《动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法》编制说明.docx

团体标准动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法（征求意见稿）编制说明一、项目来源根据下达2023年第二十八批团体标准制修订项目计划的通知（桂标协（2023）99号）文件精神，由广西兽医协会提出，广西悦牧生物科技有限公司、桂林市动物疫病预防控制中心、广西壮族自治区动物疫病预防控制中心（广西壮族自治区屠宰技术中心）等单位共同起草的团体标准动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法（项目编号：2023-2802）获批立项。二、项目背景及目的意义衣原体（ChIaInydia）是一类严格寄生于细胞内且具有独特发育周期并能通过细菌滤器的原核生物。1957年，衣原体被归类为细菌学范畴。衣原体不同于病毒,含有DNA和RNA两种核酸物质，以二分裂的方式繁殖，对抗生素和磺胺类药物敏感。衣原体在自然界中分布广泛，感染宿主种类繁多，目前已发现有几十种哺乳动物和近200种鸟类及禽类均可自然感染衣原体，家畜中以羊、牛、猪较为易感，犬、猫、马也有易感性。禽类中以鹦鹉和鸽子比较易感，鸡、鸭子、火鸡也能被感染。此外，野猪、野兔、猴子等野生动物也具有易感性。衣原体可引起人类、畜禽及鸟类的多种疫病，在动物界和人类中广泛流行。衣原体病是由衣原体引发的人畜共患传染病，并且能在不同宿主之间交叉感染，是一种高度接触性传染病。动物感染后表现为流产、肠炎、肺炎、结膜炎、多发性关节炎及脑脊髓炎等多种病症，人类感染后以发热、头痛、肺炎为主要特征,对公共卫生安全构成严重威胁。鹦鹉热衣原体属于衣原体科衣原体属的独立种群，为世界动物卫生组织规定的二类动物疫病，在国际进出口贸易中属于必检的病原体。鹦鹉热衣原体能够引起家禽和鸟类呼吸道与消化道疾病，也可导致哺乳动物流产，同时还会造成人类呼吸道感染和菌毒血症，临床上称为“鹦鹉热”或“鸟疫:此外，有国内外学者研究发现，鹦鹉热衣原体会下调动物机体免疫细胞功能造成免疫机能抑制，与其他病毒和细菌协同混合感染，增加易感动物的发病率和病死率，给畜禽养殖业造成巨大经济损失。鹦鹉热衣原体最早于二十世纪三十年代由亚马孙绿鹦鹉引发并在欧洲和美洲大流行。1.in等对法国农场鸡群进行鹦鹉热衣原体血清学检测，结果发现血清阳性检出率达90%以上。Akter等从19942019年澳大利亚马流产病例中检出鹦鹉热衣原体阳性率为6.5%oCong等对宠物鸟类的鹦鹉热衣原体血清学检出率达12.5%oWang等研究发现丹麦法罗群岛因狩猎海鸟暴发的疫情，造成20%的人群感染并死亡与鹦鹉热衣原体有关。1.in等研究报道称，鹦鹉热衣原体会导致蛋鸭产蛋性能下降。以上表明，鹦鹉热衣原体在全球不同品种畜禽中存在较高的感染情况，且对公共卫生安全造成较大威胁。因此，需加强对鹦鹉热衣原体流行病学调查与遗传进化动态规律分析。本项目起草单位拥有生物11级分子生物学实验室，划分病料处理区、核酸提取区、反应液配制区及核酸扩增区等职能区，配备II级生物安全柜、核酸自动抽提仪、实时荧光PCR扩增仪等仪器设备。检测人员均为本科及以上学历，硕士研究生占比超过80%以上，从事动物疫病流行病学调查、采样及检测年限超过3年以上。拥有专门配套的动物疫病监测经费，保障业务顺利开展。因此，本项目组能够熟练掌握并开展动物疫病的病原学监测与检测业务。目前，国内建立有猪衣原体病检疫技术规范、动物衣原体病诊断技术、牝牛衣原体病防治技术规范、禽衣原体病检疫技术规范等技术标准，尚无针对鹦鹉热衣原体建立相应的快速高效特异的检测技术标准。此外，现有的关于衣原体检测技术标准仅有间接血凝试验、补体结合试验、琼脂免疫扩散试验、细胞分离培养及普通PCR方法，以上技术存在耗时长、敏感性低、结果判定有人为的误差影响等不足。基于此，本项目建立了鹦鹉热衣原体TaqMan探针实时荧光PCR检测方法，该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好，根据扩增曲线和循环数即可判定检测结果等优点，为鹦鹉热衣原体临床监测检测和流行病学调查提供快速、高效、特异的技术支持。三、项目编制过程（一）成立标准编制工作组团体标准动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法项目任务下达后，广西悦牧生物科技有限公司牵头组织成立了标准编制工作组，制定了标准编写方案，明确任务职责，确定工作技术路线，开展标准研制工作，具体由桂林市动物疫病预防控制中心、广西壮族自治区动物疫病预防控制中心（广西壮族自治区屠宰技术中心）相关人员配合。（一）收集整理文献资料标准编制工作组收集了国内有关动物鹦鹉热衣原体快速检测的相关技术文献资料。主要有：GB19489-2008实验室生物安全通用要求NY/T541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范SN/T1193-2018基因检验实验室技术要求SN/T5488-2022猪衣原体病检疫技术规范NY/T562-2015动物衣原体病诊断技术（三）研讨确定标准主体内容标准编制工作组在对收集的资料进行整理研究之后，标准编制工作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。经过研究，标准的主体内容确定为动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测的术语和定义、原理、试剂、仪器设备、样品采集与处理、核酸提取、核酸扩增、阴性及阳性对照、试验成立条件、结果判定等技术要求。（四）调研及形成草案、征求意见稿2023年9月，在前期工作的基础之上，通过理清逻辑脉络,整合已有的参考资料中有关动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法的要求，并结合动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法实际要求的基础上，按照简化、统一等原则编制完成团体标准动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法（草案）。2023年10月-12月，标准编制工作组对前期的研究和数据进了整理并结合前期技术咨询会、征求意见会的内容针对动物动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法进行多次讨论、研究，最终形成团体标准动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法（征求意见稿）和编制说明。四、标准制定原则（一）实用性原则本文件是在充分收集相关资料和文献，分析动物鹦鹉热衣原体的快速检测技术当前现状，调研动物鹦鹉热衣原体的快速检测技术方法情况，在现有国家、行业标准相关动物衣原体测定方法要求的基础上，结合单位和部门多年从业经验而总结起草的。符合当前使用荧光定量PCR方法检测动物鹦鹉热衣原体的方向与需求，有利于行业的高质量健康发展，具有较强的实用性和可操作性。（二）协调性原则本文件编写过程中注意了动物鹦鹉热衣原体的检测相关法律法规的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。（三）规范性原则本文件严格参照GB/T1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的要求和规定编写本标准的内容，保证标准的编写质量。（四）前瞻性原则本文件在兼顾当前区内采用动物鹦鹉热衣原体的快速检测现实检验情况的同时，还考虑到了动物鹦鹉热衣原体的检测方法快速发展的趋势和需要，在标准中体现了个别特色性、前瞻性和先进性条款，作为对动物鹦鹉热衣原体检测的指导。五、标准主要章节内容及确定依据团体标准动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法主要内容包括动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测的原理、试剂、仪器设备、样品采集与处理、核酸提取、核酸扩增、阴性及阳性对照、试验成立条件、结果判定等技术要求。（一）原理根据动物鹦鹉热衣原体基因特定序列的保守片段，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。TaqMan探针两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。当PCR扩增时，探针被酶切降解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，荧光报告基团发出可被仪器接收的荧光信号，通过标准曲线对未知模板进行定量分析。（二）试剂1.DNA提取试剂盒。选用商品化的DNA提取试剂盒。2 .荧光PCR扩增试剂。根据不同型号的荧光PCR扩增仪，选取合适的实时荧光PCR扩增试剂。3 .引物和探针。针对动物鹦鹉热衣原体MOMP基因保守序列设计引物和探针，预期扩增产物大小为145bpo引物和探针序列详见附录A。4 .质粒提取试剂盒。选用商品化的质粒提取试剂盒。（三）仪器设备生物安全柜、组织匀浆器、核酸提取仪、荧光PCR扩增仪、台式低温高速离心机（离心力12000g及以上）、微量可调移液器（量程：2.51.10H1.、100比、200H1.和100o1.等不同规格）、冰箱（2OC8OC和-20OC及以下）。（四）安全要求兽医实验室生物安全要求应符合GB19489的规定。（五）样品采集与处理1 .样品采集1.1 家禽或鸟类拭子样品采集用无菌棉拭子采集家禽或鸟类喉头、泄殖腔、眼眶分泌物,浸入Im1.50%甘油-PBS保存液中，剪去露出管外部分，盖紧离心管盖，密封后置-20。C及以下保存。1.2 动物组织样品采集无菌采集适量死亡动物（主要包括家禽、鸟类及哺乳动物）或哺乳动物流产胎儿肺脏、扁桃体、气管和关节液等病料置于无菌容器，加冰袋冷藏，并于24h内送至实验室立即检测或置-20及以下保存。1.3 动物全血样品采集使用真空管（含EDTA抗凝剂）采集发病动物全血2m1.-5m1.,密封后冷藏或-20及以下保存。2 .样品处理2.1 家禽或鸟类拭子样品处理家禽或鸟类的喉头、泄殖腔及眼眶拭子标记样品编号，立即进行动物鹦鹉热衣原体核酸检测或-20OC及以下储存备用。2.2 动物组织样品处理取适量采集的动物组织样品置于组织匀浆器中充分研磨，加入灭菌的0.1mol/1.PBS（pH7.4）制备10%组织匀浆液。3000rmin离心处理IOnIin。取上清液，标记编号，立即进行动物鹦鹉热衣原体核酸检测或-20OC及以下储存备用。2.3 3动物全血样品处理动物抗凝全血标记样品编号，立即进行动物鹦鹉热衣原体核酸检测或-20。C及以下储存备用。（六）核酸提取采用DNA提取试剂盒或应用自动化核酸提取仪提取各类样本中的动物鹦鹉热衣原体核酸。若在2h内检测可将提取的样品核酸置于冰盒上保存，否则应置于-20OC及以下条件保存。（七）核酸扩增扩增体系。建立201.反应体系，扩增体系见下表。试剂体积PremixExTaq(ProbeqPCR)扩增酶预混液101.动物鹦鹉热衣原体上游引物、下游引物(20pmol1.)各0.51.动物鹦鹉热衣原体探针(20PnIoI1.)0.31.DNA模板21.灭菌双蒸水补足至201.扩增条件。95OC预变性5min,40个循环(95OC变性15s,58OC退火延伸30s),在每一个循环的58OC时收集FAM通道的荧光信号。（八）阴性及阳性对照阴性对照：采用灭菌双蒸水作为阴性对照。阳性对照：采用含有动物鹦鹉热衣原体特定基因保守序列的重组质粒p-Cps作为阳性对照。重组质粒标准品p-Cps制备方法与序列信息详见附录B。(九)试验成立条件阳性对照FAM通道的Ct值W27且出现特异性扩增曲线；阴性对照无Ct值或阴性对照Ct值35,表明试验成立，试验结果有效。否则，本次试验无效，需重新进行试验。(十)结果判定在试验成立条件下，当被检样品FAM通道的Ct值W30且出现典型的S型扩增曲线，则判为动物鹦鹉热衣原体核酸阳性；当被检样品无Ct值或Ct值30,则判为动物鹦鹉热衣原体核酸阴性。（十一）实验验证数据1 .特异性数据验证47.603.339S36AmplificationPlot阴性对照室温条件下，201.反应体系中，仅能特异性扩增出动物鹦鹉热衣原体的DNA,且Ct值小于35,而不能扩增出其他动物病毒的DNA或cDNA,说明该标准方法特异性较强。750.000700.0650.0900.000550.000500.000450,0400,000350.000300.000250.0200.0150.000100.00050.010121416IS20222426283032343636402 .敏感性数据验证室温条件下，201.反应体系中，将含有动物鹦鹉热衣原体特定基因保守序列的重组质粒P-Cps标准品10倍倍比稀释后作为模板，按照本标准的扩增体系检测验证，结果检测下限值为10拷贝/微升，说明该标准方法敏感性较高。3.重复性数据验证室温条件下，201.反应体系中，对3种不同浓度和不同批次的p-Cps质粒标准品分别进行组内和组间的重复性数据验证，组内与组间分别设置3个重复项验证，结果组内与组间重复性试验Ct值的变异系数均小于2.0%,说明本标准方法重复性数据验证良好。质粒标准品终浓度（拷贝/微升）组内重复性试验Ct值组间重复性试验Ct值平均值X标准差S变异系数CV%平均值X标准差S变异系数CV%p-Cps7.5×1O616.260.301.8316.080.150.967.5×10423.330.120.5223.350.050.237.5×10229.840.160.5329.860.431.454.临床应用数据验证对5份临床泄殖腔拭子样本分别采用本标准方法及普通PCR方法同时进行检测，结果二者检测结果完全一致，符合率为100%,说明本标准方法可用于临床诊断检测。5.实验室间的比对分别将不同浓度的实验比对样本（编号5）分为一式两份,由广西动物疫病预防控制中心和桂林市动物疫病预防控制中心的兽医实验室分别进行组内和组间的检测，检测所用的引物和探针为同批次合成，引物和探针浓度设置相同，反应体系和反应条件一致，比对实验结果。由检测结果得知，阴性、阳性对照均成立的条件下，两个实验室样本的检测Ct值接近，且变异系数控制在2%以内，说明本标准方法可用于临床样本的检测。实验地点广西动物疫病预防控制中心实验日期2024年2月26日实验条件25,65%主要仪器荧光定量PCR扩增仪、移液器样品编号组内重复Ct值组间重复Ct值重复样本孔1重复样本孔2重复样本孔3平均值标准差变异系数/%重复组1重复组2重复组3平均值变异系数/%115,50515.38115.42415.440.060.4115.30415.23415,68715.410.241.58223.46423.34323.21723.340.120.5323.52923.36922.99623.300.271.17329.92429.89330.00429.940.060.1929.92829.99830.03229.990.050.1840O000000000050O0000000000阴性对照0阳性对照16.525实验日期2024年2月27日实验条件25,65%主要仪器荧光定量PCR扩增仪、移液器样品编号组内重复Ct值组间重复Ct值重复样本孔1重复样本孔2重复样本孔3平均值I5三S变异系数/%重复组1重复组2重复组3平均值变异系数/%114.92914.95315.00714.960.040.2714.83315.00715.23415.020.201.34222.83722.99723.04922.960.110.4822.77822.89723.12322.930.180.76328.85628.50828.79628.720.190.6528.93028.78328.75428.820.090.334O00O000000005000000000000阳性对照0阳性对照17.385实验地点桂林市动物疫病预防控制中心（十二）确定依据分别从特异性数据、敏感性数据、重复性数据、临床应用数据及实验室间比对等方面的实验验证数据来确定本标准方法具有可行性的依据。1 .特异性数据验证。本标准方法仅能检测出动物鹦鹉热衣原体核酸，而其他动物病毒并不能检测出，说明本标准方法特异性较强；2 .敏感性数据验证。本标准方法在规定扩增循环数内实现检测下限值为10拷贝/微升，高于普通PCR的103拷贝/微升敏感性，具有敏感性较高的优点；3 .重复性数据验证。设置组内与组间的不同批次的重复性数据验证，结果扩增循环数的变异系数均小于2队说明本标准方法重复性良好；4 .临床应用数据验证。对临床相同的拭子样本分别采用本标准方法及普通PCR方法同时进行检测，结果二者的检测结果完全一致，符合率为100%,说明本标准方法可应用于临床动物样本的鹦鹉热衣原体检测。5 .实验室间比对验证。由广西动物疫病预防控制中心和桂林市动物疫病预防控制中心的兽医实验室分别对相同的样本进行组内和组间的检测，检测结果符合预期，说明本标准方法可用于临床动物样本的鹦鹉热衣原体的检测。六、国内外同类标准制修订情况及与法律法规、强制性标准关系截至目前，国内外畜牧兽医行业均无动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法，国内有海关总署进出口行业标准SN/T5488-2022猪衣原体病检疫技术规范；农业农村部农业标准NY/T562-2015动物衣原体病诊断技术；进出口行业标准SN/T1395-2015禽衣原体病检疫技术规范；青海省地方标准DB63/T1586-2022耗牛衣原体病防治技术规范和甘肃省地方标准DB62/T2691-2016绵羊衣原体病防治技术规范。以上标准规范均未涉及动物源样本中鹦鹉热衣原体的病原核酸检测，不能对动物源样本的鹦鹉热衣原体检测进行有效指导。本标准建立了动物鹦鹉热衣原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好，根据扩增曲线和循环数即可判定检测结果等优点，为动物源样本中的鹦鹉热衣原体临床监测检测和流行病学调查提供快速、高效、特异的技术支持。七、重大分歧意见的处理经过和依据本标准研制过程中无重大分歧意见。八、自我承诺本标准内容与各项指标不低于强制性标准要求。团体标准动物鹦鹉热衣原体实时荧光PCR检测方法标准编制工作组2024年01月05日