人腺相关病毒AAVELISA试剂盒.docx
人腺相关病毒(AAv)EuS试剂盒试验原理：AAV试剂盒是固相夹心法能联免疫吸附实验(E1.ISA).已知AAV浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔陶标板内进行检测。先辂AAV和生物素标记的抗体同时温有。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP,再经过温白和洗涤，去除未结合的陶结合物,然后加入底物A.B1和酶结合物同时作用-产生颜色.颜色的深浅和样品中AAV的活性左度呈比例关系。试剂盒内容及其配制试剂盒成份(2-8C°保存)96孔配置48孔配置配制96/48份施标板1块板(96T)半块板(48T)即用型塑料膜板苣1块半块即用型标准品：400ngml1瓶(0.6ml)1瓶(0.3ml)按说明书进行稀稀空白对照1瓶(1.Oml)1瓶(05m)即用型标准品稀释缓冲液1瓶(5ml)1瓶(2.5ml)即用型生物素标记的AAV抗体1瓶(6ml)1瓶(3.0ml)即用型亲和链Sft襄-HRP1瓶(IOmI)1瓶(5.0ml)即用型洗涤缓冲液1瓶(20ml)底物A1瓶(6.0ml)底物B1拨(6.0ml)终止液1座(6.0ml)1瓶(IOmI)按说明书进行稀释1瓶(3.0ml)即用型1瓶(3.0ml)即用型1瓶(3.0ml)即用型自备材料1蒸慵水，2.力口样器：Bu1.IOu1.50u1.100u1.200,500ul、100OuU3.振荡器及磁力搅拌器等。安全性1 避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，话尽快用水冲洗，2 .实脸中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。3不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。人腺相关病苒(AAV)EUS试剂盒操作注意事项1.试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到空温.稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。2实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存.以免变质.3不用的其它试剂应包装好或差好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。4.使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样品.5使用干净的塑料容器配置洗涤液.使用前充分混匀试剂盆里的各种成份及样品6洗漆的标板时应充分拍干.不要将吸水纸直接放入酹标反应孔中吸水。7.底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感.避免长时间暴用于光下。避免用手接触，有毒,实脸完成后应立即读取OD值。8加入试用的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样.9按照说明书中标明的时间、加液的及顺序进行温育操作。人腺相关病毒(AAV)EUS试剂盒样品收集、处理及保存方法1、血清一操作过程中避免任何细胞刺激.使用不含热原和内毒素的试管.收集血液后.100Oxg宽心10分钟将血清和红细胞迅速，IV1.地分亲。2、血浆EDTA,柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测：1（XK）Xg离心30分钟去除颗粒:3、细胞上清液-TOOOXg离心10分钟去除厥粒和聚合物，4、保存如果样品不立即使用,应将其分成小部分70b保存.避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒.检测前先要心或过泥，不要在37C。或更高的温度加热解冻：应在室温下解冻并确保样品均匀地充分斛冻。试剂的准备1标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备,不能储存，稀释前将标准品振荡混匀。秫稗比例按下表中进行：40011gml6号标准品）原倍浓度不用林稀直接加入50U1.200ngml5号标准品）100Ul的原倍标准品加入100Ul的标准品稀稀液100ngZmI（4号标准品）100Ul的5号标准品加入100Ul的标准品稀释液50ngml（3号标准品）100uI的4号标准品加入100Ul的标准品稀祥液25ngml（2号标准品）100Ul的3号标准品加入100uI的标准品稀释液12.5ngml（1号标准品）IoelUl的2号标准品加入100Ul的标准品稀释液OngZmI（空白对照）原始浓度不用稀释直接加入503。2.洗渗媛冲液（50K）的稀程：蒸谣水50倍稀释.人腺相关病毒（AAV）E1.lS试剂盒操作步骤1.使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫.以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。2根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数.每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的教员来定.能使用复孔的尽量做复孔。3 .加入稀拜好后的标准品50l于反应孔、加入待测样品503于反应孔内：立即加入50ul的生物妾标记的抗体；盖上腹板，轻轻振孩混匀，37b温自1小时。4 JU去孔内液体.每孔加满洗涤液,振荡30秒,JU去洗涤液.用吸水纸拍干。重赛此操作3次，如果用洗板机洗涤，洗涤次数梏加一次。5 .每孔加入80Ul的亲和链i素-HRP,轻轻振藩混匀.37C。温育30分钟,6 .服去孔内液体,每孔加满洗涤液，振荡30秒,患去洗涤液,用吸水纸拍干。承复此操作3次，如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次.，7街孔加入底物A、B各503,轻轻振荡混匀，37C。温育10分钟。避免光照。8 .取出酶标板.迅速加入503终止液.加入终止液后应立即测定结果：9 ,在450nm波长处测定各孔的OD值.11能1.灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品，稀稀度的线性.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0990。2 .特异性：不与人其它细胞因子反应.3 .重复性板内、板间变异系数均小于1族。4 .局限性：6号标准品以上的结果为非线性的,根据此标准曲线无法得到精确的结果：结果判断与分析1、仪器值：于波长45Onm的陶标仪上读取各孔的OD值2、以吸光度OD值为纵坐标(Y)1相应的AAV标准品浓度为横坐标(X).做得相应的曲线,样品的AAV含可根据其OD值白标准曲线换算出相应的浓度“3、枪测值范困：0-400ngml4、敏感度：!.OngZmI
