玉米抗北方炭疽病鉴定技术规程（征求.docx

ICSDB62甘肃省地方标准DB62/T-XX-2022玉米抗北方炭疽病鉴定技术规程（征求意见稿）××××-×X-XX发布××××-×X-XX实施甘肃省市场监督管理局发布前言1 .范围12 .规范性引用文件13 .术语与定义14 .病菌接种体制备15 .抗性鉴定圃设置26 .接种27 .病情调查38 .抗性评价39 .鉴定报告4附录A培养基配方与制作方法5附录B玉米黍出芽短梗霉菌形态特征6Ux刖百本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则规定起草。本文件由甘肃省农业农村厅提出并监督实施。本文件由甘肃省粮油作物栽培标准化技术委员会归口。本文件主要起草单位：河西学院本文件参与起草单位：甘肃前进生物科技发展有限公司、金塔县农业技术推广中心、甘州区农畜产品质量检测服务中心、甘州区种子产业发展中心、甘肃德光农业有限公司、酒泉市通盈种苗有限公司本文件主要起草人：雷玉明、郑天翔、马金、李栋、冒国伟、张琪、陈海龙、吴尧、陆静、越文勤、陈晓燕本文件由河西学院负责解释。各单位或个人在执行本文件过程中如发现需要修改和补充之处，请随时将意见和建议反馈至玉米顶腐病检验鉴定技术规程编制组（地址：甘肃省张掖市甘州区北环路846号河西学院，邮政编码：734000,E-mail:Zyyndei,联系电话：13993672655）玉米抗北方炭疽病鉴定技术规程1 .范围本文件规定了玉米品种北方炭疽抗性鉴定技术和抗病性评价标准。本文件适用于玉米北方炭疽病接种体制备、鉴定网设置、接种、病情调查、抗性评价、菌种保存与处理、鉴定报告等的技术要求及玉米制种亲本材料、杂交种等抗性鉴定2 .规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用于本标准。本文件未引用相关标准3 .术语与定义以下术语与定义适用于本文件。3. 1玉米北方炭疽病一种由玉米黍出芽短梗霉菌引起玉米的真菌性叶部病害。3.2玉米蜀出芽短梗霉菌属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、短梗霉属的一种真菌。3.3单独分离是抱子分离的一种方法。在无菌条件下，通过解剖镜或显微镜观察胞子菌悬液或琼脂平板表面，利用解剖针或移植器、玻璃毛细管等挑取单一抱子，置于相应培养基上，萌发形成菌丝而获得纯菌种的方法。3.4PDA培养基称取马铃薯200g,洗净去皮切碎，加水IOOOml煮沸20min30min,纱布过滤，补水至IOOOnn,加入葡萄糖18g20g,琼胶18g20g,搅拌均匀，120125高压灭菌301而11。3.5KZM培养基称取酸甲基纤维素10g,麦芽糖5g,蛋白陈1.5g,KH2OPO1Ig,加入IooOml蒸储水中,加热溶解，补水至IOOOm1,120°C125°C高压灭菌30min,3.6PD液体培养基PDA培养基中不添加琼脂制作的液体培养基。3.7发病率玉米北方炭疽病发病率为受侵染叶片数占调查总叶片数的百分率表示，用以表示发病的普遍程度。采用公式(1)计算。Z(%)=df×100(1)式中：/发病率；d发病叶片数；M调查总叶片数。3.8严重度1级：代表值0,2级：代表值1,3级：代表值2,病斑；4级：代表值3, 病斑；5级：代表值5, 连，病叶枯死；6级：代表值6, 叶枯死；7级：代表值7,采用分级法表示，以穗位上部和下部叶片病斑的数量和病斑面积占叶面积的百分比表示发病级别，由轻到重划分为几个级别，每个级别赋予一定代表值，以表示受害玉米叶片的严重程度。叶片上无病斑；神位下部有少量病斑，病斑占叶面积5%以下；穗位下部有少量病斑，病斑占叶面积的5.1%10%,穗位上部有零星穗位下部有大量病斑，病斑占叶面积的10l%25%,穗位上部有较多穗位上部有大量病斑，病斑占叶面积的25.1%50%,穗位下部病斑相穗位上部病斑相连，病斑占叶面积的5(M%75%,穗位下部和上部病全株叶片覆盖病斑，病斑占叶面积的75.1%以上，叶片枯死。3.9病情指数是以玉米叶片北方炭疽病的发病率和叶片受侵染的严重程度数值化的综合表示指标，用以衡量玉米群体受北方炭疽病的危害程度，采用公式(2)计算。DI=(Xi×Si)/M×Sttua×100(2)式中：DI病情指数；W为累加符号，从0级病级数开始累加；XL第i病级数的发病叶片数；SL第i病级数的严重度代表值；M调查总叶片数；Sg为最高病级数的代表值。3.10抗性评价根据采用的技术标准判别玉米对北方炭疽病的反应程度和抵抗水平的描述。4 .田间症状鉴定参照A.1北方炭疽疽病症状特征鉴定5 .人工接种抗性鉴定5.1 病菌接种体制备5.1.1病原物分离利用组织分离法分离病原菌，将采集典型症状的病叶的病健交界处切0.2Inm0.3mmX0.2mm0.3mm小块，经75%酒精和0.1%升汞消毒，在无菌条件下接种于PDA培养基上，25黑暗培养，获得分离物。5.L2形态鉴定参照附录A.2玉米黍出芽短梗霉菌形态特征鉴定，确认为玉蜀黍出芽短梗霉菌。4.1.3分离物纯化采用单胞分离技术，在PDA培养基获纯培养物。5.L4致病性测定将纯培养物在PDA平板上培养15d,刮取分生泡子用无菌水制成浓度为1×IO、个mLlXIO6个mL的抱子悬浮液，喷雾接种于玉米叶片上，并保湿24h。接种IOd后观察发病情况。再从发病的组织上进行病菌再分离，获得纯培养，并与接种的菌种进行比较。5.2繁殖与保存5.2.1扩大繁殖将纯化分离物接种于PDA培养基25培养7d后活化，用灭菌内径6mm打孔器切取菌落边缘菌饼，移至KZM液体培养基中25、150rpm振荡培养3d,用于制备菌悬液。5.2.2菌悬液配制将带菌KZM液体培养基进行过滤，用血球计数板调制接种菌悬液，悬浮液中分生胞子浓度调至IXn)5个mt06个mL,加入0.02%TWeen20(Wv),备用。5.2.3菌种保存待纯化菌株菌落长满培养皿时用PD洗下分生泡子，过滤后获抱子悬浮液与50%甘油1:1比例混匀，确保甘油浓度为25%,保存城-80超低温冰箱备用5.3鉴定圃设置鉴定圃可设置在田间或温室内，鉴定材料的播种时间与大田生产的播种时间相同，随机排列或顺序排列，小区行长400cm500cm,行距60Cnb株距25cm,5行区，每行保苗3035株，设3次重匏。周围设置200Cnl保护行。5.4抗性鉴定设计鉴定材料可设苗期鉴定和成株期鉴定，设对照品种为黄早四,6.抗性测定6.1接种时间苗期鉴定玉米长至67叶期接种，成株期鉴定玉米抽雄期接种。6.2接种方法依据抗性鉴定设计和玉米生育期特性，接种方法应满足以下要求：a)喷雾接种，宜适合于苗期鉴定，将菌种用无菌水调制抱子悬浮液，装入小型手持喷雾器，均匀喷雾接种于植株叶片,接种量控制8ml/株IOml/株。要求抱子悬浮液在植株叶片上不流淌为宜。应选择在雨后或阴天的傍晚进行接种。接种后保湿48h,7d后调查发病情况。b）灌注接种，宜适合于成株期鉴定，用一个带刻度的IOml注射器吸取抱子悬浮液，从玉米心叶与其下的展开叶叶鞘相接处以下灌注心叶，接种量控制5ml/株6ml株。要求注射器不带针头，以心叶处冒出水珠为准。6 .3环境控制土壤肥力水平和耕作管理与大田相同，接菌时每个处理之间要进行薄膜隔离保护，接种后湿度控制在24÷1°C相对湿度保持在100%或叶面有水滴存在。7 .病情调查7.1 调查时间自然抗性分别在拔节期、大喇叭口期、抽雄期调查，人工接种分别在苗期接种7d后、成株期接种1416d进行抗性调查。7. 2调查方法田间根据症状特征调查发病情况，调查被接种部位的上、下叶片，根据对病害症状的描述，随机抽取鉴定圃中间3行的玉米叶片80100个，逐叶进行调查记载严重度、普通率和病情指数。8. 3病情分级田间病情分级、相对应的症状描述见表1。表1玉米抗北方炭疽病鉴定病情级别划分病情级别症状描述0叶片上无病斑1仅在穗位下部叶片上有少量病斑，病斑占叶面积少于懿3穰位卜部叶片上有少量病斑，占叶面枳6%10%,槐位上部叶片有零星病斑5穗位下部叶片上病斑较多，占叶面积IK30%,槐位上部叶片有较多病斑7穗位上部叶片有大量病斑，病斑相连，占叶面积31%70%,下部病叶枯死9全株叶片基本为病斑覆盖，叶片枯死7. 4普遍率计算每一鉴定材料随机调查80100片叶，计数发病叶片数，计算普通率。普通率（%）=（发病叶片数/调查总叶片数）×100%8. 5病情指数计算每一鉴定材料随机调查80IOO片叶，分别记载病情级数，计算病情指数病情指数=E（各级病叶数X各级代表数值）/（调查总叶片数X最高级代表值）XlO0%8抗性评价8. 1有效性判别当感病对照品种的病情级别达到7级时，该批次鉴定有效。9. 2抗性评价标准依据鉴定材料的病情级别确定其抗病水平，划分标准见表2表2玉米抗北方炭疽病的评价标准最高严重度级别抗性类别缩写类别O级I免疫1级HR高抗3级R抗5级MR中抗7级S感9级HS高感8.3重复鉴定同一鉴定品种两年鉴定抗性类别不同的，则需要做第三次抗性鉴定。8.4抗性评价根据重复抗性鉴定结果对鉴定材料进行抗性评价，抗性以记载的最高病情级别为准。8.5鉴定记载表格玉米抗北方炭疽病的记载表格见表3。表3玉米抗北方炭疽病的记载表鉴定方法：鉴定地点:播种时间：接种时间：接种菌株：调查时间:品种编号品种名称品种来源各级严重度级别数最高严重度级别抗性类别。级1级3级5级7级9级鉴定人：年月日复核人：年月日9鉴定报告9.1鉴定报告一般以单个品种单独出具。如集中批量送样的，也可以多个品种出一份报告。9.2鉴定报告要盖鉴定单位公章，要有鉴定人和复核人签字。附录：附录A(规范性附录)玉米北方炭疽病症状、玉蜀塞出芽短梗塞苗形态特征A.1玉米北方炭疽病症状A.1.1眼状斑危害叶片，初期呈水浸状病斑，后渐扩大呈圆形、椭圆形或长圆形，草黄色，中央乳白色，边缘褐色，外围鲜黄色的狭窄晕环。A.1.2枯斑型病斑大小为0.5mm2.0mmX0.5mm1.5mm,病斑多相互融合，病斑正面中脉为淡褐色，形成不规则枯斑。A.2学名和形态描述A.2.1学名玉蜀黍出芽短梗霉菌AvreobasE加Zeae(NaritaetHiratsuka)Dingle异名：玉蜀黍球梗抱菌KabatiellazeaeNaritaetHiratsukaA.2.2菌落特征在PDA培养基上生长缓慢、菌落革质，呈放射波纹状，表面有极短的粉末状菌丝，初呈乳白色，随着菌龄增加，颜色渐变为粉红色，最后变为灰褐色或黑色A.2.3形态特征分生抱子盘大多埋生于寄主气孔下，极小，淡褐色，无刚毛。分生胞子梗短棒形，无色或淡褐色，顶端膨大，其上聚生分生抱子。分生抱子单胞无色，棍棒形，两端微尖，不分隔,大小为17.532.5m×2.55.Om,平均为3.51m×25.28m0玉米抗北方炭疽病鉴定技术规程地方标准编制说明一、工作简况（一）任务来源2019年12月25日，由河西学院申请制定地方标准的立项，根据甘肃省粮食与栽培作物标准委员会推荐的地方标准制订，甘肃省市场监督管理局批准第4批甘肃省地方标准制定计划要求,制订编号：2019-T-099,制订名称：玉米抗北方炭疽病鉴定技术规程。（二）起草单位及参与人员主要起草单位：河西学院参与起草单位：甘肃前进生物科技发展有限公司、金塔县农业技术推广中心、甘州区农畜产品质量检测服务中心、甘州区种子产业发展中心、甘肃德光农业有限公司、酒泉通盈种苗有限公司.主要起草人：雷玉明、郑天翔、马金、李栋、冒国伟、张琪、陈海龙、吴尧、陆静、越文勤、陈晓燕二、制定标准的必要性和意义（一）玉米北方炭疽病的发生现状玉米北方炭疽病又称“眼斑病二是世界性普遍发生的玉米叶部病害。引起该病害的病原菌为Aureobasidiumzeae(NaritaetHiratsuka)Dingle,最早于年在日本发现,随后在美国、加拿大、法国、新西兰、德国、阿根廷、澳大利亚、保加利亚、波兰、葡萄牙、克罗地亚、巴西、南斯拉夫、斯洛文尼亚和英国等国家都有发生。在我国，1978年在吉林省严重发生。近年来在辽宁、吉林、黑龙江、云南等地也有发生。自2013年以来，国家玉米产业体系病虫害防控研究室岗位专家调查表明，该病在东北地区、西北地区普遍发生。该病初期症状为点状水浸状斑，逐渐扩大至圆形至椭圆形病斑,病斑中间灰白色，边缘褐色和紫色，周围伴有黄色晕圈，病害发生严重时，病斑连片直至叶片枯死。该病害与弯抱菌叶斑病常混合发生，早期症状也较相似，生产上常容易混淆造成误判。2013年调查表明，该病在西北地区普遍发生，发病率在470%,平均损失在30%左右。特别是近几年来，甘肃省制种玉米田和新品种选育田、玉米品种生产区域试验田等发生普遍，据2014-2016年甘肃省调查，该病害在一些抗病品种或组合上，田间病叶率49%；在感病品种自交系或杂交种组合上，中度发生，病叶率达1530%；在MOl7、掖单等杂交种组合上重度发生，病叶率达68%80%。一般在玉米种子生产田可造成3050%的产量损失。目前大多数自交系和杂交品种均表现为感病。同时，玉米北方炭疽病会加重其他玉米病害的发生程度，例如茎腐病、根腐病和黑粉病等，给玉米种子生产带巨大产量损失。另外，甘肃省作为全国最大的优质玉米种子生产基地，每年均进行200份玉米新品种区域生产测试，审定100个左右玉米新品种，测试中和审定中对玉米北方炭疽病进行多次田间调查分析，判断其抗病性。由于玉米品种、环境条件的差异，各地炭疽病症状表现存在差异，给玉米制种企业、玉米种植户及当地植物保护部门带来鉴定因难，但目还缺少统一鉴定技术标准，为此制定该标准。（二）标准制定的目的1.提供适宜于甘肃省玉米抗北方疽病的统一的鉴定技术要求。近年调查发现，辽宁省、甘肃省河西走廊玉米制种基地上普遍发生此病，此病与弯泡菌叶斑病常混合发生，且症状与后者极为相近,诊断上常被混淆误判。为明确病害归属、流行特点等，减少制种企业之间与种植户、植物保护部门之间诊断混乱。因此，在不同地区制定相应的地方标准，有助于对该项病害准确鉴定。2,提供适宜于甘肃省统一评价抗北方炭疽病的标准。由于目前对玉米北方炭疽病的研究较少，尚没有建立该病害分级标准。同时，玉米品种、环境条件和不同生育期时期该发病程度存在明显差别，症状差异较大，对鉴定结果具有较大影响。室内致病测定时，自交系、杂交种在成株期的鉴定效果不理想，且在成株期鉴定需要较长时间，环境条件不好控制，操作困难，鉴定结果不稳定。因此，根据北方炭疽病的在玉米成熟期发病情况，参考玉米叶斑病分级标准，建立了玉米北方炭疽病病害分级标准，为玉米抗北方炭疽病育种和种质创新研究，筛选出优异的抗病核心种质提供一个统一标准。3.为有效防治玉米北方炭疽病提供基础理论依据。缺乏抗性品种是该病害流行的主要原因。据资料报道，不同品种间存在抗性差异，但差异不显著，自交系和杂交品种均表现为感病。为此，制定该标准，规范甘肃省玉米品种的抗病性选育和玉米品种抗北方炭疽病鉴定，为推广抗病品种提供理论依据。（三）标准制定的意义L为政府在玉米有害生物科学预警和科学执法提供规范性文件，提高了企业经营生产者的预冕性，增强了“预防为主”和防患减灾意识，显著地减少了农户、企业的经济损失,为抗病育种提供科学依据。对我国玉米产生具大的社会、经济、生态效益。2.为编制、评估和检验玉米种子、种植规划提供重要依据。三、编制的原则和依据（一）原则本标准的编制依据中华人民共和国标准法和地方标准管理办法的规定，按照GB“Ll-2020标准的结构进行编写。(二)依据1 .制订依据玉米北方炭疽病发生规律进行编写。2 .制订检验、鉴定玉米北方炭疽病技术参照植病研究法执行。3 .该标准是本项目组结合承担的2013年甘肃省财政厅、甘肃省农牧厅下达甘肃省农业科技创新项目(GNCX-2013-10)“制种玉米病害综合治理技术集成与示范推广”的研究成果,同时参考国内对玉米北方炭疽病的相关研究进展，制定的甘肃省玉米抗北方炭疽病鉴定技术规程。4 .建议将本标准作为推荐性地方标准批准发布，用于指导和规范我省玉米北方炭疽病检验检疫、抗病育种及其鉴定。四、主要起草过程(一)调查研究任务下达后，起草单位组织主要起草人员，对河西走廊玉米北方炭疽病原菌检验、田间鉴定参考依据进行了调查研究，对种子管理部门、植物保护部门对玉米北方炭疽病及其检验检疫科学依据咨询，对种子生产企业、农户在对玉米北方炭疽病的诊断中存在问题、遇到困难进行实地调查。起草人员收集参考相关玉米病虫害标准文本4个。目前相关玉米病虫鉴定技术规程仅见几种行业标准，如玉米抗病虫性鉴定技术规范，第1部分：玉米抗大斑病鉴定技术规范(NY/T1248.1-2006),第2部分：玉米抗小斑病鉴定技术规程(NYT1248.2-2006)、第3部分：玉米抗丝黑穗病鉴定技术规程(NY/T1248.3-2006).第4部分：玉米抗矮花叶病鉴定技术规程(NY/T1248.4-2006)o参考文献5篇，1部著作。经整理资料，编制标准草稿，起草小组讨论后形成征求意见稿，向15家单位、企业发出征求意见，收到15份反馈意见报告。起草小组对征求意见认真进行讨论，对征求意见稿进行修改，形成送审稿。(二)制订主要技术内容1 .范围主要规定了本标准的适用区域。2 .规范性引用文件目前尚未查阅到相关北方炭疽病行业标准和地方标准，故未列出引用文件。3,术语与定义规定了以下术语与定义适用于本标准，如玉米蜀黍出芽短梗霉菌、单抱分离等。4 .田间症状鉴定主要涉及北方炭疽病田间症状类型鉴定。5 .病原接种体制备主要涉及病原物组织分离、开态鉴定，分离物纯化，致病性测定。6 .抗性鉴定圃设置主要规定了鉴定圃设置、鉴定设计，种植要求。7,接种主要规定了接种时间、接种方法、田间管理等体要求。8 .病情调查主要规定了调查时间、调查方法、病情分级、普遍率计算、病情指数计算等内容。9 ,抗性评价规定了玉米对北方炭疽病的有效性判定、抗性评价标准、重复鉴定、鉴定记载表格设计等内容要求。10 .鉴定报告规定了抗性评价出具的具体要求。五、试验验证过程一是采集田间病害标本，调查发生时期。明确了北方炭疽病是典型叶部病害和茎杆类病害，即可危害叶片，又可危害叶鞘、苞叶、茎杆。在甘肃省主要发生时期为玉米抽雄期之前，抽雄后为严重发生期，成熟症状最为典型。采集与观察田间症状，根据病斑分布、病斑颜色、病斑大小等症状特点，结合人工接种发病的症状，归纳症状类型有两种，即眼斑型、枯斑型，这为北方炭疽病田间诊断奠定了基础。二是病原菌形态鉴定。经病叶保湿培养、病原菌常规组织分离，获得纯培养物，观察无性阶段的分生抱子盘、分生抱子梗、分生抱子生长方式、颜色、大小、细胞数量等，PDA培养基菌落性状，结合田间症状特点、病原菌形态特征和培养性状，确定玉米北方炭疽病的病原种类，为该病害鉴定关键性因素。三是病原菌生物学特性试验，测定病原菌在不同环境因素影响下生长情况，用于判定田间病害的发生规律。通过不同温度、不同Ph值、碳氮源、光照对菌丝、分生抱子生长的影响，寻找北方炭疽病菌菌丝生长温度、ph、光照、碳氮源范围及最适生长条件，结合室内病原菌生物学特性，分析北方炭疽病在自然条件下发生规律与其生物学特性相关性，为深入开展田间病害发生规律奠定基础。四是人工接种试验的抗性测定方法与程序，作为抗性测定关键技术。首先是接种体制备，即获得纯培养物；菌繁殖与保存，获得菌悬液和菌种；鉴定圃设置及抗性鉴定的设计;其次是抗性测定接种时间、接种量、接种方法、环境条件的控制等，为人工接种抗性测定奠定基础。五是病情调查，为抗性评价奠定基础。按病斑面积所占叶面积比例划分为6级，规定在拔节期、大喇叭口期、抽雄期调查，按照根据症状特征调查发病情况，调查被接种部位的上、下叶片，根据对病害症状的描述，随机抽取鉴定圃中间3行的玉米叶片80100个，逐叶进行调查记载严重度、普通率和病情指数。六是抗性评判和抗性报告。采用症状观察与描述，病原分离与生物学特性测定，人工接种抗性评价与自然抗性评价等方法程序，规定了抗性记载表及抗性评判标准、程序，方法可操作性强，验证准确性高。因此，该标准适应于在甘肃检验鉴定玉米北方炭疽病。六、重大意见分歧的处理结果先后向22家单位、企业发出征求意见，收到21份反馈意见报告。其中，种子生产企业5家，行业主管部门8家，事业单位8家。共计征求意见14条，并按照共性意见进行了意见汇总（见意见汇总表），起草小组一一进行讨论，对其中的11意见，起草小组均采纳，并对其中的11条意见进行修改。玉米抗北方炭疽病鉴定技术规程起草小组二O二二年五月十八日