GB_T42470-2023纳米技术基于斑马鱼胚胎的纳米材料毒性评价.docx

ICS07.120CCSC04OB中华人民共和国国家标准GB/T424702023纳米技术基于斑马鱼胚胎的纳米材料毒性评价NanotechnologiesAssessmentofnanomaterialtoxicityusingdechorionatedzebrafishembryo(ISOTS22082:2020,MOD)2023-03T7发布2023To-Ol实施国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会目次前言I引言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14缩略语25材料25.1 生物体（斑马鱼，Daniorerio）25.2 储备液35.3 阳性对照36设备36.1 技术设备36.2 分析仪器37步骤47.1 养殖47.2 产卵刺激47.3 胚胎破膜57.4 纳米材料储备液的制备67.5 试验浓度67.6 纳米材料的分散67.7 阳性对照化学物：3,4-二氯苯胺67.8 试验方法77.9 数据分析88试验报告88.1 试验步骤88.2 报告中包含的信息8附录A（资料性）机械破膜法10附录B（资料性）斑马鱼胚胎产卵步骤11附录C（资料性）结果验证12参考文献13前言本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件修改采用IS0/TS22082:2020纳米技术基于斑马鱼胚胎的纳米材料毒性评价，文件类型由ISo的技术规范调整为我国的国家标准。本文件与IS0/TS22082:2020的技术差异及其原因如下：一原图1不符合5.1描述中雌鱼大雄鱼小的形态特征，因此更改了图1中雄性及雌性斑马鱼图片（见图1）；在5.2中增加了注释内容，引用国家标准对纯净水的质量做了说明（见5.2）;一一在5.2中增加了对后文储备液配置方法部分的引用（见5.2）;6.1.2中光照周期不符合常规实验及国内惯例，故引用相关国家标准，更改了光照周期的数值（见6.1.2）;一按照国内惯例，在7.3.2增加了“分析纯”来界定化学品的纯度级别（见7.3.2）;7.8.3中试验步骤需顺序进行，因此更改了各步骤前的“一”符号，将其修改为英文字母编号（见7.8.3）<,请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国科学院提出。本文件由全国纳米技术标准化技术委员会（SAGTC279）归口。本文件起草单位：首都医科大学、中国医学科学院基础医学研究所。本文件主要起草人：孙志伟、李阳、段军超、陈月月、李艳博、许海燕、孟洁。鱼类试验是广泛应用于评价水环境中化学物毒性的重要手段。然而，使用包括鱼在内的脊椎动物对化学物进行测试存在动物福利问题。用已发育完全的幼鱼进行测试会给动物带来明显不适（如使用OECDTG203）,使用生命早期的鱼胚胎而不是成鱼或幼鱼进行测试是一种更符合动物福利的替代方法。纳米技术正在诸多领域发挥积极作用，但人们仍然对纳米产品的环境潜在危害有所担忧。经济合作与发展组织（OECD）使用鱼胚胎评估急性毒性的试验指南（见OECDTG236）指出，有些化学物可能不适用这一方法进行试验，如分子量23kDa的大分子结构物质和引起孵化延迟的物质。卵膜是鱼胚胎最外层的非细胞包膜，其屏隙作用会妨碍化学物或纳米材料生物活性的评价，目前尚无法预测哪些纳米材料受到该屏障的影响。使用去卵膜胚胎进行毒性评估尽管不能提供直接的生态毒理学信息，但可能有助于更好地识别具有潜在危害的纳米材料。因此，世界各国的研究人员已开发了很多方法，去除生命早期阶段斑马鱼胚胎的卵膜45。去除胚胎卵膜有两种方法：酮破膜法和机械破膜法。与机械破膜法相比，酶破膜法具有如下优点（见附录A）:节省时间和劳动力、可避免胚胎的机械损伤，同时能提供大量破膜胚胎进行高通量测试。但酶破膜法的一个不足之处在于链霉蛋白酶活性的变化可能影响卵膜去除的成功率。许多研究小组已经使用去卵膜胚胎进行化学物和纳米材料的毒性评价69,但方法尚未完全标准化1卜口3。去卵膜斑马鱼胚胎可作为其他脊椎动物系统的替代系统，用于检测纳米材料的潜在危害。随着高等动物模型毒性试验的不断优化，对替代试验方法的需求在持续增加。生命早期阶段的斑马鱼（独立摄食前，即受精后12Oh内）是一种非常好的体内毒性试验替代模型2328°与其他动物模型相比，斑马鱼模型有许多优势，包括相对容易饲养和繁殖、繁殖力强（体外受精、一条雌鱼可产200个300个胚胎）、发育周期短（约3个月成年）、基因组资源的可获得性（完整的斑马鱼基因组序列）以及基因与人类的相似性。与人类基因组的比对表明，大约70%的人类基因在斑马鱼中存在至少一个同源基因4,因此斑马鱼已经越来越多地应用于化学物毒性评价。本文件提供了使用去卵膜斑马鱼胚胎进行毒性评价的方法，推荐了去除斑马鱼胚胎卵膜的一种优化程序，同时讨论了采用去卵膜胚胎进行鱼类毒性评价的优点。纳米技术基于斑马鱼胚胎的纳米材料毒性评价1范围本文件规定了一种快速评价纳米材料毒性的方法(鱼类生命早期阶段，0HPF-120HPF),包括去除卵膜的详细操作步骤和使用去卵膜斑马鱼胚胎评价纳米材料毒性的完整方案。本文件的重点是测试纳米材料的毒性。本文件适用于商业化及非商业化纳米材料的毒性检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T66822008分析实验室用水规格和试验方法IS0/TS12805纳米技术材料规范纳米物体特征指南(NanOtCChnolOgieSMaterialsspecificationsGuidanceonspecifyingnano-objects)注：GB/T371562018纳米技术材料规范纳米物体特性指南(ISO/TS12805:2011,IDT)ISO/TR13014纳米技术纳米材料毒理学评价前理化性质表征指南(NanOteChnolOgieS-Guidanceonphysico-chemicalcharacterizationofengineerednanoscalematerialsfortoxicologicassessment)注：GB/T392612020纳米技术纳米材料毒理学评价前理化性质表征指南(ISO/TR13014:2012,IDT)IS0/TS17200纳米技术粉体纳米颗粒表征和测量(NanOteChnolOgyNanoparticlesinpowderform-Characteristicsandmeasurements)IS0TR18196纳米技术纳米物体表征用测量技术矩阵(NanotechnologiesMeasurementtechniquematrixforthecharacterizationofnano-objects)注：GB/T412O42021纳米技术纳米物体表征用测量技术矩阵(ISO/TR18196:2016,MoD)ISO22412粒度分析动态光散射法(PartiClesizeanalysisDynamiclightScattering(D1.S)ISO/TS80004-1纳米科技术语第1部分：核心术语(NanoteChnolOgieSVocabulary-Part1:Coreterms)注：GBT30544.12014纳米科技术语第1部分：核心术语(ISO/TS80001-1:2010,1DT)ISO/TS80004-2纳米科技术语第2部分：纳米物体(NarK)technologiesVocabularyPart2:Nano-objects)OECDTG236:鱼胚胎急性毒性试验OECD化学品测试指南第2部分.OECD出版社，巴黎，2013(TestNo.236:FishEmbryoAcuteToxicity(FET)Test,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals.Section2.OECDPublishing,Paris,2013)3术语和定义ISO/TS12805、ISO/TR13014、ISO/TS17200、ISO/TS80004-1>ISO/TS80004-2、OECDTG236界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1增溶剂solubilizingagent在溶液中起到分散和稳定纳米材料作用的溶剂或分散剂。3.2产卵spawning将卵排到水中受精。3.3阳性对照positivecontrol通过特定的测试方法进行评价时，可以证明测试系统的适用性，即在测试系统中产生可重复的、适当的阳性或反应性的任何充分表征的材料或物质。来源：ISO10993-10:2010,3.143.4剂探索试验range-findingtest简化的急性试验，将试验生物体暴露在大剂量范围的纳米材料试验溶液中，以确定用于正式试验的浓度范围。注：该试验包括至少5浓度的纳米材料处理组和未经处理的对照组。来源：OECDTG236:2013,有修改3.5半数致死浓度1.C$0有毒物质导致一组试验生物体半数(50%)死亡的浓度。注：通常该物质的暴露水平是连续的，IJCso是根据个特定的暴露期来定义的。来源：ISO6107-3:1993,39,有修改4缩略语下列缩略语适用于本文件：DO:溶解氧(dissolvedoxygen)DPF:受精后天数(daypostfertilization)EM:胚胎培养基(embryomedia)HPF:受精后小时数(hourpostfertilization)NOAE1.:未观察到有害作用水平(noobservedadverseeffectlevel)5材料5.1 生物体GS马鱼，Daniorerio)斑马鱼(见图D是鲤科的一种热带淡水硬骨鱼，自然分布在印度、巴基斯坦、孟加拉国、尼泊尔和缅甸。成年斑马鱼的平均体长为2cm3cm,并有蓝色条纹，类似于斑马的身体侧面。成年雄性斑马鱼的身体较瘦，有蓝色和金色条纹。雌性斑马鱼腹部发白，身体比雄性大，有银色而非金色条纹。斑马鱼可以在水族箱中饲养和繁殖，器官发生在5个DPF内完成，约3个月成年，寿命约为2年3年。a）雄性b）雌性图1斑马鱼5.2 储备液使用纯净水现用现配（见7.4）。实验室用水达到GB/T66822008中规定的最低标准。5.3 阳性对照3,4-二氯苯胺（3,4-DCA）（CAS#95-76-1）。6设备6.1 技术设备6.1.1 容器可以使用多孔板（6孔或12孔）进行化学物暴露。为防止水分在暴露过程中蒸发，宜使用生物相容性基材（如封口膜或透明的自粘箔）密封容器。6.1.2 孵化器孵化温度控制在27C±1,光照周期控制为14:10（08：暗）（见GB/T396492020）.注：原ISO技术规范中光照周期为10:14（明：暗）,但这一光照周期不符合常规试验及国内惯例，故将光照周期修改为14:10（明：暗）。6.1.3 显微镜体视或倒置显微镜，放大倍数不低于80倍。6.1.4 K三M通常由一个互相匹配的产卵框和一个稍大的收集缸组成，尺寸不限。产卵框底部的网格尺寸为2mm±0.5mm,可使排放的卵立刻掉落，以免亲鱼吞食。6.1.5 移液器单通道移液器。6.2 分析仪器使用ISO/TR18196中给出的及以下分析仪器。6.2.1 扫描电子显微镜(SEM)利用电子束扫描纳米材料表面获得放大图像。6.2.2 透射电子显微镜(TEM)利用电子束穿过样品并与其相互作用获得纳米材料的放大图像。6.2.3 动态光散射仪(D1.S)用于测定液体中纳米材料的粒度分布。6.2.4 IB态多重光散射仪(SM1.S)用于分析浓缩分散液中的粒径变化。6.2.5 电感耦合等离子体质谱(ICPMS)用于检测和定量浓度低至1075的金属离子。7蜘7.1 养殖7.1.1 斑马鱼品系应给出斑马鱼品系。成年斑马鱼宜无外部可见疾病和感染，并且6个月内未接受任何药物处理。成年斑马鱼宜在最佳条件和密度下饲养以保持健康。7.1.2 饲养方式成年斑马鱼每天采用活的丰年虾无节幼体(Artemiasp.)或市售干饵料喂食两次，宜避免过量喂食。为了保持最佳水质，宜每天清除所有剩余食物。仔鱼和幼鱼每天要用干饵料喂食3次。应记录喂食量。7.1.3 光照周期建议光照14h,黑暗10ho应记录光照周期的偏差。7.1.4 温度和PH斑马鱼养殖水温建议在26°C28°C,pH接近中性。应记录实际水温和pH。7.1.5 鱼缸材料用来养殖斑马鱼的鱼缸宜由优质玻璃、聚碳酸酯或丙烯酸制成。7.2 产卵刺激鱼胚胎可通过年龄在3个月12个月之间的亲鱼繁殖获得。成年斑马鱼可以雌雄单独配对或成群配对产卵，产卵在市售设备或定制装置中进行。将成年斑马鱼以2:1或1:1(雌性：雄性)的性别比放入繁殖缸中，开启全光谱白光刺激产卵，在灯光开启后1h内收集胚胎。胚胎采用EM冲洗几次，肉眼检查并将卵膜内部不透明和/或细胞破裂的未受精胚胎移除(见附录B)。7.3 睇飒7.3.1 方法胚胎破膜通常有两种方法：机械破膜法和酶破膜法。机械破膜法准备时间短、不需要酶，但破膜过程费时费力。机械破膜法在体视显微镜下手动操作去除早期胚胎的卵膜(0HPF-IOHPF)时存在一定难度，有时会对胚胎造成机械损伤，可能导致斑马鱼生命后期的缺陷。酶破膜法使用从菌种中提取的蛋白酶，可同时对大量胚胎进行破膜。7.3.2以下为化学品(分析纯)、物料和设备的准备的具体要求。-11.EM配制：分别将0.292g氯化钠(NaC1)、0.013g氯化钾(KCI)、0.044g氯化钙(CaCI2)和0.081g硫酸镁(MgSO4)溶于纯净水定容至11.,配制含5.0mMNaC1、0.17mMKCk0.33mMCaCl2和0.33mMMgS04的溶液，采用0.0INNaOH或0.01NHCI将溶液PH调整至7.4。收集受精的胚胎，并根据需要分离尽可能多的处于4HPF发育阶段的胚胎(比实际需要的胚胎数量多20%)。链霉蛋白酶(EC3.4.24.4;CAS#9036-06-0)储备液配制。该酶是从灰链霉菌中获得的几种非特异性内切蛋白酶和外切蛋白酶的混合物，可以将蛋白质消化成单个氨基酸。使用蒸馆水在冰上制备醐原液，按100H1.进行分装，-80C储存备用。-于90mm玻璃培养皿中，用25m1.含19.1U酶(终浓度0.764Um1.)的EM中处理带卵膜的胚胎(1000个)。一轻轻摇动5min或6min,使用至少总计500m1.的EM漂洗6min,然后用终止混合物(不含链霉蛋白醐)浸泡3min0一冲洗后，使胚胎在27°C±1°C下静置20min-30min。然后在另一个EM漂洗周期(6min)去除培养皿中残留的破碎卵膜。在破膜过程中，避免胚胎接触空气或塑料。建议使用阔口径的抛光玻璃吹吸管。酶破膜法示意图见图2。二三百南（来百灰苞链毒菌T4HPF斑马鱼胚胎浓度：19.lU25m1. 温度：27±ir5min或6min后冲洗 温度：27C±ir,胚胎静理20min-30min 冲洗（至少3遍）标引符号说明：A一正常胚胎;B破膜胚胎。7.4 纳米材料储备液的制备储备液用纯净水现配，如果需在介质中分散纳米材料，可按照参考文献15中描述的分散方法，通过超声波和（或）搅拌的方式制备储备液。必要时可使用增溶剂（溶剂或分散剂）分散纳米材料。在试验过程中，宜根据材料的种类选择适宜的方法对纳米材料在介质中的分散稳定性进行检测。若使用增溶剂，浓度不宜超过00K（体积分数），并需增设增溶剂对照组，保持各组试验容器一致。增溶剂不宜对胚胎产生影响（如存活、畸形或其他任何不良反应）。如有必要，宜采用酸消解和ICP-MS测定储备液中的金属离子浓度。7.5 试验浓度通过连续稀释储备液来制备所需浓度的测试液。必要时可使用增溶剂（溶剂或分散剂）分散纳米材料、7.6 纳米材料的分散符合ISO22412中纳米材料的分散状态。7.7 阳性对照化学物：3,4-二氯苯胺3, 4-二氯苯胺是一种非特异性的膜刺激剂或代谢抑制剂，在化学工业中用作合成3,4-二氯苯基异氟酸酯、除草剂丙烯和涤纶织物用的偶氮染料的中间体。许多研究151对3,4-二氯苯胺的毒性进行过测定。在OECDTG236中，建议将3,4-二氯苯胺作为阳性对照，后续研究也证实了其作为阳性对照的有效性1820。在本文件中，以3,4-二氯苯胺（4.0mg1.）为阳性对照进行试验验证。在这个试验浓度下,阳性对照组120HPF胚胎的死亡率宜至少达到30%。7.8 试验方法7.9 i水质检测在试验开始和结束时，对试验溶液的水质进行检测、记录和报告。检测内容包括pH、溶解氧含量和电导率等。7.10 2去卵膜胚胎的制备见7.3中的试验方法制备。7.11 3暴H以下为纳米材料暴露的具体步骤。a）选择健康且形态正常的4HPF斑马鱼胚胎，采用0.764UZm1.的链霉蛋白酶除去卵膜（见7.3）。b）在试验开始时测定实际颗粒浓度。c）新破膜的胚胎在培养箱中孵育直到试验开始。将10个处于6HPF发育阶段的健康破膜胚胎分别放入装有测试液的培养板中（6孔板为4m1.孔；12孔板为2m1.孔）。d）将培养板用封口膜或透明的自粘箔覆盖，置于温度可控的培养箱中。e）在半静态培养系统中，每24h彻底更换一次测试液以保证浓度稳定，直到测试结束。纳米材料毒性测试的胚胎暴露周期为6HPF120HPF0f）最终试验至少宜设置5个测试浓度，以不大于2.2的固定倍数逐级稀释得到。若使用增溶剂，浓度宜不大于0.01%（体积分数），并保持各组试验容器一致。每组3个复孔。g）暴露24h后，测定实际颗粒浓度。h）暴露期间每天使用体视显微镜观察胚胎。记录并从孔中移除死亡胚胎。通过检查可见的终点来确定胚胎（仔鱼）死亡（见7.8.4）oi）记录死亡胚胎的数量，并绘制死亡率反应曲线。j）为了计算出准确的1.C5。，最终试验浓度宜包括NOAE1.浓度和100%致死的浓度。为了确定1.C。，需对纳米材料进行两轮测试。首先对纳米材料进行剂量探索试验，根据剂量探索试验的测试结果来确定最终试验的浓度设置。剂量探索试验中，试验浓度应间隔较大（例如：0.1mg/1.、1.0mg/1.、Iomg/1.、100mg1.）07.12 4观察终点7.&41死亡在显微镜下观察到有胚胎凝结、尾部未分离、无心跳和体节未形成这四项测试终点中任何一项就可确定胚胎（仔鱼）死亡。试验期间需每日在体视显微镜下观察胚胎（或仔鱼）O7.8.4.2睇耀胚胎凝结时其半透明性明显丧失，呈现出颜色变化及浑浊的外观。7.8.43尾部未分离尾部不能从卵黄囊中分离的胚胎视为死亡。Z&44，诲心脏跳动在48HPF易于观察到。如果胚胎（或仔鱼）没有呼吸运动和（或）没有心跳，则视为死亡。心跳不规律（不稳定）的不认为是死亡。7.8.4.5体节未形成正常胚胎在24HPF后形成体节，最晚48HPF体节应该形成。7.9数据分析根据95%置信区间内120HPF的1.C。来评价受试样品的毒性。通过概率分析和非线性logistic回归模型计算。8试验报告8.1 试验步骤试验报告应与所使用的试验步骤一致。8.2 报告中包含的信息8.2.1 受试纳米材料在报告中说明受试纳米材料的如下信息。受试物：制造商代码、目录或配方号、批号或生产日期及商品名称等。一纳米材料的理化性质：类型、形状、尺寸、包覆材料及纯度等。纳米材料在EM和纯水中的稳定性。8.2.2 受遨I马鱼品种在报告中说明受试斑马鱼的如下信息。一斑马鱼来源（包括品系名称及发育阶段）。一一用于破膜的4HPF斑马鱼胚胎数量。用于暴露的6HPF斑马鱼胚胎数量。8.23材料和仪器在报告中说明所使用材料和仪器的如下信息。 使用的测试容器描述：鱼缸、烧杯、繁殖缸等。分析设备描述：D1.S、SEMsTEMsICP-MS.SM1.S等。 纳米材料制备说明：储备液和测试液的制备、增溶剂（如果使用的情况下）及其他溶剂的制备等。 阳性对照制备说明：储备液和测试液的制备。8.2.4SWjW在报告中说明所用辅助材料的如下信息。胚胎收集的描述：繁殖缸的准备。破膜方法的描述（见7.3）o8.25 i½W在报告中说明试验设计的如下信息。处理条件的描述：使用的动物数量及重复试验次数等。8.26 雌雄在报告中说明试验条件的如下信息。一暴露条件描述：稀释水的来源和水质（pH、DO、电导率等），暴露条件（温度、亮/暗条件等）。一纳米材料性质检测：稳定性（试验开始和结束时材料的聚集状态、粒径和Zeta电位等）、纳米材料在试验开始时和24h后的实际浓度（如果可能的话）、金属基纳米材料（如AgNP）释放的离子浓度。8.27 结果在报告中说明结果的如下信息。一对照组和纳米材料暴露组中斑马鱼胚胎或仔鱼的死亡数量（见7.8）O计算120HPF的1.CO（见7.8.4）。结果有效性验证（见附录。附录A（资料性）机械破膜法A.1操作步骤以下为机械破膜法操作步骤。a）准备一对经过消毒的精密镜子。b）收集同一天的受精胚胎，并使用4HPF的胚胎进行试验。c）双手各拿一只镜子，在体视显微镜下，于胚胎侧面的两个相近位点夹住卵膜。d）拉开镜子，撕开卵膜。e）观察胚胎有无损伤迹象，如细胞层撕裂或卵黄穿孔。不要使用受损胚胎进行试验。A.2优点以下为机械破膜法优点。操作简单。可快速获得少量破膜胚胎。A.3缺点以下为机械破膜法缺点。一需要大量练习方可熟练操作。获得大量破膜胚胎费时费力。一胚胎机械损伤率高。一不适合高通量检测方法。机械破膜法示意图见图A.1。注：来源见参考文献21。图A.1机械破膜法附录B（资料性）斑马鱼胚胎产卵步躲斑马鱼胚胎产卵操作步骤如下： 准备繁殖缸（见图B.1）; 胚胎由3个月12个月龄的亲鱼获得；一将雌性和雄性亲鱼（性别比为2:1或1:1）放入繁殖缸中，并由挡板隔开;一一将繁殖缸置于黑暗条件下：一一打开白光刺激产卵，取出挡板，产卵过程约Ih; 用网筛收集胚胎； 用EM清洗胚胎数次，以去除碎片：一将清洗后的胚胎转移到装有EM的培养皿中，以备后续进行破膜处理。图B.1斑马鱼繁殖缸附录C（斐料性）结果验证有效的试验结果满足以下条件：a）试验过程中，对照组（稀释水对照和溶剂对照）中斑马鱼胚胎总存活率宜290%;b）试验期间水温应保持在27±1;c）试验开始和结束时，溶解氧浓度应为空气饱和度的60%100%,即21°C和1个大气压条件下浓度为5349mg/1.8915mg/1.;d）在批次试验中，收集的鱼卵总受精率宜N70%。参考文献1 GB/T396492020实验动物实验鱼质量控制2 ISO6107-3:1993Waterquality-Vocabulary-Part3:3 ISO10993-10:2010BiologicalevaluationofmedicaldevicesPartIOrTestsforirritationandskinsensitization4 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