表观遗传学和代谢组学在中药研究中的应用.docx

摘要：中药具有多组分、多靶点、多途径的作用特色和复杂性，使得中药现代化研究任务艰巨，许多医药研究工作者为此而不懈努力。系统生物学和组学的发展，为中药与现代科学融合迎来了契机。特别是表观遗传学和代谢组学整体性、动态性、个体化以及与环境相互作用的特点与中医药作用理念相契合。主要对表观遗传学研究较为热门的DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA调控在中药研究中的应用，以及代谢组学在中药药效物质基础、质量控制、药效作用机制等方面的应用进行了综述，提出了二者结合创新应用在微观层面阐明中药整体作用机制及多组分、多途径、多靶点协同作用机制的思路，为中医药核心思想科学内涵研究探索新的研究模式。随着人类疾病谱的变化和生命科学的深入发展，医学界已逐渐认识到单因素、单靶点治疗模式存在的局限，特别是难以应对病理机制复杂的疾病，而中药多组分、多靶点、整体调节、协同作用的作用特点，使其在治疗复杂疾病方面表现出独特的优势，同时也因为中药物质基础和作用机制的复杂性，使得中药现代化进程面临困难。表观遗传学和代谢组学是20世纪40年代和90年代发展起来的2门新兴学科，其整体性、动态性、个体化以及与环境的相互作用的特点与中医药作用理念具有高度一致性1-2,不仅为中医药与现代科学的融合迎来了契机，也为阐明中药作用特点的科学内涵提供了新思路和新方法。1表观遗传学在中药研究中的应用1.1 表观遗传学概述1942年，WaddingtOn首次把DNA序列不改变，表型或基因表达发生可遗传变化的现象称之为表观遗传学。Bird于2007年提出在后基因组学的表观遗传学时代，从表观遗传学的角度来防治疾病是当前研究的主要方向。应用表观遗传学方法，不但可以充分了解和研究人类各种疾病的发病机制，而且可以发现和寻找到疾病发生的预警和防治靶分子，在疾病的诊断和防治中发挥重大作用5。生物体是由遗传信息和表观遗传信息共同作用的结果。整个基因组通过核昔酸精确地复制、转录和翻译，保持遗传信息的稳定性和连续性；表观遗传学体现的是基因调控功能，即基因受内外环境等因素的影响，在DNA核甘酸序列不发生变化的情况下，基因表达水平发生可逆、可遗传的改变，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和MiCrORNAS(miRNA)调控等6。研究表明中药多组分、多靶点、多途径的作用特点有可能是通过调控或恢复基因表达平衡，从而达到恢复机体正气和阴阳平衡，利用表观遗传学有可能在分子水平揭示中药整体作用与多组分协同作用机制的本质与科学内涵。因此，近几年表观遗传学在中药研究中的应用日渐引起关注。1.2 DNA甲基化与中药研究DNA甲基化是在甲基转移酶(DNA-methyItransferase,DNMT)的催化下，DNA的CpG二核甘酸的胞喀咤选择性地结合甲基，形成5-甲基胞喀咤7。研究表明DNA甲基化紊乱是众多疾病、特别是病机复杂疾病如免疫性疾病、病毒性疾病、代谢异常疾病、心脑血管疾病、癌症等的共有模式，针对异常DNA甲基化双向调控的治疗研究日渐成为防治复杂疾病的重要策略，这与中药调控作用理念也不谋而合8-10。目前大部分中药调节DNA甲基化研窕集中在探讨中药单体成分和中药复方对全基因组和异常基因甲基化状态的调节。主要通过调控DNMT水平、调节相关信号通路、调控相关蛋白等发挥调节甲基化状态的作用。如前期研窕比较多的姜黄素、丹参酮HA、雷公藤内酯醇、雷公藤甲素、苦参碱、天花粉蛋白等中药单体成分和参茸补血丸、青黄散、消痰散结方等中药复方。中药调控DNA甲基化的应用实例见表1。表1中药调控D、A甲基化的应用实例Table1.ApplicationexamplesofrrAdiriona!ChinesemedicineinregulatingDNAmethyhcion研般J象作用描逑MXP,1要黄素通过DNA脱甲基作用恢复TRAMP-Cl细胞中表观遗传学上沉默的Nrf2基因以及其他潜在基因，济导NtC介导的抗氧化应激细胞防御途检来达到侦防前列朦癌的作用姜黄素【党姜黄素可以诱导急性1»细胞样白血病细胞的DNA去甲基化,其机制可他是DNMTl水平的降低并伴Ipl5基因后动子的低甲基化要黄黄口”要黄素可以降低CNE-I细胞RECK基因启动f,仝基因维和细胞核内甲基化水平丹参JHIiAM丹参用IlA可以降低肝BHepG2骄电DGm水平,调整甲基化状态，从而起列抗肿相作用丹参制HA。9丹参酗11不仅可以降低小鼠皮肤表皮JB6细胞DNMTR6JMT3a、DNMT3b和HDAC3的蛋白质水平.抑制HDAC的睥活性，还可以激活即信号通路外诱导Nri2基因CPG岛的去甲基化布公1»内幽静。同南公Il内渐解通过语身MolM细胞异常甲基化的P15基因去甲基化.从而使pl5基因恢复表达,起到抑制细胞增殖的作用雷公甲素功南公藤甲素通过抑制H1.-60细胞DNNfTl和DNMr3b基因表达未上响DAPK-I基因的甲基化水平，从而激活某些信号通路诱导细胞凋亡苦金编【呵苦参吸处理K562细胞石.基因组整体甲基化水平基本无变化.(HRIZl基因用功手发生夫甲基化反应.使RIZlmRNA表达水平明显H高大花黝蛋白大花粉蛋臼镌导He1.a和CaSia细施APC和TS1.C】基因CPG岛去甲基化，并恢复/它的布宫颈鹿细感系中的mRNA和冬白质水平上的表送参建补H儿网参白补名丸通过抑制DNMT的活力.降低DNA甲基化水平,使受损机体肝、肾组织低甲基化,从而促迸生脑器官发自或提高组织修复一黄黄青黄散能够抑制DNMn的表达，减轻DNA甲基化程度.从而政善患者外病血象并起到治疗作用消痍散得方t词消使散结方葩够影响囿施细阳系MKN45、BGC823细胞抑卷基因pl6的表达，减低KMl基化水乎.增加pl6基因的mRNA表述而让到抑制肿瘤生长的作用中医理论认为阴阳处于不断运动变化中，临床上通过平衡阴阳以达到“阴阳自和”是中医治疗疾病的最终目标。而DNA的甲基化与去甲基化也处于动态变化中，DNA甲基化本身的特点与中医的特色理论有着一种天然而隐约的联系2引。对此，有学者提出现有的研究和进一步的研究将证明中医阴阳的生物学根本基础可能就在于DNA高甲基化与低甲基化10。如周庆兵课题组利用甲基化免疫共沉淀联合测序的方法，分别研究了桅子川萼胶囊对兔动脉粥样硬化模型和桅子昔对RAW264.7细胞DNA异常甲基化的影响24-25。研究发现桅子川萼胶囊和桅子昔不仅能促甲基化，同时还能去甲基化，即通过双向调控异常基因的甲基化来治疗动脉粥样硬化，这可能与其调节蛋白激酶C的活性、炎症信号通路和MAPK信号通路等有关。因此研究中药通过双向调节异常基因甲基化水平达到治疗疾病的作用可能是下一步作用机制研究的重点。1.3 组蛋白修饰与中药研究组蛋白修饰(histonemodification)是指在相关酶的作用下，组蛋白发生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺甘酸化、泛素化、ADP核糖基化等过程。较之于DNA甲基化的稳定性，组蛋白修饰较为动态，并与DNA甲基化相互影响发挥调控功能26。Hsieh等27通过访问两个公共中药数据库、NCBI分类学数据库和公共化学-蛋白质相互作用数据库，发现3294种中药中有1170种与人组蛋白修饰酶发生相互作用，中药复方的协同作用主要是通过同时抑制DNMT和HDAC,共同抑制组蛋白乙酰化和H3S10磷酸化或共同抑制H3K4脱甲基和H3K36脱甲基。Nardi等28研究发现雷公藤甲素诱导肺癌细胞凋亡与组蛋白3(H3)的整体表观遗传学变化有关，主要通过上调Wnt抑制因子的蛋白质表达。但雷公藤甲素对所有5个Wnt抑制因子的启动子区域中的任何CpG岛上的DNA甲基化状态均无影响。1.U等29研究发现中药制剂今复康给药肺癌细胞后，多个基因的H3K4Me3修饰状态显著改变，并提出了SUSD2、CCND2、BC1.2Al和TMEM158可能是今复康治疗肺癌的潜在靶标，其研究结果表明今复康可能通过对肺癌多个基因位点的组蛋白修饰的调节发挥抗癌活性。Sun等30研窕发现蛇床子素可以上调组蛋白乙酰化酶，特异性催化H3K9、H3K14的乙酰化，改善细胞层和牙周炎组织层骨的形成，结果表明蛇床子素是一种通过调节细胞表层工程中的表观遗传修饰来治愈牙周炎的有前途的药物。1.4 miRNA调控与中药研究miRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小为2025个核昔酸，与各种疾病的关系及潜在的诊断治疗价值逐渐引起人们的重视，中药对miRNA的调控也逐渐成为研究热点31。赖小华等32研究发现三七皂昔Rl有较好的延缓血管内皮细胞衰老的效果,其机制可能是通过调控miRNA-34aSIRTlp53通路延缓了血管内皮细胞衰老的进程，即三七皂昔Rl通过降低细胞内miRNA-34a的表达，增强SIRTl表达，降低肿瘤抑制蛋白p53的乙酰化程度，减弱p53激活下游衰老相关靶基因转录的活性。研究表明雷公藤多昔可以降低类风湿关节炎患者的miRNA-146a水平，改善类风湿关节炎患者的临床症状3引。雷公藤多昔还可以下调单侧输尿管结扎（UUO）幼年大鼠肾脏miRNA-192、1型胶原的表达，减少细胞外基质沉积，改善肾间质纤维化34。Wu等35研究发现从甲鱼中提取到的甲壳肽处理AGS细胞后，有IOl个miRNA（49个上调的miRNA和52个下调的miRNA）显著差异表达，miRNA-375、let-7d、miRNA-429、miRNA-148a148b和miRNA-34a等几种抑制肿瘤的miRNA显著上调，从而影响癌症相关途径进而达到治疗癌症的效果。2代谢组学在中药研究中的应用2.1 代谢组学概述1985年，NiCholSOn研究小组利用核磁共振（NMR）法，通过对大鼠的尿液代谢物进行分析，发现与其病理的变化存在关联，于1999年提出代谢组学概念I36o虽然代谢组学是一个新兴的学科，但其技术和研究思路已经被广泛应用于药物研发、中医药、农业、营养学、毒理学、微生物等与人类健康密切相关的领域37。它是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后系统生物学的又一重要分支I38o代谢组学通过对内源性小分子代谢物的整体性、系统性分析，获得反映机体功能状态的代谢指纹特征和代谢网络，揭示机体生命活动代谢本质以及机体微环境的状态。其“整体-动态-综合-分析”的研究思路与中医药整体观不谋而合39o近年来，代谢组学应用于中药物质基础研究、中药质量标准研究以及中药药效作用机制研究成为热门，为中药现代化瓶颈问题的解决提供了有力帮助。2.2 代谢组学在中药药效物质基础方面的应用阐明中药药效物质基础是中药现代化的关键问题之一，也是中药研究的难点和热点40。用传统研究化学成分的方法研究起来费时、费力，且不能体现其整体性作用特点，利用代谢组学的技术和方法，在中医药理论指导下多角度、多层次系统的研究中药及其复方，揭示中药及其复方产生药效的物质基础，为中药现代化研究提供了新的思路41。1.iu等42利用UhplC-ESI-Q-TOF-MS技术对防己黄芭汤进行了系统的研究，共鉴定出了17种指示肾病综合征的生物标志物，并筛选出多种用于治疗肾病综合征的活性成分，一定程度上阐明了防己黄苗汤的药效物质基础。Wang等43利用代谢组学的方法对芍药甘草汤进行研究，从大鼠血浆中共鉴定出12种化合物，包括9种原型成分，2种代谢物和C9H10O3,这些化合物可能是芍药甘草汤治疗痛经的物质基础。Cao等44利用UplC-ESI-Q-TOF-MS技术对温心方研究发现，口服给药大鼠后，其血浆中共检测到32种化学成分，包括26种原型成分和6种代谢产物。Cao等45利用IH-NMR的代谢组学方法对脑振宁颗粒进行了研究，发现脑振宁颗粒的治疗作用与18种脑代谢产物的调节有关，其中的13种化合物可作为脑振宁颗粒中抗脑损伤的活性化合物。23代谢组学在中药质量控制中的应用一般认为中药发挥作用是其内在多种活性成分共同作用的结果，而药材品种、产地、气候、采收季节、炮制方法、储藏条件等因素对中药化学成分都有较大的影响46。现行的中药材质量控制模式主要依靠指标成分含量测定和指纹图谱技术，与传统的外观性状评价相比，新技术的发展极大地提高了中药材的可控性。但现有的质量控制指标缺乏专属性或与活性的相关性不大，如多种药材均采用绿原酸为指标；而指纹图谱技术只能进行相似度评价，却无法将其与中药材优劣性进行关联47。为了探索新的中药质量控制模式，国内外研究人员进行了大量的创新性研究，近些年来，一些研究者尝试将代谢组学的方法应用于中药材质量评价中，并取得了较好的效果。Wang等48利用UHP1.C-ESI-Q-TOF-MS/MS技术对荚膜黄黄与蒙古黄黄进行研究，共鉴定出可以区分荚膜黄黄与蒙古黄黄的53种化学标记物，利用代谢组学的方法可以快速、准确的筛选中药的特征化学成分，为多基源中药的质量控制提供新的评价模式。Dai等49结合使用NMR和1.C-DAD-MS的代谢组学方法对不同品种、产地的丹参进行了系统的研究，发现同一地理位置生长的3个丹参品种和同一丹参品种生长在不同地理位置的化学成分有所不同，表明丹参药材的质量与产地有较大关系。Xing等50对僵蚕的形成过程进行研究，通过对多种代谢产物的检测，发现了有望用作质量控制的指标成分，深入阐释了僵蚕的质量形成机制。Zhan等51对牡丹皮进行研究，共筛选并初步鉴定出28种化合物可作为区分正常、硫化和脱硫的牡丹皮的标志物。这种方法也可用于其他硫化和脱硫中药的研究，并为中药及其炮制品的质量控制提供一定参考。2.4 代谢组学在中药药效作用机制方面的应用中药及其复方是多组分的复杂体系，通过多途径、多靶点发挥治疗疾病的作用。目前，多数中药的药效作用机制还不明确，传统的药理实验方法大多数只能在某一方面揭示中药治疗疾病的作用机制。代谢组学因其整体性、系统性的特点,不仅可以研究中药本身的代谢变化，还可以研究给药后机体内源性代谢物的变化，通过筛选生物标志物并进行代谢通路分析，多途径、多靶点系统阐释中药药效作用机制52。韩红祥等5引利用UP1.C-Q-TOf-MS技术进行五味子治疗糖尿病并发症大鼠尿液代谢组学研究，发现了28种潜在生物标记物。这些生物标志物主要影响戊糖和葡萄糖醛酸相互转化通路、精氨酸和脯氨酸代谢、肠内菌代谢等多种代谢通路，表明五味子可能从能量代谢、氨基酸代谢、肠内菌代谢、脂类代谢等多个角度发挥治疗糖尿病并发症的作用。Yang等54研究发现，三草颗粒可以明显下调血清生化指标，减轻组织学损伤，抑制中性粒细胞浸润，改善伴刀豆球蛋白A对小鼠的肝损伤，其治疗作用可能是通过将潜在的生物标志物逆转至正常水平来实现的，涉及脂肪酸生物合成、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、甘油磷脂代谢和脂肪酸代谢等多条代谢通路。利用代谢组学的方法一定程度上阐释了三草颗粒多途径治疗肝损伤的作用机制。He等55利用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱的非目标代谢组学方法研究定志小丸治疗阿尔茨海默病的作用机制，共发现26种潜在的生物标志物，其中15种生物标志物被鉴定出来。这些生物标志物主要影响牛磺酸和低牛磺酸代谢，色氨酸代谢和苯丙氨酸代谢的途径。定志小丸通过介导抗氧化应激，调节能量代谢，改善肠道微生物和保护神经细胞，达到治疗阿尔茨海默病的作用。此外,代谢组学也为中药毒性研究、中药配伍研究等提供了一个良好的平台，相关研究实例见表2。表2代谢组学近年在中药研究中的其他应用实例Table2OcherApplicationsofmerabolomicsinresearchoftraditionalChinesemedicineinrecentyears研究对象样品类型分析技术结果描述情网坳血清UP1.C-HDMs快榔提取物处理的大取血清中筌定出了花生四烯酸和亚油酸等16种潜在的生物标记物.何助于迸步广解放榔的心IH毒性和神经毒性何苜乌Pn血清1.C-MS-Q-TOF筛选出油酸跳胺等6种何首乌诱S肝脏毒性的潜在生物标志物.时于监测服用何背吗患者肝功能、+期发现何首乌肝损伤具有潜在的应用价值和意义白头茹IiSm同血清Uplc-QTOF-MS共签定出15种与慢性肝损伤相关的生物标志物乌头网血清Uhplc-Q-Tofms研冗发现中雨患者血清中32种代谢产物发生改变，并首次发现碟叫端殿和一些一酸酸的改变与乌头生物缄的毒性有关惋于淳朴历（坳血浆UP1.C-Q-E-MS血浆样品中共签定出与脂质代谢和氨基酸代1«有关的20种潜在内源性代WJ产物.并提出板广昔在肝组多1中的积累可能是限广厚朴汤导致肝毒性的因素之黄药f网肝祖织GC-MS1H-NMR共ffil选出61种差异代谢物.分布在43个代谢途校中.并发现嚓小、啧好和肠道微纤维代谢可能是黄的子诱发大鼠肝损伤代附并常的新途径菊三m血浆、尿液、XFfijRUP1.CMS鉴定筛选出翦七致肝毒性的16种潜在生物标志物，揭小萄;七可导致叁基酸代谢、做肪代谢和能SHt谢等代谢通路的紊乱金玲于敬阳乐液、飘清UIWMS共签定出44个差异代t物.叁眸于做会导致敕瓜酸和谷胱甘肽的代谢失薪,造成机体能量代解或双化应激Ifl节的紊乱,产生大鼠体内的损伤雷公甘草闽伍幽尿液HP1.C-MSfS-ITTOF共签定出14个潜在的生物标志物.并推测Iir公静用毒性与嘤岭代甥和硒锐基酸代谢相关,而配伍甘草后则可调整这些代谢通路.促使其转内为正常状毒白木桑白皮配伍同尿液Uhplc-QTOF-MS共鉴定出32个与肾病拣合怔相关的差异标志物，给药后这些代随物有向正常水平回调的均势，且白术-桑白皮配伍Ifl比中用组有更为明显的回调络势制川乌-白芍配伍旧1能便UP1.C-Q-TOF-Ms共整定出袒雄、甘瓜胆酸等6个差异代谢物.制川乌-白芍配伍组比单用组更容易"Hifl-上述差异代甥物至正常水平附子-白芍配伍网血浆UP1.C-MS附亍胎溶性生物碱与白芍总行配伍能调用略氨酸、香草基扁梗Ie等途在的代酣素IS1.且白芍总背能减少的质溶性生物碱对照肪、SS酸和能量代谢的I二扰，为可能的减毒机制黄冬-黄连配伍回血浆、尿液Uplc-Q-TOFMS共鉴定出14种（血浆中9种,反液中5种）与2%值尿病相关的生物标志物，黄苓黄连配伍组和单用组均可以一定程度上使这些标志物恢复至正常水平，R配伍ifl的恢复效果更加&著3表观遗传学和代谢组学结合应用于中药研究表观遗传学理念与中医中药核心思想、作用理念的内在一致性，以及表观遗传学不断发展的方法技术，可以在分子水平揭示中药作用机制的本质；代谢组学可以帮助分析中药作用物质基础、表观遗传调控结果的表现以及细胞微环境的变化。二者相结合创新应用，能在微观层面系统地揭示中药整体作用机制，进而帮助阐明中医药核心思想的科学内涵。长期以来，因为中医药理念的系统性和整体性,使得中医药理论与从单因素、单靶点发展起来的现代科学相互融合困难，严重影响了中医药现代化进程。利用现代科学阐释中医药理论的科学内涵、在微观层面揭示中药整体作用机制与多组分间协同作用机制、建立符合中药作用特点的评价模式一直是中医药现代化亟待解决的重大前沿瓶颈问题。随着现代科学技术和生命科学的不断进步，系统生物学、网络生物学、计算生物学等的发展，意味着现代科学已日渐走向对复杂体系的认识和分析，意味着在微观层面揭示中医药核心思想科学内涵的时代正在到来170o表观遗传学体现了基因因为内外环境的影响发生可逆性的变化，体现了环境与自身相互作用的平衡关系，这些与中医整体观、辩证观的核心思想，与中药调节机体功能、恢复机体阴阳平衡的作用理念存在深刻的内在一致性。研究表明中药多组分、多靶点、多途径的作用特点有可能是通过调节异常基因表达使其恢复正常水平，从而达到恢复机体正气和阴阳平衡。而且表观遗传学研究方法的发展已可以完成从整体水平到特殊途径和靶点的分析，因此将表观遗传学运用到中药研究中，不仅有利于揭示中药多组分、多途径、多靶点的作用机制，而且可以揭示中药“治本”的原因，阐明中药整体作用分子机制的本质与科学内涵。表观遗传学理念与中医中药思想内在一致性示意图见图Io图I表观遗传学理念与中医中药思想内在一致性Fig.1IntemalconsisrencybetweenepigeneticsideaandideaoftraditionalChinesemedicine代谢组学可以整体反映药物对机体内源性代谢物的影响，不但可以评价药物整体作用的表象效果，帮助推断可能的作用途径和靶点机制，而且代谢物可以反映细胞的生存环境，机体微环境，如代谢物变化可以直接导致基因的表观遗传学改变，从而影响细胞/机体功能，这也是癌症转变的主要原因71-73。表观遗传学和代谢组学在中药研究中各自具有独特的优势，在深层次中二者又相互影响、相互关联，而且表观遗传学和代谢组学的研究已可以完成从整体到特殊途径与靶点的分析。二者结合研究，可以在微观层面阐明中药整体作用机制和多组分协同作用机制，在分子水平揭示中药作用现象（代谢组学）与本质（表观遗传学）的关系，以及对微环境的影响（代谢组学），从而有利于系统阐释中药整体作用的科学内涵。因此本课题组在多年深入思考和研究的基础上，首次提出将表观遗传学和代谢组学结合应用的创新研究思路，为微观层面、分子水平阐明中药整体作用本质以及多组分协同作用机制建立新的研究模式，促进中医药核心思想科学内涵研究以及与现代科学的有机融合。代谢组学在中医药领域的应用与展望中医药研究一直以整体观为基础，注重多靶点协同的联合作用机制，致力于维持人体内外平衡以攻克疾病。近些年来中医药科研成果丰硕，在世界范围内受到越来越多的认可和普及，尤其是在疾病早期干预、联合用药、肿瘤控制、辨证治疗等方面显示出巨大优势。但是，中医药治疗疾病的科学内涵仍缺乏现代研究的证明。同时，中医药多组分、多靶点、多途径的特点，决定了其作用机制的复杂性，也正是中医药研究难以突破的关键问题。因此，建立联系中医药与现代化研究的重要桥梁已成为现代医学研究的主要焦点。代谢组学技术最早由NiChOlSOn教授在1999年提出，即以生物体内的小分子代谢物为研究对象，通过多种现代分析技术从整体水平测定体内代谢物的动态变化，多角度解析生命体生理和病理状态1。代谢组学的整体性、动态性研究体系与中医药“整体观”的研究思想不谋而合，与中医药多靶点、多途径的作用特点相匹配，能精准分析生物体系功能水平和代谢物的变化，为从微观上解读中医药复杂作用机制和科学内涵提供崭新的方法和理论视角，使中西医结合成为了可能2-5。本文通过总结近10年相关文献，综述代谢组学在中医证候、中药药效作用机制、中药安全性评价和中药质量控制的应用进展，对代谢组学研究方法和相关代谢通路进行概括。以疾病为切入点，详细列出代谢组学在中医证候与疾病及病证结合和中药药效作用机制方面的研究成果。并对代谢组学在中医药研究中存在的问题和脂质代谢组学、空间代谢组学、代谢流分析等前沿技术进行思考和展望,以期为中医药代谢组学研究提供新思路，为进一步揭示中医药科学内涵和推动中医药现代化发展提供参考和指引。1代谢组学技术研究流程和方法完整的代谢组学研究流程(图1)包括样本前处理、代谢物分析、数据分析、代谢物鉴定和代谢通路分析。目前，代谢组学常用的生物样本处理方法为溶剂沉淀、固相萃取、液液萃取、超临界萃取等6。中药材样本前处理方法中，中药鲜品一般需液氮冷冻后研磨成粉后进行冷冻干燥，再由甲醇、乙曙等有机溶剂进行提取；中药饮片需根据所含化合物的类别，采用不同溶剂进行有效成分的提取。在检测方面，代谢组学由最初的非靶向代谢组学逐渐发展到靶向和拟靶向代谢组学，分析方法主要为核磁共振技术(nuclearmagneticresonance,NMR)和质谱法(massspectrography,MS)o近些年来，NMR成功建立低温探针、毛细管探针、脉冲序列等技术，在短时间内可对多个样本进行定性和定量7。液相色谱(Iiquidchromatogram,1.C)-MS(1.C-MS)技术具有灵敏度高和稳定性强的双重优势，能够准确、定量生物样本中的痕量代谢物，是MS联用中应用最广泛的一种技术网。气相色谱(gaschromatography,GC)-质谱联用(GC-MS)技术需对样本进行衍生化预处理，适用于分析具有挥发性质的化合物。此外，高分辨质谱成像(massspectrometryimaging,MSI)作为-一种新型的分子影像技术，能进行代谢物的可视化分析，并结合MS的结构鉴定能力，获取代谢物的空间分布信息，常用的质谱成像技术有空气动力辅助电离(airflowassistedionization,AFAl)质谱成像(AFAI-MSl)、基质辅助激光解吸电离(matrix-assistedlaserdesorptionionization,MA1.DI)质谱成像(MA1.DI-MSI)和解吸电喷雾电离质谱成像(desorptionelectrosprayionization,DESI-MSI)等9-10。代谢组学数据预处理包括基线校正、峰对齐、峰识别、归一化等，可通过MetaboAnalyst5.0>WatersProgenesisQl和CompoundDiscoverer等软件完成。应用最广泛的数据模式识别方法为主成分分析(PrinCiPaICOmPonentanaIysis,PCA)>偏最小二乘判别分析(PartialleaStSqUareS-discriminantanalysis,P1.S-DA)>正交偏最小二乘判别分析(OrthogonaIPartiaIleaStSqUareS-discriminantanalysis,OP1.S-DA)等，进而采用变量投影重要性指标(Variableimportanceinprojection,VIP)筛选差异代谢物，通过HMDB、MET1.IN.MaSSBank等数据库鉴定潜在的生物标志物，经MetaboAnalyst5.0和京都基因与基因组百科全书(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)等进彳亍相关代谢通路分析112代谢组学在中医证候研究中的应用中医证候是中医基础和临床研究的核心，指疾病发生和发展过程中某阶段人体特定内、外环境的反应，结合相关病理和辨证论治能够揭示患者的病因和病性等内容。证候具有特定的外候和内涵，外候是疾病和病理的外在表现，内涵是人体疾病表象背后蕴藏的发病机制和病理变化，其与生物体内代谢变化切实相关，是开展中医药研究的重要方向12。采用代谢组学对代谢物的可量化差异进行分析，为临床中医证候的客观化和精准化治疗提供新的研究思路和技术13。Guo等14结合靶向和非靶向代谢组学方法对稳定型冠心病心绞痛实证和虚证临床血清样本进行分析，发现不同证型稳定型冠心病心绞痛具有不同的代谢特征，长链不饱和脂质代谢紊乱及能量代谢是冠心病心绞痛实证和虚证之间的关键区分点，脂质神经酰胺和不饱和脂肪酸可分别作为二者治疗的靶点，从而表明体内差异代谢物是中医辨证分型的物质基础。王亮等15对大量临床血浆样本的代谢特征进行分析，发现慢性萎缩性胃炎的发病机制与葡萄糖、丙氨酸、缄氨酸、谷氨酸、甘氨酸、乳酸等代谢途径紊乱相关，并发现慢性萎缩性胃炎脾胃虚寒证和脾胃湿热证患者在糖代谢、脂代谢、核酸代谢和氨基酸代谢存在显著差异，揭示慢性萎缩性胃炎同病异证的潜在作用机制。马欣等16、刘畅等17、GU等18分别对湿热证非酒精性脂肪肝、乙肝、关节炎的代谢组学特征进行研究，3种异病同证中均发现糖代谢异常。非酒精性脂肪肝和乙肝合并湿热证的谷氨酸和核甘酸代谢异常，湿热证关节炎患者血浆中脯氨酸、糖基去氧胆酸水平升高，尿素、游离脂肪酸和多不饱和磷脂酰胆碱水平降低。肠道菌群对体内代谢具有调控作用，1.in等19结合代谢组学和16SrRNA测序技术对脾阳虚患者的血液、尿液和粪便等临床样本进行综合代谢和微生物分析，发现拟杆菌等活性菌与胆汁酸代谢，乙醛酸和二竣酸代谢，鞘脂代谢，色氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢密切相关，肠道微生物与脾阳虚证候体内代谢差异相关。Jiang等20基于MA1.DI-MS技术首次全面分析肾阴虚合并糖尿病患者的代谢组学和蛋白质组学特征。结果发现，肾阴虚合并糖尿病患者的肌酎、柠檬酸、氧化三甲胺、苯丙氨酸和酪氨酸水平降低，丙氨酸、甘氨酸和牛磺酸水平升高，这些代谢物变化与氨基酸代谢、能量代谢和肠道菌群的改变有关，阐明中医辨证论治的分子基础。以上研究表明，代谢组学通过分析同病异证、异病同证、同病异治和异病同治的差异代谢物和代谢途径，从而揭示中医证候的科学内涵。在同病异治上，慢性萎缩性胃炎脾胃虚寒证和脾胃湿热证2种证型患者的缴氨酸、乳果糖、异丁酸、肌肽等含量不同，可作为分析同一疾病2种证型的潜在依据15；在异病同治上，肝纤维化和肺纤维化存在相似的代谢轨迹，尿液样本中均发现肾上腺素红、异柠檬酸、硫酸叫I跺酚等相同的生物标志物，这些相同的代谢物及变化趋势为肝、肺纤维化的异病同治提供重要参考21。综合上述文献结果表明，代谢组学在中医证候的研究已由单一的证候向病证结合方向发展，将中医证候与疾病相结合，逐渐将中医证候的诊断和分析精确到点，以促进中医临床对疾病的预防和早期治疗。代谢组学在中医证候研究中的应用见表Io，/kKXMGC-MS代."ftr.Mn.2rR*t.«1.ai<，MMQ-TQVnBMHKMna.n.mn-VMXQTCfgKBn*.代9IMX-Q-TOVMi位Mll<rVVUQTOrM/.三*n.n.*,MUMx-mmGC-Nt*三r.n.n.un.松6后>SnHft'9mnun*,u*t.*un-wm<i.isn.noc-mOK*气.<M*t.-.u<al.,HMftRIOC-MSfl*MH.UK.Ma代.Bn.11aran*vftBUQQMk内.，s<.Mn.itoc*URZoTofgKMn.代nQC-MSr.a.,a*.wt,.央nM3代谢组学在中药药效及作用机制研究中的应用中药及中药复方从整体调节人体疾病，最终起到标本兼治的作用，在长期慢性疾病的治疗上逐渐突显出优势，以达到临床干预的预期效果。中药多成分、多靶点、整体性的特点，增加了中药药效研究的困难程度，迫切需要建立一种在中医药理论指导下且符合中医药自身特点的现代化研究方法。代谢组学从整体出发，通过对生物体内代谢产物变化规律的认识，全面阐释中药对疾病的治疗机制I41o中医药在防治心脑血管疾病上具有丰富的临床经验和用药历史，Xu等42基于UP1.C-Q-TOF/MS和MA1.DI-MS2种代谢组学分析方法研究益心舒胶囊对心力衰竭的作用机制，2种方法对心力衰竭代谢网络研究具有互补性，其分析结果相互验证。在心力衰竭进展过程中发现21种差异代谢物，主要与脂肪酸、磷脂酰胆碱、胆汁酸、氨基酸和丙酮酸等代谢途径相关。经益心舒胶囊治疗后，棕桐油酸、花生四烯酸、乳酸等16种代谢物具有明显的回调趋势。此外，利用MA1.DI-MS在心肌组织凋亡位置进一步对棕桐油酸、棕桐酸、花生四烯酸和乳酸4个生物标志物的变化趋势进行验证，阐明益心舒胶囊的作用机制。1.iU等43采用代谢组学方法评价脑心通胶囊干预脑缺血大鼠疾病模型的整体疗效，在大鼠脑缺血后12h的血浆中鉴定28种生物标志物，氨基酸、脂质、神经递质和能量代谢发生显著变化。脑心通胶囊治疗后发现大鼠神经功能缺损和脑梗死面积减小，谷氨酰胺、PE(17：0)、1.ySoPE(20：1)、1.ysoPE(24:0)以及1.ysoPE(24：1)等逐渐回调，说明药物通过调节单胺类神经递质代谢、氨基酸代谢、能量代谢和脂质代谢等多种途径发挥作用，以达到治疗脑缺血的目的。除此之外，还有学者对天麻钩藤汤44、四妙勇安汤45、保元汤46和四逆汤47等中药复方的心脑血管疾病治疗机制进行研究，为全面阐释中药治疗心脑血管疾病的物质基础和新药研发提供理论依据。Wang等48基于快速解析液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(rapidresolutionliquidchromatography-quadrupole-timeofflightmassspectrometry,RR1.C-Q-TOF/MS)分析人参治疗脾虚证前后患者尿代谢组学数据，发现15种与脾虚证和药物作用机制相关的生物标志物，药物通过调节脂质、氨基酸、能量、喀咤和肠道菌群等代谢途径发挥作用，突显参苗治疗脾虚证患者在调节脂质代谢和肠道菌群代谢方面的特点。细胞代谢组学能直观体现疾病状态下某种细胞的代谢情况和药物刺激对细胞代谢的作用49,Ma等50结合细胞代谢组学和UP1.C-Q-TOF/MS的方法研究香附对三阴性乳腺癌的抗癌机制，发现其抑制肿瘤细胞的有氧分解、核昔酸代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢和喋吟代谢等，打破细胞三磷酸腺甘(adenosinetriphosphate,ATP)产生和消耗的平衡，抑制肿瘤细胞的增殖，从而诱导细胞凋亡。多组学联合应用为中药药效作用机制提供更全面的分析，1.V等51基于1.C-MS/MS的靶向代谢组学、转录组学和16SrRNA测序技术,从肠道菌群与代谢水平研究葛根苓连汤对大肠癌小鼠的治疗.机制。结果发现，葛根苓连汤通过调节甘油磷脂和鞘脂代谢途径发挥对大肠癌细胞的抑制作用，并与PD-I抗体联合用药后能逐渐恢复T细胞功能状态，说明中药复方葛根岑连汤结合PD-I阻断免疫治疗可成为治疗直肠癌的新策略。代谢组学在中药药效及作用机制研究中的应用见表2。在中医药现代化研究中，利用代谢组学结合多元统计分析，对生物整体代谢轮廓进行描述，探讨中药治疗循环系统42-48、神经系统56-59、消化系统60-68、免疫系统78-81和恶性肿瘤70-72等疾病的作用机制，推动中药作用机制的深入研究。综合上述文献结果表明，基于复杂的代谢通路和网络关联，运用细胞代谢组学和16SrRNA测序技术，能阐述生物体内不同层次的生命过程，将代谢组学结合多组学整合数据，逐渐精确对生物标志物的筛选，提高中药药效研究成果的准确性。«2代腼学在中药药效及作用机制研究中的应用Table2ApplMinoBofmetabolomicsisefficacyaBdme<h>aiuBre5earckofTCM喂瞧5贪校末及方法代制相路XM循环泵AQ舒牧囊MA1.iMMS、UP1.CQTOF»ew.事e代It生四煤酸代刷.胆闻舒，刷、42*心遢葭天除构由用妙勇交通ftxftHftMSUplc-Q-TOFMSUplc-Q-TofmsHP1.c-MSMS,H-NMR.1.C-MSGC-MS.Uplc-Q-TOTMS.氯里展代电、能代勤、脂国代甯KRKft*.冢4HR代喇.不但出IIiiglR合成丙朋代电.彳S代谢.次个代卡