补骨脂素药理作用及肝毒性机制的研究进展.docx

摘要：补骨脂素是源于补骨脂PSoraleaCOryIifolia的香豆素成分，具有抗骨质疏松、神经保护、抗肿瘤、雌激素样、抗炎等多重药理作用，有着良好的临床应用潜力。随着对补骨脂用药安全问题的不断关注，近年来关于补骨脂素的肝脏毒性研究也逐渐增多。通过查阅近20年国内外相关文献，对补骨脂素的药理作用和肝毒性研究概况进行整理和总结，为补骨脂素的进一步研究和临床应用提供参考。补骨脂是豆科植物补骨脂PSOraIeaeorylifolia1.的干燥成熟果实，具有补肾助阳、纳气平喘、温脾止泻等功效，是青娥丸、壮骨关节丸等经典方剂的重要组成药物1。补骨脂素是源于补骨脂中的吠喃香豆素类化合物，也广泛存在于北沙参、防风和独活等中药中2-4,具有抗肿瘤、神经保护、抗炎、抗氧化等药理活性，可用于治疗类风湿性关节炎、白血病、阿尔茨海默病等疾病。补骨脂和含补骨脂的成方制剂用药过程中产生的肝毒性引发了学者对于补骨脂中毒性成分的关注。补骨脂素含量是补骨脂药材质量控制的限定标准，也是补骨脂水煎液体内吸收的主要活性成分，目前已被证实补骨脂素在长期、大剂量给药情况下可引起大鼠、斑马鱼等动物严重肝损伤。本文对近20年来补骨脂素的药理作用和肝毒性探究进行系统综述，以期为补骨脂素后续研究和临床用药安全提供参考。1补骨脂素的药理作用及机制1.1抗骨质疏松骨髓间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)是具有增殖和多向分化能力的多潜能干细胞，受相关细胞激素、生长因子和细胞因子调控，可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和其他组织细胞5。当BMSCS成脂分化能力大于成骨分化时，体内骨形成量降低，形成骨吸收大于骨形成的代谢失衡状态，进一步诱发骨质疏松6。补骨脂素能够通过影响骨代谢相关通路，在促进成骨细胞增殖、分化和抑制破骨细胞增殖方面进行骨稳态调控。其中，作用于骨形成相关信号途径有BMP-Smads、Wnt-catenin、核因子B(nuclearfactorkappa-B,NF-B)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-actiVatedproteinkinase,MAPK)>Hedgehog和雌激素信号通路；抑制骨吸收相关信号通路包括丝苏氨酸蛋白激酶(serine-threonineproteinkinase,AKT)>激活蛋白-1(activatorprotein-1,AP-1)、OPG/RANK1./RANK和雌激素通路。除直接作用外，补骨脂素还可通过作用于白细胞介素(interleukin-l,I1.-l)信号通路来抑制炎症反应引起的骨病变，见表1。*1朴育脂索抗骨质疏松的作用及机制Table1AndssteoporosiseffectandmechanismofpsoralenftMCSF+RANK1.诔导的BMSG神制破鞠的形成破骨分化他MlA诱导的大网关节炎附埴强软件基质的合庶抗炎I1.IB送号的大RM间盘退支机炎、地辱椎向效退变«5Pg-1.PS诱导的小鼠牙周炎模3!我少横5!小鼠牙槽骨去失、抗炎促i三CWT细电中CM*CD25'TrepThl7?雳向CDrCD257喀发展、投联CWT细庖的ROat、11J7和TNFp的表达作用FAKT和AFl途存、抑制MSSF联合RANK1.携号的TRACPil活性、砌酸化Cgn的表达和核移位抵制滑Ift细胞分泌的MMPs和I1.s的表达、下调ttt½ECM的产生通过I1.lB信号通路上调CoeaI和牧骨细息聚集Si日婢久血的表达,下调炎症因子ADAMTS5和C0X2的强白表达剂量相关性降低THIM细胞炎S：因子1.8、1.-l的爵旗增强牙周膜细胞hPD1.Cs细胞的A1.P活性、上调RUNX2、D1.X5和OPN的表达17受试对象药理作用作用机制人胎皮骨细胞hF0BU9促IS或甘生到8箱通过ERK小(ApK、JNKMAPK、P讼MAPKWNF<B途/就编患内BMPW表达.法9成牺隐标志性版白金AIP激活7JIii预行或触胞飕成#女分化成热增强成套相关因于JGK人Qswnt和Hma?的基因表达、促注骨耳素和I也R原的分汰增丽磅嬲础克注超触沉随型哨Sfti8凰代小鼠桢骨成骨细18触成ras分化螭作用JBMP苗号途径Hl成形Bifi因子CoU、小、OC和加的基因表达9大金领骨成骨缠用抑制破骨组费分化或热作用JOPGRANK1.RANK信号通路,上调骨保护素OPG.下调RANH的mRNA就IO大鼠头击骨或钳8跑抻制成例幅曷亡上*Bd2抗料亡蛋白家族中Bid、Bct25Wft½.抑蛾行词亡缎It如爵oase9的表达11BMSCs晨亮BMsG细8活性、促迸通过升制皿788表达来兄向上调wr2的mRNA水平JeJDOmix、W的mRNA其成aHt够白制介号HedohM信号通籍上调SMGM的mRNA及蛋白表达.下调Ptchl的mRNA及蛋白¾促JS成骨分化、抻W成丽分化提岛"'成人加皿信号通癌中成骨分化关健调控出千即蛭和OCN蛋白表达：抑制盅后分化关健转录因子CEBPf和PPAR-T版日表达1213M去卵巢大Sl骨质地松根5?粒骨质埴松摄fl清中E2水平和般骨ER水平、降长骨组妲中ZW7、AFa的基因表达15RANK1.借号的RAWH7破骨艇破骨组电七成、降娃溶骨培的度S索受体EKfl表达、降低I1.lTR的表达而掷物11.17侑号传导MGR里18人巨ISia胞集落“I*因子MIA-IHZJR钠1.PS-JfeBMP-2jifl人骨形密友生或白2A1.P-MftWSWBdOBSiafi济巴«-2Shh-ft«e«fGbI-转录因指窗门1PR-y-过a化物雄也发体YERP蜻*1受体01130»-抗Ii石酸酸件鼻酸修MMPA基质金SlaiflEeM现也外基战CoDaHK皎原l8X-2-环氯化物乘2D55is疏依夫InM会5OPN-Ir检量白M-CSFrecombma11!humanmacrophageCCkOysnmlanngeCtorOAsodumu>dccetate1.PS-hpopol'S3cchandeBIP2-reccmbuuuhumanbooemocphogenet>cprotein-2A1.P-alkalme曲闻IauSeBcl-2-B-ceilh11homa-2Shh-SoaCbedgd×>gGiiIoDBWSoC询edOoCOgeQehomok>glPPAR-piscmcprohfentcr-activatcd11c<p<crER<5tron11cq>tcrTRACP-tartancadPIXKPlUrtaSeMMPS-OHtnXmealkproteinasesEGtemxeDularmimxC<i2al<oUamtpe11Ajha1CCK2-cydoc,Bena9e-2IKJC5-dtslshomeobx5OPN-oeopcnn1.2 神经保护阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病，发病机制暂不明确，主要病理表现为B淀粉样蛋白(p-amyloidprotein,A)沉积引发老年斑、TaU蛋白过度磷酸化引发神经纤维缠结。补骨脂素对阿尔茨海默病引发的神经损伤有很好的保护作用，可从抑制A的形成、抗炎、抑制神经细胞凋亡和抗氧化应激等方面发挥治疗作用。补骨脂素能够通过ER介导磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)信号通路下调淀粉样前体蛋白、分泌酶的蛋白表达，减少A的形成和异常沉积122；以竞争的方式剂量相关性抑制乙酰胆碱酶活性，破坏酶与A肽的相互作用，抑制阿尔茨海默病形成23；抑制炎症因子I1.-6、病-邛、TNF-和COX-2的mRNA表达，减缓Al-42诱导的神经炎症损伤；通过MAPK信号通路调控凋亡调节因子Bcl-2/Bax的表达，抑制线粒体中CytochromeC的转出，降低CaSPaS6-3、CaSPaSe-9表达水平，抑制神经细胞凋亡24；提高去卵巢痴呆大鼠脑组覆海马区超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)氧化酶活性，降低丙二醛(malonaldeehyde,MDA)含量，减少氧化应激引起的神经元损伤，提高认知能力25。1.3 抗肿瘤补骨脂素具有良好的抗肿瘤作用，能够体外抑制乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、白血病等肿瘤细胞，作用机制与抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管内皮生成、逆转多药耐药多个环节密切相关。近年来，脂质-聚合物杂化纳米颗粒作为药物载体与补骨脂素的结合应用，也从靶向给药治疗和逆转多药耐药方面提高了补骨脂素的抗肿瘤效果26-28。补骨脂素的抗肿瘤作用及机制见表2。*2补骨质素的抗肿病作用及机制Table2Anrbmmoreffectand11R<hanisnofpsoralen作用机制作用途传二献抑制肿瘤细胞堰殖透仔细胞增殖周期因滞于G，G、SM期.抑制DNA与正门质的合成29-32剂量时间相关性下峭增殖细胞核抗原3E臼表达.抑制雄激素受体/WmRNA和蛋白水平33提高Sl酸化<atenin的水平,抑制总BYatenln及其下希犯向Fral的表达，因控WntBcamm34通路逆转多药耐药提高细胞内布扑异构WHiamRNA和蛋白表达，增加化疗药物对其作用死点35下谡谷胱甘肽转移efX基因和蛋白表达，抑制M-kB活性36通过PPARWP53通路减少细胞外泌体的形成和分泌，抑制转移耐药相关基因Mdr-I和外排蛋37-39白P-gp的表达，逆转药物耐药上调mR-l%a5p表达、卜IflHOXB7-HER2信号轴.连然顺便耐药40请马肿痛细胞招亡剂量相关性上调CaSPaSe*3和抑癌基因253活性：F弱抑闷亡基因Bcl2蛋白表达30、41耨续诱发内质网应，反应，引起内质网扩张和功能紊乱42引起细胞骨架般白F-actin解聚，进而携导细胞凋亡43抑制肿病细胞转移降低波%蛋白和5J4mRNA表达，抑MNF-KB介导的上皮-间质转化抑制细胞迁移44抗肿jil管生成剂量相关性地加内皮<M&内Gar浓度，诱导内皮细胞网广45SMA-f«UH0)X11SN!-smood>muscleactm1.4 抗炎补骨脂素具有抗炎作用，在类风湿性关节炎、牙周炎、气道炎症和神经炎症模型中均得到验证，抗炎作用与抑制炎症因子的合成、分泌密切相关。张引红等46利用类风湿性关节炎小鼠模型探究发现，补骨脂素可显著减少病变处炎性细胞的浸润，减轻足踝的肿胀程度，抑制CD4+细胞向ThI细胞分化，减少I1.-6、I1.-l,TNF-(X等炎症因子释放。DU等47也证实了补骨脂素可通过降低肺部前白细胞介素-l(pro-interleukin-l,pro-I1.-1)和转化生长因子l(transforminggrowthfactor-1,TGF-l)的表达，抑制博莱霉素(bleomycin,B1.M)刺激引起的小鼠肺实质性炎症，降低炎症性级联反应或呼吸功能障碍。体外细胞实验发现48,补骨脂素可显著抑制Th2细胞分化关键转录因子GATA结合蛋白3的表达，降低Th2型炎症因子I1.-4、I1.-5和I1.-13的mRNA水平，改善肺组织的炎性浸润和黏液分泌,缓解哮喘大鼠的高反应性和气道炎症。此外,补骨脂素对人牙周膜细胞49、RAW264.7细胞50、THP-I细胞21中炎症因子分泌也有很好的抑制作用。1.5 雌激素样作用植物雌激素是存在于植物体中的杂环多酚类化合物，同内源性雌激素一样具有双向调节作用，可根据体内内源性雌激素水平、ER类型和数量发挥协同或拮抗作用51。补骨脂素可通过介导ERa或ER,作用于拥有雌激素受体的靶器官,如骨骼、生殖系统等，从而发挥雌激素样作用。赵丕文等52在培养基中雌激素耗竭的情况下观察到，补骨脂素能够促进ER阳性细胞Ishikawa和T47D细胞增殖，上调T47D细胞中ERa和ERP的表达，且其诱导效应可被雌激素受体拮抗剂阻断，表明补骨脂素具有类雌激素样作用。此外，补骨脂素还能够提高去卵巢大鼠体内雌激素E2和ER水平，从而发挥抗绝经后骨质疏松的治疗作用15。1.6 抗色素沉着酪氨酸酶是黑色素合成过程中的关键限速酶，可催化底物酪氨酸羟基化形成多巴，多巴进一步氧化后形成黑色素。补骨脂素主要通过抑制酪氨酸酶的活性影响黑色素合成。文献报道，补骨脂素能够作用于p38/MAPK、JNK/MAPK和ERK/MAPK信号通路下调小眼畸形相关转录因子的蛋白表达，抑制酪氨酸酶启动子活性；下调酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1、酪氨酸酶相关蛋白-2的水平，影响黑色素合成，减缓色素沉着53-55。1.7 抗皮肤光老化皮肤是人体抵抗紫外线损伤的第1道屏障，长期紫外线照射会引起皮肤角质形成HaCaT细胞、皮肤成纤维ESF-I细胞等的损伤及系列病理变化，造成皮肤光老化。补骨脂素可在抑制HaCaT细胞凋亡、抗氧化、抗炎症反应、促进胶原蛋白形成和抑制胶原蛋白异常降解等方面抵抗皮肤光老化形成，作用机制涉及下调细胞凋亡因子P53、Bcl-2及caspase-3的蛋白表达，降低细胞内活性氧(Feactiveoxygenspecies,ROS)水平，抑制中波紫外线诱导的HaCaT细胞凋亡156；上调抗氧化酶Se)D、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)和过氧化氢酶活性，下调I1.-SmRNA水平，减少由活性氧自由基和炎症因子引发的HaCaT细胞损伤57；上调ESF-I细胞中I型胶原蛋白、In型胶原蛋白的mRNA水平，促进胶原蛋白合成；上调基质金属蛋白酶抑制剂-1、2的mRNA表达，下调基质金属蛋白酶1的mRNA表达来抑制细胞外基质中胶原蛋白的异常降解，延缓皮肤衰老58。1.8 抗氧化补骨脂素具有抗氧化能力，可通过增强抗氧化酶SOD、GSH的活性，减少氧自由基含量，降低MDA等过氧化物引起的细胞损伤，减缓氧化应激反应参与的阿尔茨海默病、皮肤光老化、抑郁症等疾病进程。SeO等59在H2O2诱导的细胞凋亡模型中发现，补骨脂素能够上调抗氧化酶血红素氧合酶1的mRNA表达，增强GSH-PX和SoD活性，降低细胞内ROS含量，减少氧化应激反应引发的胰腺细胞凋亡。1.9 抗纤维化纤维化是由多种因素引起的ECM代谢异常、成纤维细胞过度增殖分化，致使纤维结缔组织在炎症或受损组织中过度积聚，从而引发器官形态结构改变和功能障碍的一种病理变化60。补骨脂素可从抑制炎症进程和纤维化改变方面在肺、肾组织中发挥抗纤维化作用。在B1.M诱发的小鼠肺纤维化模型中，补骨脂素能够通过降低B1.M诱导的I型和m型胶原蛋白表达，减少小鼠肺内胶原合成和异常沉积；降低平滑肌肌动蛋白-SMA的mRNA表达，抑制成纤维细胞增殖;下调TGF-P1、I1.-l和TNF-a的mRNA水平,减少间质组织内炎性细胞浸润47。Seo等61研究发现，补骨脂素可下调高糖处理的小鼠肾小球系膜MES-13细胞中纤维结合蛋白和凋亡标志基因内皮细胞型纤溶酶原激活物抑制因子(plasminogenactivatorinhibitor-1,PAI-I)的mRNA表达水平，保护高糖诱导的系膜细胞损伤。1.n)其他研究表明，补骨脂素可体外诱导大鼠胸主动脉血管舒张62。瞿晶田等63研究发现，补骨脂素能够上调内皮细胞中一氧化氮合酶的蛋白表达，通过作用于内皮细胞依赖的NO途径发挥舒张血管的药理作用；抑制TNF-诱导的人脐静脉内皮细胞中内皮因子的释放，减缓因内皮因子聚集引起的凝血状态的产生，降低血栓的形成64。此外，补骨脂素还具有减缓肝细胞炎症损伤和抗抑郁的药理作用。补骨脂素对乙酰胆碱酶抑制剂诱导的肝Hep-G2细胞损伤具有保护作用65。文献报道，补骨脂素可通过抑制NF-KB活性减少I1.-6、TNF-a、I1.-8和人单核细胞趋化蛋白1等炎症因子分泌，减缓1.02细胞炎症损伤；下调TGF-Pl的mRNA表达，抑制脂肪细胞进一步变性，从而保护棕稠酸诱导的1.02细胞损伤66。补骨脂素抗抑郁作用的发挥与其抑制机体氧化应激反应相关。KOng等67于2001年首次提出补骨脂素对大鼠脑中线粒体单胺氧化酶活性具有抑制作用，提示其具有治疗情感障碍的潜能。利用抑郁小鼠模型探究发现68,补骨脂素可通过改善5-羟色胺能和HPA轴系统的异常发挥抗抑郁作用。作用机制涉及逆转被迫游泳实验引起的小鼠额叶皮质和海马组织中5.羟色胺和5-羟基口引跺乙酸的mRNA水平变化；降低被迫游泳实验诱导的小鼠血清促肾上腺皮质激素释放因子和皮质酮浓度的升高，使HPA轴活动正常化。综上所述，补骨脂素作为补骨脂中的活性成分，具有多样的药理作用。现代药理研究中补骨脂素的抗骨质疏松、抗肿瘤、抗炎和雌激素样等作用与补骨脂的促进骨生长、抗肿瘤、消炎、调节激素水平等药理作用具有一致性，与中药复方中补骨脂治疗妊娠腰痛（通气散）、脚膝肿胀（补骨脂散）等的功效相似。从单味中药和中药复方功效出发，探究中药主成分的潜在药理作用，可为中药药效物质基础和后续开发利用提供思维导向。如破故纸丸中补骨脂可温肾助阳、固精缩尿而治肾气虚冷、小便无度，二神丸中补骨脂可温脾纳气而治脾胃虚弱，全不进食，因此后续可对补骨脂素是否具有治疗尿频、遗精以及消化不良等药理作用进行探究。2肝脏毒性机制肝脏是机体的主要代谢器官也是重要的解毒器官，药物吸收入血后在体内经肝脏进行代谢转化，产生的代谢产物或原型药物本身会对肝脏造成直接或间接的损害。毒理学研究显示，补骨脂素用药引起机体的不良反应涉及生殖系统、免疫系统、神经系统和肝、肾等实质性脏器，尤其对肝脏损伤最为严重69-70。补骨脂素引发的肝毒性存在显著种属差异和性别差异，且肝损伤程度具有剂量、时间相关性。动物实验发现，补骨脂素引起的肝损伤具有可逆性，停止给药一段时间后机体可自行恢复71。补骨脂素致肝损伤机制并非单一，目前已被证实肝毒性与引起机体胆汁淤积、干扰肝再生、氧化应激反应与线粒体功能障碍、内质网应激反应、抑制肝药酶活性、氨基酸代谢异常相关，补骨脂素肝损伤相关机制见图StT2AlcyclmFJWp27jcy<laDlIp70S6K图1林骨层索肝授伤相关机IM辑林耀和线W体功就内MiW应成CYF2E112.1 胆汁淤积胆汁酸主要在肝脏中进行合成、代谢，并通过肝细胞基膜和肝细胞膜上的转运体进行运输。肝内胆汁淤积现象是由多种因素引起胆汁酸合成、分泌和转运等过程紊乱导致的，进一步发展通常会导致肝纤维化、肝硬化，甚至肝衰竭。其中，胆汁酸的转运是由肝细胞基底外侧和胆管的转运蛋白如胆盐输出泵(bilesaltexportpump,BSEP)、多药耐药相关蛋白2(multidrugresistanceassociatedprotein2,MRP2)等共同协作完成。Wang等72分别iglCR小鼠和WiStar大鼠160、40mgkg补骨脂素溶液28d后，小鼠未见肝损伤，但大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、Y谷酰基转肽酶、总胆汁酸和总胆红素水平升高；病理切片观察到部分肝局灶性坏死，肿大的肝细胞中含有大量胆汁色素和脂质，其中雌性大鼠肝损伤更为严重。提示补骨脂素肝毒性存在种属差异，且更易造成雌性大鼠的肝脏胆汁淤积性损伤。作用机制涉及下调胆汁酸转运体BSEP和MRP2的mRNA表达，抑制胆汁酸排泄；降低胆汁酸主要代谢酶SU1.T2A1的mRNA表达，抑制胆汁酸葡萄糖化和硫酸化。2.2 干扰肝再生肝脏受损后会激活自身细胞进行补偿性增长以弥补丢失的组织7引。补骨脂素可通过阻滞细胞周期来抑制细胞的补偿性增殖，降低肝脏自愈能力。雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)是多种细胞内和细胞外信号的传感器，能够调节细胞增殖、代谢和细胞周期进程。ZhOU等74通过2/3肝切除急性肝损伤模型和体外细胞实验发现，补骨脂素能够上调CyClinE1、p27的蛋白表达，降低CyClinDI的蛋白表达，诱导细胞G1/S期阻滞；激活AMPK,剂量相关性地降低AKT和p70S6K的蛋白表达,抑制哺乳动物mTOR信号通路来影响1.O2细胞增殖。梁佩诗等75通过四氯化碳致小鼠肝损伤模型研究发现，补骨脂素还可以通过上调p27>p21和p53的蛋白表达引起肝细胞G1/S期阻滞。23氧化应激与线粒体功能障碍氧化应激是一种体内ROS形成超过细胞抗氧化能力的不平衡状态。转录因子NF-E2相关因子2(nuclearfactorerythyroid2-relatedfactor2,Nrf2)/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-I(KeaPI)系统是氧化应激的防御者，当受到外界刺激时，Nrf2与KeaPl解离进入细胞核，刺激SOD、谷胱甘肽转移酶等相关抗氧化基因和II相解毒酶的转录76。文献报道，补骨脂素能够增加斑马鱼幼虫体内KeaPl的mRNA水平，下调Nrf2的mRNA表达，显著降低Mn-SOd的mRNA水平；剂量相关性抑制SOD活性，引起ROS以及脂质过氧化终产物MDA水平升高169o提示补骨脂素诱导斑马鱼肝损伤的分子机制可能是通过产生大量ROS或抑制机体抗氧化系统清除能力，激发氧化应激状态，产生大量自由基和脂质过氧化物，从而引起生物膜损害产生肝损伤。线粒体是细胞内能量代谢的主要场所，在ATP合成和细胞凋亡等进程中发挥重要作用。补骨脂素能够破坏大鼠肝细胞和1.02细胞线粒体膜完整性，引起ATP合成障碍74；降低HepG2细胞中ATP含量，增强膜间1.DH渗漏性，激活caspase-8和caspase-3,上调CHOP和Bax表达；上调斑马鱼幼虫体内促凋亡蛋白P53、PUma、apaf-1>caspase-9和caspase-3的基因表达，下调凋亡抑制因子Bc1.2表达，通过线粒体依赖途径诱导细胞凋亡69。2.4 内质网应激反应内质网能够通过控制蛋白质的合成、折叠和修饰以及钙离子运输来维持细胞内的稳态。未折叠蛋白反应(Unfoldedproteinresponse,UPR)在恢复内质网稳态过程中发挥重要作用，但持续的内质网应激反应又可通过UPR途径诱导细胞凋亡。UPR通路由双链RNA激活激酶样ER激酶(doublestrandedRNA-actiVatedproteinkinaselikeERkinase,PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiringenzyme1,IREla)和激活转录因子6(activatingtranscriptionfactor6,ATF6)3种传感器蛋白组成。补骨脂素可通过激活内质网应激和UPR通路诱导HepG2细胞凋亡。Yu等77研究发现，补骨脂素显著增加了内质网应激相关标记物如GrP78、PERK、eIF2>ATF4和ATF6的mRNA表达和转录水平；上调磷酸化JNK和CHOP、BaX的mRNA表达，表明补骨脂素激活了内质网应激反应并通过UPR通路诱导细胞凋亡。2.5 抑制肝药酶活性细胞色素P450(CYP450)主要分布于肝微粒体中，是药物在肝脏中进行氧化代谢的主要酶系，其中CYP1A2>CYP2C9.CYP2C19>CYP2D6、CYP2E1和CYP3A46种亚系参与了90%的药物代谢。部分毒性药物可通过抑制CYP450酶活性来减慢原型药物的代谢转化速率，引起体内毒性药物的蓄积，诱发更为严重的毒性损伤78。补骨脂素在肝脏中主要经CYP450酶进行代谢，研究表明，补骨脂素可体外抑制HepaRG细胞和原代人肝细胞中CYP3A4、CYP1A2和CYP2E1酶活性70,79；性别相关性抑制大小鼠肝中CYP2D6和CYP2E1的mRNA表达80。提示补骨脂素可能通过抑制CYP450酶对其降解速率，提高肝脏中补骨脂素的分布量，引发机体肝损伤。2.6 氨基酸代谢异常Zhang等81采用IH-NMR代谢组学技术结合常规血清生化进行补骨脂素致肝损伤的作用机制探究，结果发现，补骨脂素可引起生物体内氨基酸代谢紊乱，并在血清和肝脏中分别筛选得到7、9种肝损伤潜在生物标志物。对差异代谢物进行通路分析得出，补骨脂素可能是通过干扰级氨酸、亮氨酸和异亮氨酸在血清和肝脏中的生物合成引起的机体肝损伤。YU等71进一步探究发现，长期给予低剂量补骨脂素会引起雌性大鼠血清中丙氨酸代谢、谷氨酸代谢、尿素循环、葡萄糖-丙氨酸循环、氨循环、甘氨酸和丝氨酸代谢途径的紊乱，提示补骨脂素可能在抑制游离氨基酸合成蛋白质的同时阻止了其作为底物进入糖异生。3结语补骨脂素具有抗骨质疏松、抗肿瘤、抗氧化和神经保护等药理作用82,在疾病治疗过程中，通常是由多种途径相互影响、共同发挥治疗的作用。因此全面了解补骨脂素药理作用机制，可为其进一步的药理研究和制剂研发提供参考。伴随补骨脂及其复方制剂用药过程中引起的肝脏毒性报道日益增多，补骨脂肝脏毒性的物质基础也受到学者的广泛关注。现已发现，补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚具有肝毒性83。补骨脂素可通过影响肝再生、胆汁酸平衡、氧化应激和线粒体功能障碍等途径引起肝毒性。补骨脂诱导的肝毒性也表现在机体胆汁淤积、氧化应激反应和肝再生受到影响等方面，提示补骨脂素是补骨脂产生肝毒性的物质基础。建议在优化补骨脂炮制减毒方法的过程中重点关注补骨脂素等兼具药效和毒效的成分含量变化情况，以确保在降低不良反应的同时又能最大程度地发挥其药理作用。此外，补骨脂素既具有抗氧化的药理作用又可引起机体过氧化应激反应；既能缓解肝脏慢性炎症,抑制炎症推进导致肝纤维化的发生,又能引发机体肝损伤,目前暂未有学者对此现象进行探究。补骨脂素的量效毒关系和其对肝脏的保护和损伤双重作用机制等问题仍是其药理毒理研究中待解决的关键问题。附参考资料：基于雷公法结合盐炙法对补骨脂的炮制及肝毒性评价目的基于雷公法结合盐炙法对补骨脂进行炮制减毒并评价补骨脂炮制前后的肝毒性变化。方法建立高效液相色谱法同时测定补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂乙素和补骨脂酚6个指标成分的含量；选取醇浓度、醇浸时间和蒸制时间为考察因素，以指标成分含量下降率的综合加权评分为指标，正交试验优化炮制工艺，并通过小鼠肝毒性实验评价补骨脂炮制前后的肝毒性。结果补骨脂最佳炮制工艺，按中国药典2020年版盐炙法制备盐补骨脂，取盐补骨脂适量，加入5倍量80%乙醇浸泡24h,倒出乙醇并用蒸储水洗净，加入5倍量蒸锵水，浸泡12h,倒出蒸馈水并洗净，置蒸锅内隔水蒸4h,取出晾干;由该法炮制所得的补骨脂炮制品中毒性成分含量明显下降，小鼠肝毒性显著降低。结论该炮制方法可明显降低补骨脂的肝毒性，为临床合理炮制补骨脂提供参考。补骨脂，又名破故纸，是豆科一年生直立草本补骨脂PSOraIeaCOrylifOIia1.的干燥成熟果实，性温，味辛、苦，归肾、脾经，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻的功效，临床用于治疗肾阳不足、腰膝冷痛、五更泄泻等，外用治白瘢风及斑秃口。现代药理研究表明补骨脂具有抗骨质疏松、抗肿瘤和抗氧化等药理作用2。然而，近年来临床相继出现了补骨脂及其复方制剂长期或大剂量使用致严重肝损害的案例报道3-6,已经引起国内外研究者及药监部门的广泛关注，这在一定程度上限制了补骨脂及其复方制剂的临床应用。因此，探索有效的减毒方法，促进补骨脂及其复方制剂的临床应用及其产业化发展显得尤为重要。合理炮制是降低中药毒性的有效方法之一，文献报道的补骨脂炮制减毒方法有盐炙法、雷公法、酒焙法、清炒法等，其中以盐炙法为主7-8,中国药典2020年版一部收载的补骨脂炮制品为盐补骨脂1补骨脂盐炙不仅是引药下行、增补肝肾，还能通过除去药物中的燥性达到减毒的目的9。但是，研究发现盐补骨脂仍然具有一定的肝毒性UO-11,影响其临床应用的安全性。文献报道，雷公炮炙论记载的酒浸水漂法（雷公法）可有效降低补骨脂的潜在肝毒性12。因此，本研究尝试将盐炙法与雷公法结合对补骨脂进行炮制减毒研究，以补骨脂中致毒的关键成分补骨脂酚、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂乙素口引及毒效成分补骨脂素和异补骨脂素的含量变化为指标，重点对雷公法进行炮制工艺优化，并初步评价其炮制减毒效果。1材料1.1 仪器1.C-20AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；BT25S电子天平（十万分之一分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ5200-B型超声波清洗仪（市超声仪器有限公司）；TG16-W高速离心机（离心机仪器有限公司）；EPOeh酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）;ASP300S型全自动封闭脱水机（1.eiCa公司）；RM2135型切片机（1.eiCa公司）；BX51型显微镜（O1.YMPUS公司）；BMJ-I型包埋机（机电公司）；SI-M82型打粉机（股份有限公司）；蒸锅（股份有限公司）；C21-RT2149美的电磁炉（生活电器制造有限公司）；药典三号筛（实验室设备有限公司）。1.2 药品与试剂补骨脂（产地河南，购自中药饮片有限公司，批号为）经医学中心主任药师鉴定为豆科植物补骨脂PSoraIeaCorylifoIia1.的干燥成熟果实；对照品补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂酚（批号分别为，质量分数均298%）均购自生物技术有限公司；丙氨酸氨基转移酶（A1.T）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（生物工程研究所有限公司，批号分别为）；食盐（中盐盐业有限公司）；4%多聚甲醛溶液（科技有限公司，批号）；95%药用乙醇（石化有限公司）；乙懵和甲醇（色谱纯，FiSher公司）；甲酸（色谱纯，生化科技有限公司）；其余试剂均为分析纯。1.3 动物昆明小鼠，雄性，SPF级，体质量（20±2）g,购自动物养殖中心，生产许可证号SCXKOo动物实验经医学中心伦理委员会批准，批准号为空特（科研）第。2方法与结果2.1 补骨循中指标成分定量分析方法的建立2.1.1 色谱条件DiamOnSil-C18色谱柱（25OmmX4.6mm,5Um）；流动相乙懵（八）-0.1%甲酸水（B）,梯度洗脱，012min,48%53%A；1230min,53%70%A；3040min,70%85%A；4045min,85%A；4550min,85%48%Ao柱温30；检测波长为240nm;体积流量1.Om1./min；进样量IOU1.2.1.2 对照品储备液的制备精密称取对照品补骨脂素15.00mg异补骨脂素5.80mg、新补骨脂异黄酮9.80mg、补骨脂甲素8.00mg,补骨脂乙素9.00mg分别于IOm1.量瓶中，甲醇定容，制成含1.5Omgm1.补骨脂素、580Ug/m1.异补骨脂素、980Hg/m1.新补骨脂异黄酮、800ugm1.补骨脂甲素、900Ug/m1.补骨脂乙素对照品储备液。精密称取补骨脂酚21.8Omg于25m1.量瓶中，甲醇定容，制成872g/m1.对照品储备液。2.1.3 混合对照品储备液的制备精密量取Im1.补骨脂素、2m1.异补骨脂素、0.5m1.新补骨脂异黄酮、0.5m1.补骨脂甲素、0.5m1.补骨脂乙素、5m1.补骨脂酚对照品储备液于同一Iom1.量瓶中，甲醇定容，制成含150Ug/m1.补骨脂素、116Hg/m1.异补骨脂素、49Hg/m1.新补骨脂异黄酮、40ug/m1.补骨脂甲素、45Ug/m1.补骨脂乙素、436g/m1.补骨脂酚的混合对照品储备液。2.1.4 供试品溶液的制备取补骨脂适量粉碎，过三号筛，精密称取粉末0.1g,置25m1.量瓶中，加入20m1.甲醇，超声提取30min,放冷，加甲醇至刻度，摇匀，取适量，15000rmin离心Iomirb取上清液,用0.45Um微孔滤膜滤过，即得供试品溶液的进样溶液。2.1.5 阴性对照溶液以甲醇为阴性对照溶液。2.1.6 专属性试验精密吸取阴性对照、混合对照品及供试品溶液各IOu1.,按“2.1.1”项下色谱条件分别进样，记录色谱图，见图1。补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂酚色谱峰均能实现基线分离，分离度均大于1.5,理论塔板数按补骨脂素峰计均不低于3000,且阴性对照溶液对测定无干扰。A1.补肾脂素补肾质素3.新补骨脂异黄*44卜骨脂甲素5.补青脚乙素6外骨脂酚1-psoralen2-sopsoral3-neobav*asofhxaDe4-bavaachm5-SObavadUdCCne6-bakuchol图1阴性对照溶液（八）、混合对照品溶液(B)和供试品溶液(C)的HP1.C图Fig.1HP1.CChi-OmatOgraiiisofnegativereferencesolution（八）mixedreferencesubstances(B)andsample(C)2.1.7 线性关系考察精密量取混合对照品储备液5m1.于Iom1.量瓶中，用甲醇稀释定容后，再同法逐级稀释，配制成一系列浓度梯度的混合对照品溶液，分别取IOU1.按“2.1.1”项下色谱条件进行分析。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，见表I。结果表明6种指标成分在一定的浓度范围内线性关系良好。«1指标成分的回归方程、相关系数及线性范圉Table1Regressionequations,ConelationcoefficientsandUnearrangesofindicativecomponents成分回归方程T线性范卸（gm1.3补骨质素y=755M9X+531730.99994.69150.00异补骨脂素Jr=49954X+243650.99993.63116.00¥补骨膈异黄第r=53870Z+124090.99991.53-4900补骨脂甲素y=38986÷193040.9998l254000补骨质乙素X=26117X+447010.99991.41-4500补骨抵的y=14983Z+44314099991363436.002.1.8 精密度试验取“2.1.7”项下中间浓度混合对照品溶液适量,按“2.1.1"项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂酚峰面积的RSD分别为0.44%、0.60%>0.51%>1.31%、1.37%、0.49%o2.1.9 稳定性试验取补骨脂粉末0.1g,按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24h,按“2.1.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积。结果显示补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂酚峰面积的RSD分别为0.52%、0.42%、1.10%、1.05%、1.63%、0.87%o2.1.10 重复性试验取补骨脂粉末0.1g,共6份，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算各指标成分的质量分数。结果显示补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异