HSC-T6细胞培养及鉴定实验报告.docx

经过夜孵育后取出用PBS漂洗3次，每次5mino2.3.5二抗孵育培育皿中滴加EliViSion试剂盒中的增加剂1滴（大约50"1.）,并于室温孵育20min,PBS漂洗3次，每次3min,然后每张组织切片滴加Elivision试剂盒中的二抗1滴（大约501.）,37C孵育30min,PBS漂洗3次，每次3min,2.3.6DAB显色培育皿中滴加簇新配制的DAB溶液50U1.,室温孵育Iomin,显微镜卜.视察有细胞中有明显的棕黄色颗粒状沉淀时，立即将组织切片放入自来水中漂洗以终止反应。2.3.7苏木素复:染苏木素复染3min,自来水冲洗使培育皿中的细胞核返蓝。2.3.8封片培育皿中滴加甘油，并以盖玻片封片。2. 3.9视察拍片在正置光学显微镜卜视察HSC-T6细胞胞浆中alpha平滑肌激烈蛋白染色，并于40倍、100倍、200倍下拍照。2.4HSC-T6细胞a-SMA细胞免疫荧光细胞接种于直径33TCn的细胞培育皿中，待细胞达到50%贴壁融合时，进行a-SMA细胞免疫荧光试验，步骤如下：2.4.1细胞固定：培育皿中加入ImII:1的冷的丙酮和异丙醉，置于-20°C定液，用PBS反豆漂洗3遍，每次5min。2.5.2油红O染色：培育皿中加入Iml簇新配制的油红O染液，室温放置IOmin后弃去染液，PBS反发漂洗3遍，每次5min.2.5.3苏木素豆染培育皿中加入Iml苏木素染液室温染色30s,弃去苏木素染液，以双蒸水漂洗3遍，每次5min,加入Ind的自来水反蓝。2.5.4封片培育皿中滴加一滴甘油并以盖玻片封片。2.5.5视察拍片正置光学显微镜下视察肝星状细胞胞浆中红色脂肪滴奥色，并在100倍、200倍、400倍视野卜拍照。2.6HSC-T6细胞VitaminA脂湎荧光视察,设置荧光倒置故微镜激发波长为328rm,视察培育的IISC-T6细胞胞浆中VitaminA脂滴荧光。二、结果与分析1. HSC-T6细胞培育传代的形态学特征基本状况HSC-T6细胞株培育5-8代时能视察到细胞较大，呈多边形、多核，且胞浆富含脂滴与VitaminA形态（见图1）,8代以后接着培育1ISC-T6细胞表现为肌成纤维样细胞的形态学特征，即HSC-T6贴壁后即起先伸展,CA、B：荧光倒置显微镜下，HSCT6形态，100X：B、C：荧光倒置显微镜卜，HSe-T6形态,200×（箭头所标示处为多核的HSCT6细胞）图3HSC-T6细胞密度加大时形态特征A、B：荧光倒更显微镜下，HSC-T6形态，100X；B、C：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态,200×2. HSC-T6细胞鉴定2.1 HSC-T6细胞脂肪清油红O染色含0.211M的油酸的完全培育基使HSC-T6细胞富集脂滴，并用油红0染液染色，光学正置显微镜下视察胞核呈蓝色，胞浆中有点状红色，为脂滴着色（见图4）。图4HSC-T6细胞脂滴的油红O染色400×2.2 HSC-T6细胞VitaninA脂满紫外激发的自发荧光HSC-T6细胞中的脂滴在328nm紫外波长的激发光下发出极易淬灭的蓝绿色荧光（见图5）。图5HSC-T6细胞VitaminA脂滴328nm紫外激发荧光200XA、B：暗场VilalDinA脂滴荧光;C、D叠加场VilaminA脂滴荧光2.3HSC-T6细胞a-SMA免疫组化HSC-T6细胞株为激活的肝星状细胞，细胞爬片显示HSC-T6细胞胞浆均可见棕黄色颗粒状沉淀，alpha-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色为阳性。图6HSC-T6细胞a-sma免疫组化染色（A：100X：B、C、D：400X）2.4HSC-T6细胞a-SMA免疫荧光HSC-T6细胞株为激活的肝星状细胞，a-SMA免疫荧光显示HSC-T6细胞胞浆均可见FITC的激发的绿色荧光，alpha-平滑肌肌动蛋白免疫荧光为阳性。ClC2DlD2图6HSC-T6细胞a-sma免疫组化染色（Al.Bl、C1：荧光倒置显微镜下明场视察200X；A2、B2、C2：荧光倒置显微镜下490nm激发，荧光视察2OOX：Dl荧光倒置显微镜下明场视察400×：C2：荧光倒置显微镜下49Onm激发，荧光视察100X）