犬蛔虫检验技术规程.docx
ICSCCS点击此处添加CCS号B43湖南省地方标准DB43/TXXXX-2024犬蛔虫检验技术规程Technicalregulationsforcanineascarisinspection（征求意见稿）2023-XX-XX发布2023-XX-XX实施湖南省市场监督管理局发布目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14诊断依据15结果判定26鉴别诊断2附录A（资料性附录）犬蛔虫成虫与虫卵形态特征4附录B（资料性附录）辅助诊断方法5,.l.lZl,A刖三本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本标准某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由湖南省农业农村厅提出，由湖南省农业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：湖南农业大学、长沙市动植物疫病预防控制中心、娄底职.业技术学院。本文件主要起草人：刘伟、李芬、何瑜、王洪亮、杨辉、王先坤、孟沁、李宁倩、陈叔玉。犬蛔虫检验技术规程1范围本文件规定了犬弓首蛔虫和狮弓蛔虫的虫卵、成虫的检查方法与判定结果等。本文件适用于犬蛔虫病的诊断、感染监测，药物驱虫效果考核及防疫规划的制定与评估。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1犬蛔虫ascariscanis指犬类常见的肠道寄生虫，包括犬弓首蛔虫和狮弓蛔虫，其幼虫能在人体内移行，引起内脏幼虫移行症。4诊断依据3.1 流行病学史患犬有饮生水、食生肉的习惯，或为农村散养以及去过野外的经历。3.2 实验室检查3.2.1 材料准备70%酒精；饱和食盐水；镜子；自封袋；电子秤；离心管；100目筛子；蒸储水；移液枪；烧杯；试管；载玻片；盖玻片；光学显微镜。4. 2.2虫卵检查4. 2.2.1粪便采集采集疑似病犬粪便若干，放在干净的自封袋内，编号。并记录被检犬的年龄、品种，带回实验室低温保存于4C冰箱备查。4. 2.2.2粪便检查直接涂片法：将粪便用生理盐水稀释后，直接涂抹于载玻片上，置于显微镜下观察，进行检测。饱和食盐水漂浮法：取10g粪便置于100111.的烧杯中先加少量的饱和食盐水充分搅拌呈均匀糊状，继续加入约20倍左右的饱和食盐水。然后将粪液用100目金属筛过滤到另一个烧杯中，接着将滤液倒入试管中，使液体凸于试管口。静置20min后，用干净的盖玻片轻轻蘸取试管口上的液体，迅速提起盖玻片后，放在一洁净载玻片上（注意勿产生气泡），盖上盖玻片，置于低倍显微镜（IoXlo）下检查有无虫卵。蛔虫卵的形态特征见附录A。4.2.3虫体检查在疑似患犬的粪便或呕吐物中，挑出虫体，显微镜下观察并拍照虫体的头部、尾部、体侧等部位。蛔虫虫体的特征见附录Ao5结果判定1.1 粪检结果判定在镜下，犬弓首蛔虫卵为黄褐色，呈圆形，直径约为85pm,外壳凹凸不平，表面不平整，内含单个较大卵细胞，细胞内充满卵黄颗粒。狮弓蛔虫卵近似圆形，大小为75pmX85pm,黄褐色，卵壳厚，表面光滑，内含1个卵胚细胞。观察到这两种虫卵可判定为阳性。5. 2虫体检查结果判定在患犬的粪便或呕吐物中，检出蛔虫虫体，虫体形态：犬蛔虫呈淡黄白色，头端有3片唇，体侧有狭长的颈翼膜。犬弓首蛔虫雄虫长50110毫米，尾端弯曲；雌虫长90180毫米，尾端宜；狮弓蛔虫雄虫长3570亳米，雌虫长30100亳米。观察到这两种蛔虫虫体可判定为阳性。6鉴别诊断5.1 鉴别犬蛔虫与其他线虫虫体与虫卵区别5.1.1 鉴别犬蛔虫与犬钩口线虫犬钩口线虫是犬较为常见的另一种较为常见的线虫病。虫体为淡红色，前端向背面弯曲，口囊大腹侧口缘上有3对大齿。口囊深部有1对背齿和1对侧腹齿。虫体长10-16亳米，虫卵大小为40-60微米。刚排出的虫卵内含8个卵细胞。5.1.2 鉴别犬蛔虫与犬尾旋线虫犬尾旋线虫。成虫呈螺旋形，血红色，粗壮。口周围有2个分为3叶的唇片。雄虫长3O54mm,尾部有尾翼和许多乳突，有2根不等长的交合刺。雌虫长5480mm。卵壳厚，产出时已含幼虫。虫卵呈长椭圆形，大小为3037mll15m°可结合粪检与临床症状与犬蛔虫进行区分。5.1.3 鉴别犬蛔虫与犬鞭虫犬鞭虫成虫长4070毫米，前段细长而后端粗大，前后之比是3：1,虫体似鞭子。雄虫长5052mm,后部弯曲，泄殖腔在尾端，有1根交合刺；雌虫长3953mm,后部不弯曲，末端钝圆；虫卵呈棕黄色，卵壳厚，两端各具一个透明的卵塞，形如腰鼓，含1个卵细胞，大小为7089UmX3741Pnio可结合粪检与临床症状与犬蛔虫进行区分。6. 2辅助鉴别诊断方法为进一步鉴定虫体为何种蛔虫，可采用PCR方法作为辅助手段进行鉴定。具体步骤参见附录B。附录A(资料性附录)犬蛔虫成虫与虫卵形态特征犬蛔虫虫卵及虫体具有以下主要形态特征：a) .狮弓蛔虫镜检观察狮弓蛔虫受精卵长、短轴平均长度分别为85.49n71.44m,呈黄色，近椭圆形，卵壳较薄，内外界膜界限清晰，外壳光滑，卵内有未分化的单个呈圆形卵细胞，有清晰的细胞膜界限,细胞和卵壳间的间隙较大，有“新月状”空隙。未受精蛔虫卵是长椭圆形，棕黄色，卵壳及蛋白质膜均比受精卵薄，卵内含有许多大小不等的屈光颗粒，其与卵壳之间无明显空隙。狮弓蛔虫成虫呈淡褐色，头端向背侧弯曲，头端两侧有狭长而对称的柳叶型颈翼，有三片近似圆形的唇片，唇缘具有细小锯齿状缺刻。雄虫长37cm,交合刺长0.7l5mm,雄虫肛门前侧，有2条不等长的交合刺，尾部无突起；雌虫长310cm,阴口开口于虫体前1/3与中1/3的交界处。b) .犬弓首蛔虫犬弓首蛔虫受精卵平均直径为84.78m,呈黄褐色，近圆形，卵壳较厚，卵黄膜、壳质层和脂层明显，外壳有许多凹陷，表面不平整，内含单个较大卵细胞，细胞内充满卵黄颗粒，卵细胞与卵壳间空隙较少。犬弓首蛔虫虫体长度510cm左右不等。头端有3片唇，虫体前端两侧有向后延展的颈翼膜。雄虫长5llcm,尾端弯曲，有一小锥突，有尾翼。雌虫长918cm,尾端直，阴门开口于虫体前半部。c) .狮弓蛔虫与犬弓首蛔虫区别在放大镜下，可通过比较两个虫种的尾部形态来区分它们，犬弓首蛔虫雄性成虫的尾端弯曲，有锥形或指形突起，而狮弓蛔虫雄性成虫不具有这些形态；两类虫的成虫头端都有颈翼，狮弓蛔虫颈翼呈狭长的柳叶状，而弓首蛔虫颈翼短而宽。附录B（资料性附录）辅助诊断方法PCR鉴定具体步骤如下：8.1 材料准备剪刀、镜子、离心管、水浴锅、PCR仪、ddH20、DNA试剂盒等。8.2 提取DNA剪取虫体23cm,使用ddH20对虫体润洗5min,共润洗6次。使用无菌银子将润洗过后的虫体置于1.5m1.离心管中，加入20M1.蛋白酶K,混匀后置于56C恒温水浴锅中消化13h。消化好的虫体悬浮液按基因组DNA提取试剂盒（天根生化的TlANampGenomicDNAKit）提取DNA。8.3 PCR扩增和测序采用ITS与COXl基因的线虫通用保守引物（表D,以基因组DNA为模板分别扩增线粒体pcoxl和核糖体ITSrDNA基因序列，pcoxl预期片段大小为450bp,ITS预期片段大小为850bp,扩增体系为25.01.,包括上下游引物各2.0H1.（Iopmol1.）、DNA模板2.0u1.、灭菌蒸镭水19.0h1.ITS的PCR扩增条件如下：94C预变性5min；94C变性30s,50C退火30s,72延伸Imin,35个循环；最终在72C延伸5min,最后4结束反应。PCOXI的PCR扩增条件为：95°C预变性5min；再95变性30s,55C退火30s,72延伸30s,38个循环，再72C延伸5min,最后4结束反应。反应结束后，扩增虫体的这2段序列进行测序，序列进行B1.AST比对，序列相似度达98%以上即可判定该物种与GenBank数据库上收录的犬蛔虫为同种。表1两段基因扩增引物基因引物名称引物序列ITSNC55'-Gtaggtgaacctgcggaaggatcatt-B'NC25,-TTAGT11CT11TCCTCCGCT-3,pcoxlJB35,-ttttttgggctcctgggtttat-3,JB4.55'-Taaagaaagaacataatgaaaatg-3'
