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RNA结合蛋白Sam68mRNA在原发性肝癌中表达及意义1 RNA结合蛋白Sam68mRNA在原发性肝癌中表达及意义RNA结合蛋白Sam68InRNA在原发性肝癌中表达及意义作者：马高祥傅利锋王涌吴育连【摘要】目的探讨RM结合蛋白Sam68mRNA在人原发性肝癌组织中的表达及意义。方法选取20例原发性肝癌的肿瘤组织及相应癌旁组织，采纳TRIzol一步法提取总RNA,采纳RT-PCR法检测San68mRNA在肝癌组织及相应癌旁组织中的表达。结果PCR产物电泳显示肝癌组织中Sam68mRN平均表达强度为60.71%9.26%,相应癌旁组织中Sam68mRNA平均表达强度为76.98%11.61%,经配对t检验，P<0.05,具有统计学差异。结论与相应癌旁组织相比，人原发性肝癌组织中Sam68mKNA的表达明显降低，提示在人原发性肝癌组织中San68的表达在转录水平受到明显抑制。【关键词】肝癌RNA结合蛋白聚合酶链反应AbstractObjectiveTodiscusstheexpressionofsam68inprimaryKeptocarcinomaantitssignificance.Methods20casesoftumortissuesandcorrespondingnear-tumortissuesofhumanprimaryhepatocellularcarcinomawerecollected.TotalRNAwasextractedfromspecimensusingTKlzolone-stepmethod,2theexpressionlevelofsam68inbothoftumortissuesandcorrespondingnear-tumortissueswereobservedwithreversetranctiption-po1ymerasechainreaction(RT-PCR).ResultsExaminedbyultravioletspectrophotometer,themeanexpressionlevelofsam68was60.71%9.26%intumortissues,and76.98%11.61%innear-tumortissues.Bymatchdatatest,P<0.05,indicatedthedifferencehadstatisticsignificance.ConclusionComparingtorespondingnear-tumortissues,theamountsofsam68mRNexpressionwerelowerinhumanprimaryhepatocelIularcareinoma.11showsthattheexpressionofRNbindingproteinsam68isinhibitedattranscriptionlevelinhumanhepatocellularcarcinoma.KeywordhepatocellularcarcinomaRNbindingproteinpolymerasechainreaction(PCR)Sam68是STAR蛋白家族的代表成员之一，目前关于Sam68的报道仅限于国外探讨，且大多以序列结构分析及相关配体检测为主，而Sam68与各种恶性肿瘤的相关性探讨较少，在原发性肝癌中的表达状况国内外少见正式报道。本探讨通过半定量RT-PCR技术，首次明确了RNA结合蛋白Sam68mRNA在人原发性肝癌中的表达状况，为进一步研3究STAR蛋白在肿瘤形成和发展过程中的作用机制供应了肯定的理论基础。1材料和方法1.I材料20例原发性肝癌的肿瘤组织及相应癌旁组织取自浙江高校医学院附属二院病理科簇新冰冻标本,主要试剂TRIZo1.（Invitrogen公司）本1.V（逆转录酶）和TaqDNApolymerase（PromCga公司）dNTP（上海博亚生物技术公司），DEPC（GIBCO公司）AgarOSe（MRESCO公司）DNAMarkerDI1.2000（Takara公司）乙醉、氯彷、异丙醉、滨化乙锭及其他试剂均为国产或进口纯试剂。1.2方法（1）细胞总RNA提取（RNACXtraClion）取20例原发性肝癌的肿瘤组织及相应癌旁组织分成20对样本，碾磨成粉,采纳TRIzol一步法提取总RNA,（2）RNA质量检测取RNA21,加981DEPC水,混匀,紫外分光光度仪比色测OD值，计算A260/280比值,以及所抽提的总RNA浓度RT-PCR法检测Sam68的表达参照国外文献1设计Sam68及-actin引物各一对，（引物序列见表1,由上海生工生物技术工程服务有限公司合成。）PCR扩增产物片段分别为Sam68530bp,-actin300bpo4取各样本组RNA行常规RT-PCR扩增，RT参数设置根据说明书，PCR参数设置如下：94°C预变性5min；94°C变性30s,55退火45s,70C延长lmin,Sam68和-HClin分管扩增，均为35循环；再72'C最终延长10min,PCR产物4匕保存并测序（交由生物公司代为测序）.取IOIPCR扩增产物，以1.8%琼脂糖凝胶电泳，图像扫描保存,用Band1.eader（Ver3.00）电泳图像分析软件,对电泳条带的光密度进行分析，以CR-actin的光密度比值作为相对定量，表示Sam68mRN的表达强度。表1PCR引物序列（略）1.3统计学分析每个样本重复3次PCR,取Sam68-actin的光密度比值的均值为统计数据。以SPSS11.5统计学软件进行分析，采纳配对资料t检验。Plt;O.05为差异有显著性意义。2结果对总RNA用紫外分光光度计进行检测，260280>1.8,证明提取的总RNA纯度较高，无蛋白质污染。经DNA测序，PCR产物序列与Sam68基因序列完全吻合，证明为Sam68基因扩增产物。PCR产物电泳显示（见图2,图3）本组20例，除2例呈阴性外，其余18例肝癌及相应癌旁组织均检出Sam68mRN表5达。其中，肝癌组织中Sam68mRNA平均表达强度为60.71%9.26%,相应癌旁组织中Sam68mRN平均表达强度为76.98%I1.61%,经配对t检验，PVO.05,具有统计学差异。3探讨Sam68作为STAR蛋白家族的代表成员之一，是20世纪末新发觉的一种RNA结合蛋白。Courtneidge和shalIoway通过探讨发觉该RNA结合蛋白的分子量是68Kda,在有丝分裂过程中是Src的底物，因此将其命名为Sam682,3oSam68主要定位于核内4,最新探讨显示，Sam68与肿瘤形成亲密相关。1.iU等57通过随机纯合子敲除法，用逆转录病毒为介导将反义RNA导入鼠纤维母细胞系NIH3T3,产生一种染色体基因失活的特别表型。检测显示，该特别表型的NlH3T3细胞所表达的Sam68水平不到野生型的25%,同时这些细胞的软琼脂集落形成率大大增加，表现出非锚者依靠性生长，缺乏细胞接触抑制，并能够在裸鼠中形成转移性肿瘤。若将Sam68表达水平从25%人为提高到野生型的50%左右，可逆转部分细胞的肿瘤化生长状态，但这种逆转是不彻底的。上述探讨提示Sam68可能是一种肿瘤抑制剂。本探讨采纳半定量RT-PCR技术，首次对人原发性肝癌及相应癌旁组织中Sam68mRN的表达状况进行了检测。结果6显示,肝癌组织中Sam68mRNA平均表达强度为(60.71%9.26)%,相应癌旁组织中Sam68mRN平均表达强度为(76.98%11.61)%,经配对t检验，两组差别有统计学意义。从而表明与相应癌旁组织相比，人原发性肝癌组织中Sam68mRN的表达明显降低，提示在人原发性肝癌组织中Sam68的表达在转录水平受到明显抑制。这一结果与国外探讨一样57值得一提的是，木组中有2例样本，无论是肝癌组织还是相应癌旁组织，均未检测到Sam68mRNA的表达，推想膈旁组织可能存在Sam68基因缺失突变，或处于癌前期病变(2例均存在明显肝硬化),Sam68mRNA表达已经明显受抑，因样本量较少，无法得出结论。尽管有探讨表明Sam68在细胞增殖，分化和肿痛形成过程中发挥重要作用，但准确的生物学机制尚不清晰，其在肿痛发生发展过程中究竟扮演何种角色等问题，均有待于进一步的深化探讨。与相应癌旁组织相比，人原发性肝膈组织中Sam68mR"的表达明显降低，提示在人原发性肝癌组织中Sam68的表达在转录水平受到明显抑制。【参考文献】IJKool,VW,ZanneC.Terleth.Down-regulationofT-STAR1agrowthinhibitoryprotein,afterSV40mediatedimmortaIization.CellGrowthDiffer,72001,12:535541.2MFMoran,CAKoch,DAnderson,etal.Srchomologyregion2domainsdirectprotein-proteininteractionsinsignaltransduction.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.,1990,87:862286263SFumagalli,NFTotty,JJHsuan,etal.AtargetforSrcinmitosis.Nature,1994,368:871874.4Weng,SMThomas,RJRickles,etal.IdentificationofSrc,Fyn,and1.ynSH3-bindingproteins:impicationsforafunctionofSH3domains.Mol.Cell.Biol,1994,14:45094521.5C.Y.1.iu,A.Flesken-Nikitin,S.1.i,etal.InactivationofthemouseBrcalgeneleadstofailureinthemorphogenesisoftheeggcylinderinearlypostimpIantationdevelopment.GenesF)ev,1996,10:18351843.6K1.iu,1.1.i,PENisson,etal.Ncoplastic8IransfornRitionandtumorigenesisassociatedwithsam68proteindeficiencyinculturedmurinefibroblasts.J.Biol.Chem,2000,275:4019540201.7Q1.iu,UFischer,FWang,etal.Thespinalmuscularatrophygeneproduct,SMN,anditsassociatedproteinSIPlareinacomp1exwithSpliceosomalsnRNPproteins.Cell,1997,90:10131021