其达到吸附平衡，计算吸附量及其吸附率。1.4.4动态吸附及解吸实验准确称取经过预处理的树脂，通过湿法上样的方式，装入树脂柱中；将一定浓度的熊果酸提取液注入柱内，控制流速，使其通过树脂；收集流出液，并用紫外-可见分光光度法测定熊果酸浓度。在洗脱过程中，解吸液从树脂柱的上端向下端流动，控制解吸液的流动速度，使用采样瓶收集流出液，并用紫外-可见分光光度法测定熊果酸浓度。计算吸附率、吸附量和解吸率。1.4.5纯度测定首先，收集优化工艺条件下的苦丁茶熊果酸解吸液，测定其吸光度,根据苦丁茶熊果酸标准曲线方程，计算解吸液中苦丁茶熊果酸的含量。然后，减压浓缩解吸液至干膏，取出，于烘箱中干燥，称量干膏重量。重复三次，最后计算出苦丁茶熊果酸纯度。1.5 计算方法在苦丁茶熊果酸的分离纯化过程中，参照公式(1)(3),可计算不同树脂的吸附量、吸附率及解吸率，以选择最佳树脂。参照公式(4),可计算经大孔树脂纯化所得苦丁茶熊果酸的纯度。吸附量=(%G)吸附率=(G-Cf)Xl00%(2)-Co解吸率=%fi-X100%(3)-(C0-Ct)V0式中Ct吸附前药液的初始质量浓度，mg/m1.；G吸附后流出液的平衡质量浓度，叫/姓；“&脱附液中脱附后的苦丁茶熊果酸浓度，mg/m1.;÷-&脱附后脱附液体枳，也：，K加入锥形瓶的吸附前药液的初始体积，色;“伊干树脂篁量，g纯度%=J-X100M式中C优化条件下解吸液中苦丁茶熊果酸的浓度，mg;1 所收集的吉丁茶,果酸屣吸液忠体然,叫；.If-苦丁茶熊果酸解吸液浓缩干燥后的总干膏重量，mg,“2 结果与讨论3 .1静态筛选考察结果通过静态吸附与解吸考察实验，对4种不同种类的大孔吸附树脂进表4大孔蛹脂静态吸附与解吸考察实监结果"树脂型号'吸附量/(ngg)“吸附率/%“解吸率/%“3HZ-80612.3732022.8542.61«»HZ-81621.32短39.38p65.04“3HZ-81820.84，38.4358.5和PHZ-82619.367“35.7364.5&>3由表4可知，对于吸附苦丁茶熊果酸性能较为优异的3种大孔树脂HZ-816>HZ-818和HZ-826,对苦丁茶中熊果酸的静态吸附量分别为21.324mgg>20.84mgg>19.367mg/g；洗脱性能较为优异的3种大孔树脂为HZ-816、HZ-818和HZ-826,解吸率分别为65.04%、58.53%和64.58%。综合考虑吸附与解吸因素，选择HZ-816型树脂作为本实验分离苦丁茶熊果酸的大孔树脂。4 .2吸附流速对树脂吸附的影响准确称量10.00g已经过预处理的HZ-816型树脂，通过湿法上样的方式，装入树脂柱中。取体积为200m1.、浓度为1.00mg/m1.的提取液5份，分别控制吸附流速(2BVh.3BVh.4BVh>5BV/h、6BVh)进行动态吸附实验考察，测定流出液中苦丁茶熊果酸浓度，并按照公式计算熊果酸吸附量和吸附率，实验结果分别如图1、图2所示。16图1吸附流速对苦丁茶焦果酸吸附量的影响5432IlllQAs/0三音噩眯送吸附漉速(BVb)累sM宓裂筵图2吸附流速对苦丁茶焦果酸吸附率的影响，由图1、图2可知，HZ-816型树脂对苦丁茶熊果酸的吸附量与吸附率均随吸附流速的上升而不断下降，当上样流速为24BV/h时，吸附量与吸附率的减小程度较为平缓，而当流速为5BV/h、6BV/h时，吸附量与吸附率数值急剧减小。故降低吸附流速，可一定程度提高吸附量与吸附率，但同时也会延长达到吸附平衡所需的时间，从而影响工作效率。综合考虑，选择吸附流速为4BV/ho2.3上样浓度对树脂吸附的影响分别量取5份不同浓度的苦丁茶熊果酸提取液200m1.,吸附流速保持在4BV/h,对不同上样浓度（0.6mgm1.>0.8mgm1.>1.0mgm1.>1.2mgm1.>1.4mgn1.）的苦丁茶提取液进行动态吸附实验考察。根据公式分别计算熊果酸吸附量和吸附率，实验结果分别如图3、图4所示。上禅浓度/（nta1.）8B3上哪度财苦丁茶MHifi0明的彭一，图4上1登K8”t苦丁茶算第酷眼甥事的影响-次)*£筌至»筵由图3、图4可见，HZ-816型树脂对熊果酸的吸附量随上样浓度的增大而不断上升，而吸附率随上样浓度增长而平缓下降。分析原因：在本实验考察的上样浓度范围内，HZ-816型树脂的吸附能力还未达饱和,所以随着提取液浓度的上升，树脂吸附量不断上升，而由于树脂吸附苦丁茶熊果酸的能力的增加速度慢于浓度的增长速度，所以树脂吸附率逐步下降。综合考虑，选择上样浓度为1.4mg/m1.o2.4上样体积对树脂吸附的影响分别准确量取5份不同体积（150矶、175m1.>200ni1.、225研、250m1.）、浓度为1.4mg111.的上样液，控制吸附流速为4BVh,研究上样体积对熊果酸吸附量和吸附率的影响，实验结果分别如图5、图6所示。上样体积m1.(ME)/学三至W里图5上檄随对苦丁茶熊果酸吸附量的影响图6上解物对苦丁茶熊果酸吸附率的影响一由图5、图6可知，HZ-816型树脂对熊果酸的吸附量随着上样体积的上升，逐步增大，而吸附率逐步下降。分析原因：当提取液量不断增加，上样液中熊果酸含量不断提高，而上样体积的增幅远大于吸附量的增幅，因此吸附率不断下降。综合考虑，选取上样体积为225m1.,苦丁茶熊果酸吸附量可达18.697mg/go2. 5乙醇浓度对树脂解吸的影响按照上述研究结论，选择最佳的苦丁茶熊果酸分离纯化工艺方案，采用湿法装柱，使大孔树脂吸附熊果酸。分别用浓度为70%、80%、90%、95%的乙醇溶液进行动态解吸实验考察，控制解吸液体积为100m1.,洗脱流速为4BVh,测定解吸液中熊果酸的含量，实验结果如图7所示。6乙”：*<H>图7乙解浓度对善丁茶髓果酸解吸率的影响由图7可知，随着乙醇溶液浓度的增加，大孔吸附树脂的解吸率不断上升，但当乙醇浓度高于90%时，解吸率不断趋于平缓。因此，从经济角度和解吸效率两方面考虑，选择90%乙醇溶液为脱附剂。2.6洗脱曲线取浓度为1.40mgm1.的上样液225m1.,控制吸附流速为4BVh,以90%乙醇溶液为洗脱剂，洗脱流速为4BV/h进行解吸，解吸过程中的每一床层体积为一组，测定每组熊果酸的含量，得到洗脱曲线，如图8所小O图8洗脱曲线*，由图8可知，洗脱曲线对称性好，洗脱峰集中在24BVo采用体积分数为90%的乙醇能较好地洗脱被HZ-816型大孔吸附树脂吸附的熊果酸，解吸液体积为9BV(90m1.)即可基本上将熊果酸完全洗脱下来，实际使用量略大于9BV,故选择10BV解吸液用量。2 .7纯化结果取225m1.浓度为1.40mg/m1.的苦丁茶药液，保持吸附流速为4BVh,进行大孔树脂动态吸附实验；选取90%乙醇为解吸液，解吸流速为4BVh,解吸液体积为10BV(100ITl1.)进行动态洗脱。收集解吸液，测定吸光度，根据熊果酸标准曲线方程，计算熊果酸的含量。将解吸液减压浓缩至膏状，并按公式计算熊果酸纯度，结果如表5所示。衰5苦丁茶黑果隙纯度泅定结果,药淤体积/必，浓度/Cg/乩)熊果酸含量ng'干膏重量ng'纯度/3'提取药港C585.03872251.935/1342.8318.76)解吸液“100p1.2596“125.9626248.26p'由表5可知，经过HZ-816型树脂纯化后，苦丁茶熊果酸的纯度从开始的18.76%提高到48.26%。3 结语通过对大孔吸附树脂进行静态筛选和动态试验考察，筛选出HZ-816型树脂为上样树脂，该树脂纯化熊果酸的优化工艺条件为：吸附流速4BVh,上样浓度1.40mg/m1.,上样体积225m1.,树脂吸附量可达18.697mg/g；以90%乙醇为洗脱剂，洗脱流速4BVh,洗脱剂用量10BV,解吸率可达58.57%,减压浓缩解吸液得干膏，纯度为48.26%。实验结果表明，大孔吸附树脂纯化方法可在一定程度上提高苦丁茶中熊果酸的纯度，具有一定的应用前景。