RNA质量控制.docx
RNA质量限制1 .相关概念RNA质检参数OD260/OD280、OD260/OD230的意义.260、280、320、23Onm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。A23O:测定其它碳源物质，如酚，糖类等.A26()：核酸的汲取峰测，测RN,DNA,引物等的浓度用的.A280：蛋白质的汲取峰.一般的，我们只看OD26O,0D28O(Ratio,R)在1.8-2.1范围内时，我们认为RNA中蛋白的污染是可以容忍的，不过要留意，当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2(一般应当是<2.2的)。当R<1.8时，溶液中蛋白的污染比较明显，可以依据自己的须要确定这份RNA的命运.当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。纯RNA的OD260/OD280的比值为2.0.2 .RNA质检嘛RNA样品的品质检测一般分为总番,纯度与完整性三大项.总量：微量分光光度计测260n11汲取值计算.纯度：微Ja分光光度计测260n1n,230nn1汲取值的比值，用于评估有机溶剂残留；26Onm/28Onm汲取值的比值，用于评估蛋白质污染比例.完整性：以gilentBioanalyzer进行毛细管电泳(CaPilIaryelectrophoresis),并以软件的R1N(RNAIntegrityNUmbCr)分数评估，IO为RNA完整性最好，0为最差.2.1 RNA纯度RNA在纯化过程中简单受到DNA,蛋白质及有机溶剂的影响，这些残存物将会影响以后的操作。光港分析(NANODRoP)利用物质对不同波长光的汲取度的不同，可以鉴别出溶液纯度及浓度.RNA溶液的A26()A280的比值是一种RNA纯度检测方法,比值范围一般为1.8-2.Ie各项试验对RNA纯度要求不一，比如即使比值超出这个范围，RNA样品也一样可以用于一些一股试验中，如Northern杂交、RT-PCR,荧光定量PCR和RNA醐爱护等试验.RNAPuritytest:1. proteincontaminationOD260OD280ratio:1.8-2.1recommended2. OrganicsolventConlamination:OD26()OD230ratio:>1.8recommendedOD26(),'OD27()ratio:>1.2recommended2.2 RNA完整性除纯度以外，RNA的完整性也特别重要.自然界无所不在的RNasc使RNA保存相当不易.由于RNaSe广泛存在而稳定，一般反应不须要协助因子.因而RNA制剂中只要存在少量的RNasc就会引起RNA在制备与分析过程中的降解。I)电泳法2)流式芯片(2100Bioanalyzer)电泳显示有无基因组DNA污染，有无RNA降解（28SJ8S条带）；通过目测28S和I8S条带的比例可以初步评价总RNA的质量。一般认为28SJ8S>=2可以初步判定总RNA完整性较好.跑电泳，RNA应出现清晰的两条Band（28S/18SrRNA）,有时会有第三条band（5SrRNA）,最上方不行出现DNA污染条带，28S/18S应近似两倍.28S和ISS核糖体RN条带特别亮而浓（其大小确定于用于抽提RNA的物种类型），在加样孔位于图片上方的看图模式下，上面一条带（28S）的密度大约是下面一条带（18S）的2倍.下方还有可能视察到一个更小略微扩散的带，它由低分子量的RNA（IRNA和5S核糖体RNA等）组成。在28S和I8S核糖体带之间一般可以看到J-片弥散的EB染色物质，可能是由11RNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中假如出现DNA污染将会在28S核糖体带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，此时最好须要对总RNA进行纯化。RNA的降解则表现为核糖体RNA带的弥散.上述方法可以清晰分析RNA的完整性，但需样本量过多.流式技术需求量降到25ng,除28S,I8S外不应当有其他峰值，28S/I8S应当在1.8-2.1之间。IntegritylestbyelectrophoresisEleclrophoresisgelof!heRNsamplePlC"cpasteyourUHiVWlgCherePleaseretcrtoheIInaVCat(herighttortllayoutofthegelUnellbpl)Nh<kkrIar¼c2:accepiublequhyIanCR:lwahdegradedtotalRIanc4:slightlydegradedandDNA-co11Ummatcdmpklane5：IKbDNAladder28S3.样例结果3.1表格结果编号SanpleIDConc<ugul)260/280260/230总量(Ug)质检结果1假10.11552.122.2511.55合格2假20.14882.142.1114.88合格3假30.12382.06212.38合格4中剂量10.07022.081.67.02合格5中剂量20.09292.091.949.29合格6中剂量30.14312.152.1614.31合格7模型20.08612.021.88.61合格8模型30.0972.092.039.7合格9模型40.10872.081.8910.87合格3.2电泳检测试验4.UR1.:/openwetware.org/wtki/RNA-QualiIyeControI
