Restriction endonuclease enzyme digestion限制内切酶.docx

全酶切。EeoRIStRkytMStlckytMRecoMbMrtC»«*一'前言：1950年科孥家樊现噬菌曲(phage)射大赐捍菌的不同菌株(strain)具召不同的感染实力。1962年瑞士科壁家WernerAitcr等人瞪出E.coliK菌株可羟生一值酵素能水解phage的DNA，因而耦悬限制薛素。1970年科家始利用限制醒素来鹿理白细胞分蹄出的畏脩型DNA以得到固定大小的特定DNA片段，可Bg用在基因组结横典重组DNA的探讨C二、目的：1 .揩分雕得到的飕DNA'以不同的限制酬切割，遮asarose腭?g泳分雌DNA片段彼检定Ga或截切所需DNA片段，以暹行重能DNA(recombinantplasmidDNA)之建，2 .戴照DNA:PBaC-D-Pn539-E豹7.2Kb典PET-21(+)的5.4Kb分别以限制酣BamUl舆EcdRl切割来检定plasmid的正硅性。三、原理：利用限制性内切Bl切割DNA是DNA里殂谩程中的丽键步骤之一胜利的醐明飨工作供应了有效的灾验材料。限制性内切的是细菌飕内限制修系统内部。本r运切断的内切的,根榛用其中的11型酹射DNA分子暹行切割。在前切反惬中，DNA的钝度、缎衡液中的度、Mg2+、pH值、作用潮«等因素均可影密反德一般可通遇增加酣的用量延是反愿畤冏等措施以逢到完限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)能!|寻骏股DNA切的酵素。切割方法是符M分子典磷酸之fW的健结切斯，瘦而於南保DNA鲤上各度生TH切，且不被填核昔馥舆修基切割形式有所,分别是可命突出WKDNAJ末端.以及末端平联凸起的由於新的DNA片段可由另一硬偶悬DNA速接前的酢素黏合，因此染色醴或DNAERestrictionEnzymeActionofEcoRI不同的限制片段得以较由剪接f乍用而结合在一起。EcoRlSmaIGAATrC一GCTTAAGCTTAA跖次未StiCkyendCCCGGGCCCGGGCCCGGG曲末Mbluntend限制酵素分别在特定DNA序列切割DNA形成stickyend(cohesive)（八）DNAWR(g)DNA«RCTTAAbCTTAATiIM1.E<oRW制<fftGCTTAAH用接合“使A&BDNA心成RcoombmantDNA形成bluntendGAATTCCTTAAG限制酵素的单位限制性内切酹的活性以随的活性单位unit表示，1Iwl罩位（Unit/U）指的是在反g¾聘情分20川，能遗溜度粽件下於一小8利寺尚）可揩l“gDNA分解完全的限制薛索盘限制牌的命名限制酶的命名是以的来源的原核生物的名耦扁依撼即曲的名耦的第一值!大同字母取自於易名的第TB字母其次、三佃小嘉字母取自於槿名的前丽(B字母字母接面的黑生别是面里地表明桎生物中不同限制的分融诩M底;限制能名稀的吉?方式，前三佃字母常用斜置或加下战僚表示。例如,分蹄自蜜色IMR菌(StrePtOmyCeSachromogenes)的雨樟限制酣被分别命名MSacl和Sacll。若同一生物植内又分聒不同的血清型或菌株品杀'其名耦卬J放在限制薛名稀的第三IH字母之彼。例如限制酣HincII和HindIII用J是分另庶自流感嗜血菌但aemophU5的/uenzae*qC和d血清型菌株，-/TidIII:HacmophilusinucnzacRd第三佃分触出的限制薛素-SalBAStaphylococcusaureusstrain3A-EcoRI:EscherichiacolistrainRY13-Ban:BacillusamyloliqucfacicnsH隈制薛的程贩> 已知的限制醐分悬TypeI'TypeII舆TypeIII三。> TypeI典TypeHI限制前同日等具有endonuclease典methylase的活性。> TypeI限制的曹庭檄的切割距雕辨i位置l0bp的序列，TypCnl刖只曾切割距蹄辨潢位置2426bp的序列。>Tyg11限制前，即曾尊一地切割所辨戢的核酸序列的位置一般可辨戢燹股DNA上特定的4-8佃触基，能在IS知序列内的特定位JK上切割噎股摞旋DNA。每一槿限制的能辨特定的DNA序列址加以切割，但它不佛切割细菌自己的DNA四悬细菌DNA上的切割位宜已被甲基化T肖悬restriction-modificationsystem>不同的级!菌中可触化出具不同理一性的限制薛素'可用来做基因剪接暗的I剪刀j使其成悬基因或分子道傅操作上趣悬有用的工具目前被Wf芝悉用於遇停工程、基(do11inQ和基1分析(genemapping)Cleavagesite(切制位工)typelll二林：restrictionmodificationMg*2orMna物辩婚位置均25-27bp的位J1.耨fttypeItypll如成之SUbUnit穆Si三段：一检：specificity:M堆位置restrictionrestriction:具内切够活性modification:具基峰活性我行CndOnUCleaseMg*2,ATPMg*2作用暗所需之帕因子S-adenosylmethionine(SAM)雄制XS位置的100ObP只在将定加弊以外的任何位置位置内或旁造第一型限制睥同畤具有修ft(modificalk>n)及12知切割(rc$lric【ion)的作用：另有熬知(recogn1ze)DNA上特定基序列的实力，通常其切割位(CIeaVageSiIe)距知位(攸OSniIionSile)可逢救干他崎基之道,址不能举硅定位切割位算i所以她不常用。例如：EcoB、EcoK。其次型限制廨只具有知切割的f乍用，修脚作用由其他薛素迤行。所熬知的位置多熟短的码文序列(Mindromesequence)：所剪切的i法序列通常即舄所熬知的序列。是遭傅工程上C用性敕高的限制酶，例如：EcoRI、HindIII。>第三型限制博典第一型限制醐似同畤具有修肺及熬知切割的作用。可熬知短的不封耦序列切割位舆知序列名勺矩24-26堪封她不能举硅定位切割位黠-所以她不常用。例如：EcoPI'Hin1111。上第II型限制酶>第11型限制酹只曾辨熬特定短的DNA序列，因此IK泛被堰用於基因工程的技衙上'目前商品化的,至品许多，可由生技公司脸得。此槿限制酣曾辨熬畏度4Ybps(或更是)等不同的核甘酸序列很举硅的在某一站上切DNA成轲稠的阚物交互分-追撞交互切口曾使DNA片段的5'和3'悠空成stickyend(orcohesiveend突出湍) Palindrome：5.GAATT3,3CTTAAG5, Dyadsymmetry(two-foldsymmetry)限制酵素其HXOgnitiOnSite的核苦酸序列的度：四低!核甘酸的tetramer五他核甘酸的pentamer六值!核甘酸的hexamcr八他核甘酸的OCIomer-XrecognitionSitC愈长,此Site出现在【)、A上的概率愈小切割位愈少 Isoschizomcr(同裂酶)：不同限制薛素辨婚相同DNA序列切相同位置：perfectisoschizomcr一切不同位置：impcrfbctisoschizomcrTypeIlrestrictionendonucleaseECORlCieaVgHindIlcleavage1：E：;二:.(protruding;overhang)Cohesiveend(Stickynd)3'-Kv<lrovlHITAIM/一'1j/一二一二二二Hx*二二-:r十7+<l二二二-一/广；二-l<tf*Ec2/T1.一l/一上常冕的内限制酶及其辨畿的切位博案名稿权切法氏ORIEscherichiaCCIi5,GAATTC3'CTTAAG5-GAATTC-3'3,-CTTAAG5'gw"HlBaCiHmsWYloliaMefaCieM5GGTCC3'CCTAGG5GGATCC-3,3CCTAGG5'Haemophilusinfluenzae5'AAGCTT3TCGAX5,-AAGC11T-3'3'TTCGA-5'Thennusaquatias5TCGA3'AGCT5'TCGA-3'3'-AGCT-5'NotlNOCaMiaOliIidiS5,GCGGCCGC3CGCCGGCG5GCGGCCGC-3'3CGCCGGCG-5'HinnHaemophilusinfluenzae5,GANTC3'CTNAG5-GANTC-3'3'CTNAG-5'SW3AStaphylococcusaureus5,GATC3,CTAG5'-GATC-3'3'-CTAG3'PwProIeMSVMka由5,CAGCTG3'GTCGC5-CAGCTG-3'3QCGAC-5'S"ul*SeEUiama/re$re$5,CCCGGG3'GGGCCC5-CCCGGG-3'3-GGGCCC-5'HaOicphiluse”沁C5,GGCC3,CCGG5'-GGCC-3'3,-CCGG-5'Alnl4ArIhtVbacIerhueus5,AGC1'3wCGA5AGCT3,3'-TCGA5'A"RV*Escherichiacoli5'GATATC3'CTATAG5,-GATATC-3'3'-CTATAG5'Kpnl人7"八储5GGTACC3,CCATGG5'-GGTACC-3'3'-CCATGG-5'PstlProNdenciuSluarlii5,CTGCAG3'GCGTC5CTGCAG3'3,-GACGTC-5'SaHSlrePICMyceSachromcgene*5,GAGCTC3'CTCGAG5GAGCTC-3'3-CTCGAG-5'Sitvp”>mcesalbue5,GTCGC3,CAGCTG5GTCGAC-3'3CAGCTG-5'SRhlStreptomvcexphaeoclm)tnoRttneS5,GCATGC3,CGTCG5-GCATGC-3'3CGTACG5'×biXanthemonaSbadHi5TCTAGA3,AGATCT5,-TCTAGA-3,3'-AGATCT5'*=平滑末喻Humend，)乳喂切酬bluntend):其末拈;滞切割(StiCkyend)1.限制酵素的运用1.覃一酵素运用：留意buffer2 .雨稚不同限制酵素以上一起运用：逗择可使雨槿酵素活性反雁逢75%以上的buffer先加低筮的buffer作用一酵素，再加入高舞的buffer作用另一酵素3 .常有多佃棣品要用相同的酵素庭理：配mastersolutionHindlll0.5lx5=2.5Bufferllx5=5TE6lx5=304 .Inactivationofrestrictionenzyme: heat PhenoizchlorofbrmAsoamylalcohol义Star-activity：指限制群素封所作用的DNA及序列失去再一性。常解素辨切割位的实力降低，醇致相像的序列或是的辨熬序列是度也曾作用，如六（固燮成只熬四（S而崖生的结果。>缘由/PH值谩高(8.0)/蹄子渭度遇低(<25mM)/高glycerol渡度(>5%vv)/溶液中含有檄溶液(如DMSO，酒精等).2+2+2+2+2/M一被其他二僧隔蹄子取代(如Mn,Cu,Co,Zn等)/酵素(UniI)典DNA重量(Ug)的比例谩高(每现酵素比例不同但一般在100uugB寺)四、材料典故借：材料：Jtflft:pBac-D-Pn539-E、pET-21(+)酵素：RNaseARestrictionenzymesEcoRI20UlbufferEcoRIBamHI20UzlbufferBamHlB倭器：蹄心檄、371的水浴槽五、冏题典A精样Ifo酰明限制酵素三槿type的特性?将HtypeI总成之SUbUnit检依三履：specificity:内域位置restriction:具内切活性modification:具基活性typ-It:restrictiontypelll二融：restrictionmodification4tendonucleaseMg",ATP作用畤所需之K因子S-adnosylmethionine(SAM)Mg*2Mg.?orMn”Cleavagesite(切割位置)WtStI1000bp只看特定环到以外的任何位置僮置内盛.旁造竭位堂的25*27bp的位Jt第一型限制解功能：限制、修前将站：需M广、ATP和S腺昔蛋氧Am陆助因数；Hl别位贴和切削位贴不一样，舞固定切割位骷；愿用：不常用其次型限制两功能：段别她将具切例DNA分子即通常所指DNA限制性核酸内切BI；反惠特BS:僮需Mj作催化反感助因JR能酷那&IDNA特别序列，加可特具切割DNA圭生特昊片段；«5用：Ot零繁多，分子克隆中姐常用第三型限制IS功能：限制、修Mi将站：需Mp、ATP和牛腺甘蛋氨S辅助因敷；特昊切割，切例位黠在距臧倒½3'端24%bpB1愿用：数量很少，掇赚作用B.何焉restziction-modificationsystem?(2)Ite菌如何反抗phage?展制祥素篇何不舍切自己的DNA?4物电冲制性内切酶经常伴随有12槿修腼（DNA甲基化酹），段看能保，9胞自身的DNA不被限制性内切破填修战於别的AX黠舆相虑的胆同性内切的慢同它优的作用是甲基化短脩健中的一IH龄基,而不是切展IDNA舞里基化所根的用上追揉限制性内切的和它的“搭悟”修醐一起钿成RM系统在某些RM系统中，限制性内切酷和恰佛曲是陶林不同的无白，它ITl各自阴立行使自CI的功差；W-些R-M系统本身就是他大的限制-修三合菊由不同生基或同一鹿至基的不同结檎域来分别轨行跟制或修觥的功差1 .就限制修箭系统（Restrictionmodificationsystem或R-M系流）是一植存在於细菌（可篷邂有其他原核生物），可保/但5兔於外来DNA（如噬菌醴）侵人的系统主要由限制内切酶和甲基化的组成的二元系统2 .细菌的限制修陈系蜕包含三例理销磨因：（1） hsdR：遍眄限制性核酸内切酹（2） hsdM：海碟跟豺性甲基（曲（3） hsdS：编碟限制性酶和甲基化萌的胳同表也3.作用悔制有些亚菌5内含有限症酶可符篁股DNA切斯之接其他的内切酶再将切下的片段降解因此能符入侵的外来DNA推较：有些病翻触化出封抗此系统的樵制，它IrI的DNA绕避了甲基化或利基化的修可阻碾限制酹的作用；覆有一些病得，如T3及T7理菌JS，即J合成出一些可抑制限制的的蛋白U；而舄了迤一步封抗病毒'有些细菌演化出身力群漱加切型已修断iDNA的限制系统。（2）宿主菌封噬菌醴的自然反抗犍制分熟40主要的别：吸附抑制、流紊成染、限制修箭系统和穿入阻滞.1 .吸附抑制（absorptioninhibitic最有效的防梁即是阻挡的age舆其之冏的任何物理性接斶，迨可以通谩细菌细胞壁上Phagc的受醴突建，或者可以更有效地通通分泌阻挡Phage接近的屏障，如：英膜'黏液Jg来置现。ex:通常情况下Tphage可以吸附在E.liB和K-12细）胞壁的特别位粘上旋筵行樽&QEcoliB和K-12的一些突燮殊在细胞壁上表逢祖多的多糖焚膜运些送多的焚膜覆蓄广细胞壁上phage的受醴位契It½而差生了封Tphage的反抗作用：而抑制英膜形成的E,coliB和K-12的11011.9的突燮株就能抑制Tphage的反抗作用，彩突爱株可能由赞生在non-9的等四基因上的组蛋白相的突爱形成。2 .流塞感染（abortiveinfection/AbD流圭感染（AbOniveinfectionAbi）系统（也耦噬菌熊排斥系虢）是在噬菌轮的不同装育口皆段干援琉菌醴增殖的一槿魔制。在噬菌轮感染的通程中噬菌醴的吸附和DNA注入正常彝生，只是接缜笠生的噬茵醴笠育翘程被终止。由於噬菌醴的侵入'斡援了宿主细胞的正常生理功能，洱致了被感染宿主细胞的死亡,避而籍止了噬菌醴的增殖，被感染细胞的死亡阳挡了噬菌髓的搔散热周圃钿胞的生存供应了保Abi系毓多数编碑在粒或前噬菌艘上，经常由单一宿主基因所介醇。ex：在入噬菌艘溶源性的大月分程茵中弁琪的Rex系统是目前B止探讨地清晰的Abi系统实例：ReX系统ReX系统ReXA蛋白ReXB蛋白感染噬菌体蛋白-DNA复合物一二ReXA（胞内感受器）RexB（离子通道）降低膜电势细胞ATP水平降低生物大分子的合成减少细胞增殖终止，噬菌体感染流产（需要ATP利ATP以来的细胞成分）3 .restriction-modificationsystem限制修蒯ReStriCtion-MOdifiCatiOnRM）系统是最早期现的细菌免疫系虢，典型的RM系统由限制蒯REaSe）和甲基裨核随（MTaSe制成'它伪通常成出现，具有相同的DNAg别位黠0REase缄别或裂解特定的DNA序列，同源的MTase封同一凝别位黠上的腺噪吟或胞喀淀迤行甲基化，保DNA不被REaSe裂解，正常情沆下，含有RM的细胞在DNA愎制遇程中被甲基化，而外来核酸（如噬苗艘和粒DNA）的甲基化模式典细菌本身的甲基化模式不一样'就可能被细菌的特定限制酶所降解。编碟RM系统的基因定位在粒或染色醴基因组中。RM系是细菌免疫防繁的胞内第一道防绿。在噬菌胞或移勤邂作元件尚未祓裂之前就降解其DNA是RM系就作用的突出特震;之4 .穿入阻滞由PNP40的堀碉的早期彝生作用的Phage反抗微制，可以解除典的吸附受阻、reslricion-modifiCauOnsystem、流崖感染（PNP40同畴寒褊碟流店感染犍制），他可以被以下黑他瞪撼支持：> Phage吸附到MGI614/pNP40典共吸附到敏感宿主上有相同的吸附效率，重i截察转现运梗附著是用正常的尾先定方向暹行的> 感染结果只有10%的含PNP40宿壬菌死亡，提示追硬PNP40编破的反抗横制的作用必定先於受感染彼宿主功能的丧失和DNA的降解> Phage基因组筵人含有pNP40的宿主接的内在化被延埋或减弱运即是至少在感染f30min内不能椀测到PhagC特意DNA的瞪捱，而在敏感宿主中感染接5min即能检测到通退窗穿孔符PhageDNA引入反抗宿主中造成是感染彼早期隋段假象也墟到ECOI的著增加，运支持早期即笠生作用的pNP40堀碉的反抗作用在PhageDNA穿入级!胞口皆段上演挥f乍用的微励（3）因熟常细胞内含有某趣限制性内切的畤细胞本身曾有相德的保as措施。比如细胞基因组中;攵有限制性内切酌能戢别序列的序列（冠桎情猊鹰是比较少的）：主要的是细胞内能通遇甲基化修8亚来保自身DNA不被自身限制性内切防髀切。