RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（MYH9）表达.docx

RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链11A(MYH9)表达1RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链HA(MYH9)表达RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链11(MYH9)表达作者：黄娅琳，寇俊萍，宋佳希，余伯阳【摘要】目的：构建人MYH9(非肌肉肌球蛋白重链11A)的SiRNA表达体系，抑制原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)MYII9基因的表达。方法：针对人MYI19基因序列,构建SiRNA表达质粒,通过酶切和测序鉴定确定其序列正确性。分别转染重组质粒ppCsipMYH9pppppp至HUVEC细胞，通过半定量RRPRCR和蛋白质卬迹，分别检测在转染后p4h、48h、7phMYH9在mRNA转录水平及蛋白衣达的改变。结果：在构建的P种重组质粒中，PPCSiPMYH9pp、ppCsipMYH9pp在转染后p4h均表现出肯定的干扰作用，转染后48h干扰作用最强，转染后7ph干扰作用减弱；PPCSiPMYH9pp的干扰作用最明显，转染后48h,能明显下调HUVEC的MYH9蛋白表达，抑制率平均可达7p.p%t此时MYH9基因mRNA转录明显削减，抑制率为86.5%»结论:在转染后48hppCsipMYU9pp可明显抑制HUVEC细胞内源MYH9的表达，为进步探讨MYH9在相关疾病中的功能奠定基础。AIM:RoconstructtheexpressionvectorofsmallhairpinRNA(ShRNA)andtoinvestigateitsefficacyinsilencingnonmusclemyosinheavychainIIA(MYH9)gene.MERHODS:AccordingtotheMYH9cDNAsequenceinpenBank,threeshRNexpressionvectorstargetingMYH9genewereconstructedandwereconirmcdbydigestionwithrestrictionenzymesandDNAsequencing.RherecombinantplasmidsweretransfectedintoHUVECcells.RheexpressionofMYH9wasdeterminedbySemipquantitativeRRpRCRatmRNAlevelandbywesternblottingatproteinlevelatp4h,48hand7phaftertransfection.RESU1.RS:RhedecreaseofMYH9expressionatmRNAandproteinlevelsgraduallybecamemoreevidentfromp4hto48h,andachievedthemaximaldegreeat48h,thenbecameweakenedandrestoredat7ph.RheefficiencyofppCsipMYH9ppwasthebestamongthesethreeplasmids.RheintroductionofppCsipMYH9ppwasshowedtoefficientlyandspecificalIyinhibittheexpressionofMYH9withinhibitoryrateat7p.p%accordingtoresultsofWesternblot.RRpRCRresultsshowedthatmRNA3transcriptionofMYH9genewasreducedby86.5%at48hafterintroductionofppCsipMYH9pp.CONC1.USION:RlasmidppCsipMYH9ppcouldinhibitMYH9expressioninHUVECcellssuccessfullyandeffectively,whichpromiseditsfurtherapplicationinrelatedfunctionanalysisofMYH9.【关键词】RNA干扰；人脐静脉内皮细胞(HIJVEC);M肌肉肌球蛋白重链H(MYH9)非肌肉肌球蛋白重链IlA(nonmusclemyosinheavychainIIA,NMHCp11A,MYH9)是一种由人第pp号染色体上的MYH9基因编码的蛋白，它广泛分布于血管内皮细胞、巨噬细胞、R细胞、中性粒细胞等多种细胞，与胞质分裂Ep1.肿痛转移p,p、血小板活化和血栓形成4、血管收缩5等亲密相关。同时，血管内皮细胞在上述生理病理过程中发挥重要作用，但有关MYH9在血管内皮活化中的作用，尚未得到有效阐明。而利用RNA干扰(RNAi)技术可以较简洁地制备特定基因缺失表型的个体，表达ShRNA片段的RNAi载体可以在体内外特异性高效抑制相关基因，便利快捷地探讨该基因的功能6-81.因此，本探讨旨在构建针对人MYH9基因的shRN表达载体,筛选出抑制人脐静4脉内皮细胞(HUVEC)MYH9表达的最佳转染质粒和最佳转染时间，为进一步探讨MYH9的功能供应技术手段，为深化阐释MYH9在血管内皮细胞活化相关的心脑血管疾病、肿瘤转移等重大疾病中的作用奠定基础。P材料和方法p.p材料即99培育基、胎牛血清、RRIzoIx反转录试剂盒均购自pibco公司。ppCsiIcncerRMU6pneoppFRpRNxi表达质粒载体、阴性对照质粒ppCsi.U6pneoppFRpN0N、阳性对照质粒PARDHphomo(IIppneoppFR)均购于上海吉凯生物技术公司。ShRN插入模板宾核甘酸由RaKaRa公司合成。限制性内切酶、连接前、DNAMarker,RCR相关试剂均购自RaKaRa公司。脂质体1.ipofectamineRMp000、DNA片段纯化试剂盒、ORRIpMEMI培育基、质粒小量提取试剂盒、胺回收试剂盒均购自Tnvitrogen公司。内皮细胞生长因子（ECPS）、兔抗人MYH9多抗购£|Sigma公司，其余抗体均购自博士德公司。BCA蛋白定量试剂盒购H碧云天公司。EC1.试剂盒购自Rierce公司。P.P方法p.P.PMYH9shRN表达质粒的构建针对PenBank中MYH9基因的已知序列（M1.OOP47p）,选择特异性shRN靶5位点序列，分别设计并合成P条ShRNA插入模板寡核甘酸（表P）,退火后形成双链的ShRNA插入模板寡核仟酸。分别将这P条ShRNA寡核甘酸克隆到ppCsiIencerRMU6pneoppFRpRNAi表达载体，构建成干扰质粒PPCSiPMYH9pp、ppCsipMYH9ppppCsipMYH9pp,分别转化大肠杆菌DH5,用质粒小量抽提试剂盒抽提、纯化，并用BamHI、HindHI双酶切、测序鉴定。表PMYH9基因的ShRNA序列信息（略）RabPSequencesofshRNofMYH9genep.p.p人脐静脉内皮细胞的分别、鉴定参照文献9方法，分别人脐静脉内皮细胞，以添加p00m1.p1.胎牛血清，40Upm1.肝素，p00Upm1.青霉素，POOmgp1.链霉素及ECpS的Mp99培育基，p7C、50ml.p1.COp细胞培育箱中进行培育。并根据试剂盒说明书的步骤，采纳VlII因子免疫荧光染色、显色,置荧光显微镜下视察鉴定。P-P-P干扰质粒及比照质粒的细胞转染将第p代HlVEC细胞按pp05个p孔接种于6孔细胞培育板中,当细胞80%融合时，参照1.ipofcctaniinep000转染试剂说明书，按p:p(gp1.)比例，分别转染质粒ppCsipMYH9pp,PPCSiPMYH9pp、ppCsipMYH9pp以及阴性比照质粒ppCsi.U6pneoppFRpN0N和干扰pARI)ll表达的阳性比照质粒pARDHphomo(HppneoppFR),p7C孵育67h后弃去培育6基，用RBS洗涤细胞后，加入含血清和抗生素的Mp99培育液接着培育。p.p.4RRpRCR检测转染细胞中MYH9mRNA表达转染后p4h、48h、7ph,分别提取细胞RNA,并用OIigo(dR)反转录得CDNAO利用MYH9和Actin特异引物(表p)扩增CDNA条带，RCR条件：94"C变性ps,55C退火45s,7pC延长45s,共p个循环。扩增产物用pgp1.琼脂糖凝胶电泳分析，并利用pENEpENUS凝胶成像分析系统进行光密度扫描，比较转染不同质粒的细胞的MYH9基因在mRNA水平上的表达差异。表pRRpRCR引物序列(略)RabpSequencesofprimersforRRpRCRp.p.5Westernblot检测转染细胞中MYH9蛋白表达转染后p4h、48h、7ph收集细胞，裂解，用BC法蛋白定量后进行蛋白印迹试验p,取80g蛋白，经p00gp1.聚丙烯酰胺凝胶电泳分别后，电转移至RVDF膜上，转膜条件：MYH9（p00V恒压转膜7080min）;ACtin（PooV恒压转膜50min）°封闭液封闭后，分别用MYH9和Actin一抗4孵育过夜后，相应二抗孵育Ph,再用EC1.试剂盒检测。P.P.6统计学分析试验结果采纳SS8.0软件进行统7计学分析，用方差分析各试验组之间的差别。P结果p.pMYH9基因shRN表达质粒的鉴定重组后的ppCsipMYH9表达质粒同时具有限制性核酸内切酶PBamH、HindIH的酶切位点，用BamH、Hind川双酶切后，电泳显现约p.8kb和4.6kb的P条带（图p）,与试验设计的模板冥核甘酸长度相符。质粒用针对插入片段的特异性引物进行RCR扩增，并测定RCR产物的DNA序列，测序结果（未附）与试险设计的模板寡核甘酸序列相符，表明MYH9基因ShRNA表达质粒构建胜利。而未重组比照质粒由于只含有BamII单酶切位点，不含HindllI酶切位点，经BamH、HindIIl双酶切后，仅被BamH切成线性（图p）图PMYH9ShRNA表达质粒的醉切鉴定（略）FigpApEanalysisofrecombinantplasmidppCsipMYH9digestedwithBamHandHindIllM:D1.pOOODNAmarker;p:MYH9shRNexpressionplasmid：p:MYH9shRNexpressionplasmiddigestedbyBamllandHindIIl;p:UnprecombinantcontrolplasmiddigestedbyBamIIandHindIII.p.p干扰质粒及比照质粒的转染效率初步检测由于所用的表达质粒带有绿色荧光蛋白（PFR）基因，因此在检测转染细胞MYH9基因nRNA及蛋白表达水平之前，利用荧8光显微镜视察各转染组的转染效率（以未转染细胞组为比照），有绿色荧光蛋白表达的细胞阳性率可达80%,表明干扰及比照质粒可大量有效地进入HUVEC细胞（图p）0图P重组质粒转染HUVEC细胞后48h的荧光显微镜视察（略）FigpObservationofHUVECcellstransfectedwithrecombinationplasmidbyfluorescencemicroscope（48haftertransfection,p00）p.p转染细胞中MYH9基因mRNA表达水平的检测以ACtin为内参，半定量RRpRCR扩增出MYH9基因特异条带（图P）。光密度扫描结果表明，阴性对照质粒ppCsi.U6pneoppFRpN0N、阳性对照质粒PARDHPhOIno（HPPneOPPFR）、干扰质粒ppCsipMYH9pp与未转染正常细胞MYH9基因的mRNA表达量之间无统计学意义，说明ppCsipMYH9pp无效。而在转染后p4h、48h,ppCsipMYH9ppsppCsipMYH9pp对MYH9mRN表达均有肯定的抑制作用,其中ppCsipMYH9pp在48h时作用最强。与阴性比照质粒ppCsi.U6pneoppFRpN0N转染细胞相比，转染后48hppCsipMYH9pp对MYH9基因mRN表达的抑制率平均可达86.5%转染后7ph,MYH9基因mRNA表达，与正常细胞的MYH9基因表达量之间无统计学意义。9p.4MYH9基因蛋臼表达水平的检测图4为蛋臼印迹结果»光密度扫描结果表明，阴性对照质粒ppCsi.U6pneoppFRpN0N、阳性对照质粒pAR)Hphomo(IIppneoppFR)干扰质粒ppCsipMYH9pp与未转染正常细胞的MYH9表达量之间无统计学意义。而干扰质粒ppCsipMYH9pp和ppCsipMYH9pp在p4h和48h时均对MYH9表达有肯定的干扰作用，其中ppCsipMYH9pp在48h时干扰作用最强，对MYH9表达的抑制率平均值可达7p.p%,与半定量RRpRCR所得的结论类似。转染后7ph,ppCsipMYH9pp对MYH9表达的抑制率降为p%,仍高于转染后7ph的mRNA水平的抑制率，表明蛋白水平干扰效应的消逝稍滞后于mRN水平。P探讨近年来，国内外大量探讨表明MYH9(非肌肉肌球蛋白重链IIA)与细胞黏附pp,pp、细胞迁移pp、肿掩转移p,P、动脉粥样硬化由4、血小板黏附、血栓形成4等有着亲密关系。例如：HUang等发觉MYH9可将病理状态下血管内皮细胞中的核仁素迁移到细胞表面，有助于核仁素在内皮迁移和血管新生中发挥作用pcKohlstedt等发觉MYII9能结合血管惊慌素转移酶（ACE）,并影响其磷酸化，从而调整血管收缩与舒张5pachet等10发觉MYH9缺陷可引起血小板削减，MYH9在血小板黏附及血栓形成中发挥着重要作用4»此外，Rho激的介导的心血管疾病经常与MYH9磷酸化相关p5,MYH9还介导细胞内的信号转导等等p6,但许多机制尚未完全闸明。因此，剔除或降低其内源性表达，对进一步深化探讨MYH9的功能具有重要意义。图pppCsipMYH9pppppp及比照质粒转染HUVEC细胞后RRpRCR检测（略）FigpDeterminationofMYH9mRNAexpressionbySemipquantitativeRRpRCRinHUVECcellstransfectedwithRNAiPIanIidSandtheircontrolplasmidsa,b:p4haftertransfection：c,d:48haftertransfection;e,f:7phaftertransfection,b,d,f:DataareshownasmeansSF）forthreeseparateexperiments.*Rlt：0.Opsignificantlydifferentfromthenegativecontrolgroup.C:Fromcellsuntransfected:N:FromcelIstransfectedwithnegativecontrolplasmidppCsi.U6pneoppFRpN0N;Mp,Mp,Mp:FromcellstransfectedwithppCsipMYH9pp,ppCsipMYH9pp,ppCsipMYH9pp,respectively;R:FromcellstransfectedwithpositivecontrolplasmidpARDHphomo(HppneoppR).11图4ppCsipMYH9pppppp转染HUVEC细胞后的WeSternblot分析(略)Fig4DeterminationofMYH9expressioninHUVECcellstransfectedwithRNAiplasmidsusingWesternblota:p4haftertransfection：b:48haftertransfection：c:7phaftertransfection,d:DataareshownasmcansSDforthreeseparateexperiments.*Rlt;0.05,*Rlt;0.OpsignificantlydifferentfromtheMpgroup.Mp,Mp,Mp:fromcellstransfectedwithppCsipMYH9pp,ppCsipMYH9pp,ppCsipMYH9pp,respectively.RNAi是指在生物体内，外源性或内源性的双链RNA引起与其同源的mRN特异性降解，导致转录后阶段的基因缄默。由于RNAi技术具有高效、特异、简洁易行、资金消耗少等优点，已经被广泛应用于蛋白功能的探讨6-8。利用RNAi技术抑制MYH9基因表达虽有个别文献报道p,但未见具体的抑制内皮细胞MYH9表达的干扰质粒载体的具体序列信息以及最佳转染时间等报道。在本探讨中,我们构建了p种针对MYH9基因的siRNA表达体系，视察其特异性抑制HUVEC细胞内源目的基因MYH9的作用，结果表明转染12后p4h.p号、P号干扰质粒均表现出对MYH9表达肯定的抑制作用。随后转染效率渐渐增加，在转染后48h达到峰值，其中重组质粒ppCsipMYH9pp干扰效果最强,mRN转录水平及蛋白水平抑制率分别为86.5%和7p.p%,但随后干扰作用渐渐降低，在转染后7ph,mRNA转录水平的干扰作用消逝，但ppCsipMYH9pp在蛋白水平的干扰作用仍旧有p%,表明蛋白水平干扰效应的表现稍滞后于mRNA水平，提示在后续利用重组质粒ppCsipMYH9pp寂静MYH9基因，探讨MYH9在相关疾病中的功能时，应当选用在干扰作用最强的48h左右进行探讨。综上所述，本探讨胜利构建并筛选出了最佳干扰质粒ppCsipMYH9pp,可明显抑制HUVEC细胞中MYH9表达，为进一步探讨MYH9在血管内皮活化中的作用以及在心血管、肿瘤等相关疾病中的功能奠定了基础。【参考文献】pStraightF,Cheung,1.imouzeJ,etal.Dissectingtemporalandspatialcontrolofcytokinesiswithamyosin11InhibitorJ.Science,pp,p99(56pp):p74p-p747.pHuangYJ,ShiHB,ZhouH,etal.Rhe13angiogenicfunctionofnucleolinismediatedbyvasculare11dothelialgrowthfactorandnonmuscle11ysionJ.Blood,p006,p07(9):p564p57p.pObunguVH,BurnsA1.,AgarwallSK,etal.Me11in,atumorsuppressor,associateswithnonmusclemyosinHpAheavychainJ.Oncogene,pp,pp(4p):6p476p58.41.onC,EcklyA,HechlerB,etal.MegakaryocyteprestrictedMYH9inactivationdramaticallyaffectshemostasiswhilepreservingplateletaggregationandsecretionj.Blood,p007,pp(9):pp8p-pp9p.5KohlstedtK,KellnerR,BusseR,etal.Signalingviatheangiote11sinpconvertingenzymeresultsinthephosphorylationofthenonmusclemyosinheavychainIJ.MolRharmacol,p006,69(p):p9-p6.6闫歌，蒲丹，唐霓，等.RNA干扰技术对肝癌细胞内源Survivin基因表达的影晌J.生物化学与生14物物理进展，pOO4,pp(9):8p9-8pp.7吴元明，张晓楠，韩者艺，等.ShRNA表达载体pWHp的构建及用于HIFpp基因的缄默J.细胞与分子免疫学杂志，p008,p4(p):pp5-pp8.8杜昱蕾，尹芳，杨桂涛，等.MADpRA干扰载体的构建及其对胃癌细胞生长的影响J.细胞与分子免疫学杂志，p006.pp(p):p90-p9p.9黄晓园，李科珍，庄亮，等.人脐静脉内皮细胞的分别培育及条件复制性腺病毒Adv5pdEppschkp对该细胞的杀伤作用J.癌症，p007,p6(9):977-98p.pZhuH,CaiC,ChenJ.SuppressionofRpglycoproteingeneexpressioninHs578RpDoxbytheoverexpressionofcaveolinppJ.FEBS1.ett,p004,576(p):p69-p74.ppShewanM,MaddugodaM,Kraemer,etal.MyosinpisakeyRhokinasetargetnecessaryforthelocalconcentrationofEpcadherinatcelIpcell15contactsJ.MolBiolCell,p005,p6(p):45pp-454p.ppContiMA,EvenpRamS,1.iuC.DefectsincelladhesionandthevisceralendodermfollowingablationofnonmusclemyosinheavychainIIpinmiceJ.JBiolChem,p004,p79(40):4pp6p-4pp66.ppJacobcl1iJ,ChmuraSA,BuxtonDB,etal.singleclassIImyosinmodulatesRcellmotilityandstopping,butnotsynapseformationJ.NatImmunol,p004,5(5):5pp-5p8.p4NikolaS,MurakamicN,RickeringaJp,etal.Differentialexpressionofnonmusclemyosi11IIisoformsinhumanatheroscleroticplaqueJ.Atherosclerosis,p997,pp(p):7p-85.p5Fan1.,SebeA,RterfiZ,etal.Cel1Contactpdependentregulationofepithe!IalpmyofibroblasttransitionviatheRhopRhokinasepphosphopmyosinpathwayJ.MolBiolCel1,p007,p8(p):p08p-p097.16p6poeckelerZM,WysolmcrskiRB.Myosinphosphataseandcofi1inmediateCAMRPRKApinduceddeclineinendothelialcel1isometrictensionandmyosinIIR1.CphosphorylationJ.JBiolChem1p005,p80(p8):pp08p-pp095.