RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链ⅡA（MYH9）表达的研究_0.docx

RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链11A（MYH9）表达的探讨RNA干扰技术抑制人内皮细胞非肌肉肌球蛋白重链HA（MYH9）表达的探讨（作者：单位：邮编：）作者：黄娅琳，寇俊萍，宋佳希，余伯阳【摘要】目的：构建人MYH9（非肌肉肌球蛋白重链HA）的SiRNA表达体系，抑制原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）MYI19基因的表达。方法：针对人MYH9基因序列，构建siRNA表达质粒，通过所切和测序鉴定确定其序列正确性。分别转染重组质粒PGCSiMYH91/2/3至HIWEC细胞，通过半定量RTPCR和蛋白质卬迹，分别检测在转染后24h、48h、72hMYH9在mRN转录水平及蛋白表达的改变。结果：在构建的3种重组质粒中,pGCsiMYH92.pGCsiMYU93在转染后24h均衣现出肯定的干扰作用，转染后48h干扰作用最强，转染后72h干扰作用减弱；PGCSiMYH93的干扰作用最明显，转染后48h,能明显下调HUVEC的MYU9蛋白表达,抑制率平均可达71.2%,此时MYH9基因mRNA转录明显削减，抑制率为86.5%0结论:在转染后48hpGCsiMYH93可明显抑制HUVEC细胞内源MYI19的表达，为进一步探讨MYII9在相关疾病中的功能奠定基础。AIM:ToconstructtheexpressionvectorofsmallhairpinRNA(shRNA)andtoinvestigatcitsefficacyinsilencingnonmusclemyosinheavychainIIA(MYH9)gene.METHODS:AccordingtotheMYH9cDNAsequenceinGcnBank,threeshRNexpressionvectorstargetingMYH9genewereconstructedandwereconirmcdbydigcstionwithrestrictionenzymesandDNAsequencing.TherecombinantplasmidsweretransfectedintoHUVECcells.TheexpressionofMYH9wasdeterminedbySemiquantitativeRTPCRatmRNlevelandbywesternblottingatproteinlevelat24h,48hand72haftertransfection.RESU1.TS:ThedecreaseofMYH9expressionatmRNAandproteinlevelsgraduallybecamemoreevidentfrom24hto48h,andachievedthemaximaldegreeat48h,thenbecameweakenedandrestoredat72h.TheefficiencyofpGCsiMYH93wasthebestamongthesethreeplasmids.TheintroductionofpGCsiMYH93wasshowedtoefficientlyandspecificalIyinhibittheexpressionofMYH9withinhibitoryrateat71.2%accordingtoresultsofWesternblot.RTPCRresultsshowedthatmRNAtranscriptionofMYH9genewasreducedby86.5%at48hafterintroductionofpGCsiMYH93.CONC1.USION:PlasmidpGCsiMYH93couldinhibitMYH9expressioninHUVECcelIssuccessfulIyandeffectively,whichpromiseditsfurtherapplicationinrelatedfunctionanalysisofMYH9.【关键词】RNA干扰；人脐静脉内皮细胞(HUVEO;非肌肉肌球蛋白重链HA(MYH9)非肌肉肌球蛋白重链IIA(nonmusclemyosinheavychainII,NMHCIIrMYH9)是一种由人第22号染色体上的MYH9基因编码的蛋白，它广泛分布于血管内皮细胞、巨噬细胞、T细胞、中性粒细胞等多种细胞，与胞质分裂1、肿瘤转移2,3、血小板活化和血栓形成4、血管收缩5等亲密相关。同时，血管内皮细胞在上述生理病理过程中发挥重要作用，但有关MYH9在血管内皮活化中的作用，尚未得到有效阐明。而利用RNAT扰(RNAi)技术可以较简洁地制备特定基因缺失表型的个体，表达shRN片段的RNAi载体可以在体内外特异性高效抑制相关基因，便利快捷地探讨该基因的功能6-8.因此，木探讨旨在构建针对人MYH9基因的shRN表达载体,筛选出抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEOMYH9表达的最佳转染质粒和最佳转染时间，为进一步探讨MYH9的功能供应技术手段，为深化阐释MYH9在血管内皮细胞活化相关的心脑血管疾病、肿瘤转移等重大疾病中的作用奠定基础。1材料和方法1.1材料M199培育基、胎牛血清、TRIzoIx反转录试剂盒均购HGibco公司。PGCsilencerTMU6neoGFPRNAi表达质粒载体、阴性比照质粒PGCSi.U6neoGFPNON、阳性比照质粒GAPDHhomo(HlneoGFP)均购于上海吉凯生物技术公shRN插入模板寡核苛酸由TaKaRa公司合成。限制性内切筋、连接酶、DNAMarker、PCR相关试剂均购自TaKaRa公司。脂质体1.ipofectamineTM2000、DNA片段纯化试剂盒、Optimemi培育基、质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自Invitrogen公司。内皮细胞生长因子（ECGS）.兔抗人MYH9多抗购自Sigma公司，其余抗体均购闩博士德公司。BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天公司。EC1.试剂盒购自Pierce公司。1.2方法1.2.1MYH9ShRNA表达质粒的构建针对GenBank中MYH9基因的已知序列（NM_002473）,选择特异性ShRNA靶位点序列，分别设计并合成3条ShRNA插入模板寡核甘酸（表1）,退火后形成双链的ShRNA插入模板宾核甘酸。分别将这3条ShRNA寡核甘酸克隆到PGCsilencerTMU6neoGFPRNi表达载体，构建成干扰质粒PGCSivYH91、pGCsiMYH92、PGCSjVYH93,分别转化大肠杆菌DH5,用质粒小量抽提试剂盒抽提、纯化，并用BamH、HindIII双酶切、测序鉴定。表1MYH9基因的shRN序列信息（略）TabISequencesofshRNAofMYH9gene1.2.2人脐静脉内皮细胞的分别、鉴定参照文献9方法，分别人脐静脉内皮细胞，以添加200ml1.胎牛血清，40U/m1.肝素,100U/m1.青霉素，100mg/1.链毒素及ECGS的M199培育基，37,C.50m1./1.CO2细胞培育箱中进行培育。并根据试剂盒说明书的步骤，采纳皿因子免疫荧光染色、显色，置荧光显微镜下视察鉴定。1.2.3 干扰质粒及比照质粒的细胞转染将第2代HUVEC细胞按3105个/孔接种于6孔细胞培育板中，当细胞80%融合时，参照1.ipofectamine2000转染试剂说明书,按1：2(g/1.)比例,分别转染质粒PGCSiMYH91、PGCSiMYH92、pGCsiMYH93以及阴性比照质粒pGCsi.U6neoGFPNoN和干扰GAPDH表达的阳性比照质粒GAPDHhomo(HlneoGFP),37C孵育67h后弃去培育基，用PBS洗涤细胞后，加入含血清和抗生素的M199培育液接着培育。1.2.4 RTPCR检测转染细胞中MYH9111RNA表达转染后24Ik48h、72h,分别提取细胞RNA,并用OIigo(dT)反转录得cDNA0利用MYH9和ACtin特异引物(表2)扩增cDN条带，PCR条件：94C变性30s,55C退火45s,72C延长45s,共30个循环。扩增产物用10g/1.琼脂糖凝胶电泳分析，并利用GENEGENUS凝胶成像分析系统进行光密度扫描，比较转染不同质粒的细胞的VYH9基因在mRNA水平上的表达差异。表2RTPCR引物序列(略)Tab2SequencesofprimersforRTPCR1.2.5Westernblot检测转染细胞中MYH9蛋白表达转染后24h、48h、72h收集细胞，裂解，用BCA法蛋白定量后进行蛋白印迹试验10,取80g蛋白，经100g/1.聚丙烯酰胺凝胶电泳分别后，电转移至PVDF膜上，转膜条件：MYH9（100V恒压转膜7080min）;Actin（100V恒压转膜50min）o封闭液封闭后，分别用MYH9和Actin一抗4C孵育过夜后，相应二抗孵育2h,再用EC1.试剂盒检测。1.2.6统计学分析试验结果采纳SAS8.0软件进行统计学分析，用方差分析各试验组之间的差别。2结果2.1MYH9基因ShRNA表达质粒的鉴定重组后的pGCsiMYH9表达质粒同时具有限制性核酸内切酶BanlHI、Hindnl的酶切位点，用BamHI、Hindln双触切后，电泳显现约1.8kb和4.6kb的2条带（图1）,与试验设计的模板募核甘酸长度相符。质粒用针对插入片段的特异性引物进行PCR扩增，并测定PCR产物的DW序列，测序结果（未附）与试验设计的模板寡核昔酸序列相符，表明MYH9基因ShRNA表达质粒构建胜利。而未重组比照质粒由于只含有BamHl单曲切位点，不含IlindIII酶切位点,经BamHI、HindIII双酶切后，仅被BamIII切成线性（图1）。图1MYH9shRN表达质粒的酶切鉴定（略）Fig1AGEanalysisofrecombinantplasmidpGCsiMYH9digestedwithBamIlIandHindIHM:D1.2000DNmarker;1:MYH9shRNexpressionplasmid;2:MYH9shRNAexpressionplasmiddigestedbyBamHIandHindIII：3:UnrecombinantcontrolplasmiddigestedbyBamHIandHind111.2.2干扰质粒及比照质粒的转染效率初步检测由于所用的表达质粒带有绿色荧光蛋白（GFP）基因，因此在检测转染细胞MYU9基因mRNA及蛋白表达水平之前,利用荧光显微镜视察各转染组的转染效率（以未转染细胞组为比照），有绿色荧光蛋臼表达的细胞阳性率可达80%,表明干扰及比照质粒可大量有效地进入HUVEC细胞（图2）。图2重组质粒转染HUVEC细胞后48h的荧光显微镜视察（略）Fig2ObservationofHUVECcellstransfectedwithrecombinationplasmidbyfluorescencemicroscope（48haftertransfection,200）2.3转染细胞中MYH9基因mRNA表达水平的检测以Actin为内参，半定量RTPCR扩增出MYH9基因特异条带（图3）光密度扫描结果表明，阴性比照质粒pGCsi.U6neoGFPN0N.阳性对照质粒GPDHhomo（HlneoGFP）、干扰质粒pGCsiMYH91与未转染正常细胞MYH9基因的mRNA表达量之间无统计学意义，说明pGCsiMYH91无效。而在转染后24h、48h,PGCSiMYH92、pGCsiMYH93对MYH9mRN表达均有肯定的抑制作用,其中pGCsiMYH93在48h时作用最强。与阴性比照质粒pGCsi.U6neoGEPN0N转染细胞相比，转染后48hpGCsiMYH93对MYH9基因mRNA表达的抑制率平均可达86.5%转染后72h,MYH9基因mRNA表达，与正常细胞的MYH9基因表达量之间无统计学意义。2.4MYH9基因蛋臼表达水平的检测图4为蛋白印迹结果。光密度扫描结果表明，阴性比照质粒pGCsi.U6neoGFPNON.阳性对照质粒GAPDHZhomo(Hl/neo/GFP)、干扰质粒pGCsiMYH91与未转染正常细胞的MYH9表达量之间无统计学意义。而干扰质粒pGCsiMYH92和pGCsiMYH93在24h和48h时均对MYH9表达有一定的干扰作用，其中pGCsiMYH93在48h时干扰作用最强，对MYH9表达的抑制率平均值可达71.2%,与半定量RTPCR所得的结论类似。转染后72h,pGCsiMYH93对MYH9表达的抑制率降为20%,仍高于转染后72h的mRNA水平的抑制率,表明蛋白水平干扰效应的消逝稍滞后于mRN水平。3探讨近年来，国内外大量探讨表明MYH9(非肌肉肌球蛋白重链IIA)与细胞黏附11,12、细胞迁移13、肿瘤转移2,3、动脉粥样硬化14、血小板黏附、血栓形成4等有着亲密关系。例如：Huang等发觉MYH9可将病理状态下血管内皮细胞中的核仁素迁移到细胞表而，有助于核仁素在内皮迁移和血管新生中发挥作用2,Kohlstedt等发觉MYH9能结合血管惊慌素转移醯（ACE）,并影响其磷酸化，从而调整血管收缩与舒张51Gachet等发觉MYH9缺陷可引起血小板削减，MYH9在血小板黏附及血栓形成中发挥着重要作用4。此外，Rho激酶介导的心血管疾病经常与MYH9磷酸化相关15,MYH9还介导细胞内的信号转导等等16,但许多机制尚未完全阐明。因此，剔除或降低其内源性表达，对进一步深化探讨MYH9的功能具有重要意义。图3pGCsiMYH91/2/3及比照质粒转染HUVEC细胞后RTPCR检测（略）Fig3DeterminationofMYH9mRNexpressionbySemiquantitativeRTPCRinHUVECcellstransfectedwithRNiplamidsandtheircontrolplasmidsa,b:24haftertransfection：c,d:48haftertransfection;e,f:72haftertransfection,b,d,f:DataareshownasmeansSDforthreeseparateexperiments.*P0.OlsignificantIydifferentfromthenegativecontrolgroup.C:Fromcellsuntransfected;N:FromcelIstransfectedwithnegativecontrolplasmidpGCsi.U6neo/GFPNON;Ml,M2,M3:FromcellstransfectedwithpGCsiMYH91,pGCsiMYH92,pGCsiMYH93,respectively;P:FromcellstransfectedwithpositivecontrolplasmidGAPDH/homo(Hl/neo/GFP).图4pGCsiMYH91/2/3转染HUVEC细胞后的Westernblot分析(略)Fig4DeterminationofMYH9expressioninHUVECcellstransfectedwithRNAiplasmidsusingWesternblota:24haftertransfection;b:48haftertransfection;c:72haftertransfection,d:DataareshownasmeansSDforthreeseparateexperiments.*P0.05,*P0.01significantlydifferentfromtheMlgroup.Ml,M2,M3:fromcellstransfectedwithpGCsiMYH91,pGCsiMYH92,pGCsiMYH93,respectively.RNAi是指在生物体内，外源性或内源性的双链RNA引起与其同源的mRN特异性降解，导致转录后阶段的基因缄默。由于RYAi技术具有高效、特异、简洁易行、资金消耗少等优点，已经被广泛应用于蛋白功能的探讨6-8利用RNAi技术抑制MYH9基因表达虽有个别文献报道2,但未见具体的抑制内皮细胞MYH9表达的干扰质粒载体的具体序列信息以及最佳转染时间等报道。在本探讨中,我们构建了3种针对MYH9基因的SiRNA表达体系,视察其特异性抑制HUVEC细胞内源目的基因MYH9的作用,结果表明转染后24h,2号、3号干扰质粒均表现出对MYH9表达肯定的抑制作用。陨后转染效率渐渐增加，在转染后48h达到峰值，其中重组质粒pGCsiMYH93干扰效果最强，mRN转录水平及蛋白水平抑制率分别为86.5与和71.2%,但随后干扰作用渐渐降低，在转染后72h,mRN转录水平的干扰作用消逝，但pGCsiMYH93在蛋白水平的干扰作用仍旧有20%,表明蛋白水平干扰效应的表现梢滞后于11RNA水平，提示在后续利用重组质粒pGCsiMYH93寂静MYH9基因，探讨MYH9在相关疾病中的功能时，应当选用在干扰作用最强的48h左右进行探讨。综上所述，本探讨胜利构建并筛选出了最佳干扰质粒PGCSiMYH93,可明显抑制HUVEC细胞中MYH9表达，为进一步探讨MYH9在血管内皮活化中的作用以及在心血管、肿瘤等相关疾病中的功能更定了基础。【参考文献】1StraightAF,CheungA,1.imouzeJ,etal.DissectingtemporalandspatialcontrolofcytokinesiswithamyosinIIInhibitorJ.Science,2003,299(5613):1743-1747.2HuangYJ,ShiHB,ZhouH,etal.TheangiogenicfunctionofnucleolinismediatedbyvascularendothelialgrowthfactorandnonmusclemysionJ.Blood,2006,107(9):3564-3571.3ObunguVH1Burns1.,AgarwallSK,etal.Menin,atumorsuppressor,associateswithnonmusclemyosin11AheavychainJ.Oncogene,2003,22(41):6347-6358.4 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