75%乙醇对黑曲霉菌的杀灭效果研究.docx
摘要：目的：了解一定时间内75%乙醇对黑曲霉菌的杀灭效果。方法：采用75%乙醇对黑曲霉菌菌悬液进行定量杀菌试验，分别用2m1.75%乙醇对2m1.菌悬液进行作用、4m1.75%乙醇对4m1.菌悬液进行作用、6m1.75%乙醇对6m1.菌悬液进行作用、8m1.75%乙醇对8m1.菌悬液进行作用、10m1.75%乙醇对Iom1.菌悬液进行作用，作用时间为40min.结果：部分平皿有菌落生长，生长菌落的时间点不同，菌落数均小于菌悬液对照组的2%,通过3组试验结果计算，被75%乙醇杀灭的菌落总平均比值为99.781%0结论：75%乙醇对黑曲霉菌有较强的杀灭效果，但在一定时间范围内，黑曲霉菌没有完全被75%乙醇杀灭。关键词：75%乙醇；菌悬液；黑曲霉菌；杀灭效果0引言75%乙醇是较为常用的消毒液，试验室通常用75%乙醇消毒桌面、台面以及洁净区房间，甚至用75%乙醇浸泡带菌物品。按照2017年版消毒技术规范(2.1.1.9真菌杀灭试验)规定，消毒剂对黑曲霉菌的杀灭对数值25.00。黑曲霉菌(ASPergiIIUSniger)是一种常见真菌，早在2002年版消毒技术规范关于试验指标菌的规定中，黑曲霉菌被定为致病性真菌的代表。鉴于黑曲霉菌培养的特殊性，一些研究者对其进行了检测，并做了有关消毒剂对黑曲霉菌杀灭效果的评价，但对一定时间内消毒剂对黑曲霉菌的杀灭效果评价报道较少。为了解75%乙醇消毒液在一定时间内对黑曲霉菌的消毒效果，本文对黑曲霉菌菌悬液进行了杀菌试验，以研究75%乙醇对黑曲霉菌的杀灭效果。1 仪器与材料1.1 仪器电热恒温培养箱；生物安全柜。1.2 材料沙氏葡萄糖琼脂培养基；黑曲霉菌CMCC(F)98003；0.9%无菌氯化钠溶液；吐温-80；75%乙醇。2 试验方法2.1 黑曲霉菌抱子悬液的制备首先，取黑曲霉菌CMCC(F)98003冻干菌种管，用麦芽浸膏肉汤培养基进行增菌培养，再经过沙氏葡萄糖琼脂培养基平板划线进行分离培养，选取单个典型菌落接种于沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，在23条件下培养7天，得到新鲜培养物。然后，取5m1.0.9%无菌氯化钠溶液洗下斜面上的抱子，将范子洗脱。最后，采用无菌注射器吸出抱子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1m1.含黑曲霉菌抱子数100200CFU的抱子悬液备用。2.2 中和剂的制备取含20g/1.吐温-80的胰蛋白陈大豆肉汤培养基（TSB）作为中和剂，能起到有效中和75%乙醇对试验菌的残留作用。2 .375%乙醇对黑曲霉菌的杀菌试验将75%乙醇分装成0m1.>2m1.、4m1.、6m1.、8m1.、10m1.的消毒液（阳性对照用0.9%无菌氯化钠溶液），置于室温下备用；取分别2m1.、4m1.、6m1.>8m1.、IoIn1.的黑曲霉菌狗子悬液（黑曲霉菌胞子数100200CFU）于5支无菌试管中。然后，用不同体积的75%乙醇分别对5个不同体积的抱子悬液进行作用至预定时间，取0.5m1.菌药混合液加入至4.5In1.的中和齐式含20g/1.吐温-80的TSB）管内。中和作用IOmin,取样品液接种进行活菌计数培养，计算杀灭对数值。该试验重复3次。3 试验结果上述试验重复做3次，试验结果及分析分别如表1、表2、表3所7J。«I7%乙心对Ka毒刘杀君试的统果分析（«I次7邻乙创/91.合陋山<CWh1.>W.作用不同时闽西落生长的平均数值/（CFU11>15aIn20*in25Bin30Un35Aln40aIn组组平均也平均值<as恩港对黑姐/试场组）0100-281150165141121157138145.33145.332100-20020001000.174100*-20040000100.176100-20060002000.330.2668100-20080101000.33IO100-200100001100.33未被滴毒清杀灭平均比值（试蛉组平归的落VV用鼠港对黑姻平均（B落»）0.183X在表1中，0m1.的75%乙醇为菌悬液对照组。黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合后，每组数据显示黑曲霉菌均己被大幅度杀灭。2m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30Inin后有1个黑曲霉菌菌落生长；4m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合35min后有1个黑曲霉菌菌落生长；6m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30min后有2个黑曲霉菌菌落生长；8m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20min后有1个黑曲霉菌菌落生长，8m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30Inin后有1个黑曲霉菌菌落生长；IOm1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30Inin后有1个黑曲霉菌菌落生长，10m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合35min后有1个黑曲霉菌菌落生长。上述5组试验生长的菌落数均小于菌悬液对照组的2%,生长黑曲霉菌的时间点不是随着时间的变化而变化，大部分的黑曲霉菌已经被杀灭，残留极少的黑曲霉菌在混合液中分布不均匀。因此，在每个时间点都可能会生长黑曲霉菌。另外，35min内黑曲霉菌没有完全被杀灭，未被消毒液杀灭的菌落平均比值为0.183%。表275、乙解对黑曲宫国杀国试蛉的结果分析（第2次）79kZSZn1.含菌量/(CFUZb1.)由悬满SZn1.作用不同时间由落生长的平均数值（CFU/皿）15Bin20Rin25in30Jdn35Min40Rin单组平均18平朗8（菌黑酒对照组/试蛉组）O182001118110101130139Ill118.17118.172100-20020000000410020040000100.1761820061202000.83Ol334810020080001000.1710100-200100110010.50未被泊毒液杀灭平均比值（试蛤组平均的落数/苗悬流对照组平均苗落数）在表2中，0m1.的75%乙醇为菌悬液对照组。黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合后，每组数据显示黑曲霉菌均己被大幅度杀灭。4m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合35Inin后有1个黑曲霉菌菌落生长；6m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合15min后有1个黑曲霉菌菌落生长，6m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20min后等体积混合30min后有1个黑曲霉菌菌落生长；Iom1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20min后有1个黑曲霉菌菌落生长，Iom1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合25min后有1个黑曲霉菌菌落生长，10m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合40min后有1个黑曲霉菌菌落生长。上述5组试验生长的菌落数均小于菌悬液对照组的2%,生长黑曲霉菌的时间点不是随着时间的变化而变化，大部分黑曲霉菌已经被杀灭，残留极少的黑曲霉菌在混合液中分布不均。因此，在每个时间点都可能生长黑曲霉菌。另外，40min内黑曲霉菌没有完全被杀灭，未被消毒液杀灭的菌落平均比值为0.283%。«37队乙胡对黑曲雪SD杀3B试聆的结果分析（第3次）作用不同时徇08落生长的平均散（CFWfflP7SK乙M.含国量/(CRJZb1.)Zt1.15*ln20Bln25Mn30Bin35>ln40ain单组平均值平均值三s对摩组/试/组）O100-20011341201241391101C6122122210CT-20020001000.1741所20040110100.506100-20060020000.330.23<81所20080100000.17IO100*200100000000未被泊用杀灭平均比值（试做组平均困薄矽/国愚港对照组平均国界数）在表3中，0m1.的75%乙醇为菌悬液对照组。黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合后，每组数据显示黑曲霉菌均己被大幅度杀灭。2m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合30Inin后有1个黑曲霉菌菌落生长；4m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合20min后有1个黑曲霉菌菌落生长，4m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合25min后1个有黑曲霉菌菌落生长，4m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙醇等体积混合35min后有1个黑曲霉菌菌落生长；6m1.黑曲霉菌菌悬液与75%乙组试验生长菌落数均小于菌悬液对照组的2%,生长黑曲霉菌的时间点不是随着时间的变化而变化，大部分黑曲霉菌已经被杀灭，残留极少的黑曲霉菌在混合液中分布不均。因此，在每个时间点都可能生长黑曲霉菌。另外，35min内黑曲霉菌没有完全被杀灭，未被消毒液杀灭的菌落平均比值为0.192%。通过对上述3次试验结果分析，可得出每次黑曲霉菌未被75%乙醇杀灭的菌落平均比值，从而计算出每次已被75%乙醇杀灭的菌落平均比值，进而算出已被75%乙醇杀灭的菌落总平均值。综合分析结果如表4所示。表475%乙薛对黑曲君茵重复3次杀国试皎结果的综合分析试物次数每次未被消毒港杀灭的菌落平均比值福次已被消渗港杀灭的菌落平均比值10.183X99.81?%20.283%99.717%30.192X99808X总平均值0.219%99.781%通过重复3次的试验数据统计，75%乙醇对菌悬液作用40min内，未被75%乙醇杀灭的菌落总平均比值为0.219%。第1次试验结果己被75%乙醇杀灭的菌落平均比值为99.817%,第2次试验结果已被75%乙醇杀灭的菌落平均比值为99.717%,第3次试验结果已被75%乙醇杀灭的菌落平均比值为99.808%,由此可得3次试验已被75%乙醇杀灭的菌落总平均比值为99.781%o4试验讨论本次研究重复3次试验，3次试验结果数据有一定的差距，试验全过程均在生物安全柜内进行，需要用的试管、吸管、平皿等器具均通过湿热灭菌后方可使用，试验前开启紫外灯对生物安全柜灭菌消毒20min,消毒完毕待风机运行30min后进行试验。3次试验操作人员不变，操作时间、操作人员的动作幅度以及环境等因素，会对试验结果产生一定的影响。5结语本研究结果显示，75%乙醇消毒液对黑曲霉菌的杀灭能力很强。黑曲霉菌作为第四类病原微生物，通常情况下不会引发人类疾病，但会对药品生产检验和环境构成威胁，75%乙醇消毒液能使黑曲霉菌的蛋白质凝固，使其不能形成薄膜，通过酒精持续向其内部渗透并进行消毒杀菌，本试验杀灭效果可达到99.781%o
